Name: a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts
Uploaded: 2018-12-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) verlenen van 254850309. De auteurs bedanken Madlen Luckner voor kritische lezing van het manuscript.

1. monstervoorbereiding: Assay van het mengen van de cel
Opmerking: Het volgende protocol beschrijft de mengen procedure voor Adherente cellen. Het kan worden gewijzigd voor de cellen gekweekt in suspensie.
<ol><li>Zaad van een voldoende aantal cellen in een 6-well-plate, bijvoorbeeld 800.000 HEK 293T cellen (geteld met een Neubauer tellen kamer), een dag voor Transfectie. Het nummer kan worden aangepast afhankelijk van de tijd tussen zaaien en transfectie en aangepast voor andere c...

De experimentele procedure die hier beschreven staat het onderzoek van eiwit-eiwitinteractie trans interacties bij cel contacten, fluorescentie schommelingen spectroscopie technieken, namelijk sFCCS en ccN & B. Deze methodes omvatten een statistische analyse van de schommelingen van de fluorescentie die wordt uitgestoten door twee spectraal gescheiden FPs gesmolten tot de expressie gebrachte eiwitten van belang bij een contact van twee naburige cellen, elk één of de andere fusieproteïne uitdrukken. De aanwezi...

Veel biologische processen zich voordoen op de sites van cel-cel interacties, bijvoorbeeld cel-cel adhesie1,2,3, cel-cel fusion4 en cellulaire erkenning5. Dergelijke gebeurtenissen zijn vooral belangrijk bij de ontwikkeling van meercellige organismen en voor cel-cel communicatie, bijvoorbeeld tijdens de immuunrespons. Deze processen zijn meestal gemedieerd door eiwitten die zijn gelokaliseerd aan het oppervlak, dat wil zeggen, op het plasma-membraan (PM) van naburige cellen en specifieke interacties op de cel-cel-contactpersoon die precies geregeld in ruimte en tijd te ondergaan. In veel gevallen deze interacties zijn directe homo- of heterotypic eiwit-eiwitinteractie trans interacties, maar mogelijk ook ionen of liganden hoedanigheid van extracellulaire linkers1. Hoewel het van fundamenteel belang, is er een gebrek assays indringende deze specifieke eiwit-eiwitinteractie rechtstreeks in de eigen omgeving van levende cellen. Veel methoden vereisen of verstoring van de cel (bijvoorbeeld biochemische tests zoals co-immunoprecipitation6), fixatie (bijvoorbeeld aantal super resolutie optische microscopie technieken en elektronenmicroscopie van cel-cel contact op met7), of zijn niet-specifieke, bijvoorbeeld aggregatie / hechting testen8,9. Om dit probleem te overwinnen, zijn fluorescentie technieken doorgevoerd op basis van fluorescentie resonance energy transfer (FRET)10 of fluorescentie complementatie11. Deze methoden vereisen echter om voldoende kleine afstanden tussen fluorophores, fluorescerende etiketten aan de extracellulaire kant van de eiwitten10, mogelijk verstoren trans interacties.
Hier presenteren we een alternatieve fluorescentie gebaseerde assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten. Deze aanpak combineert fluorescentie cross-correlatie benaderingen (scannen fluorescentie cross-correlatie spectroscopie (sFCCS), cross-correlatie nummer en helderheid (ccN & B)) en het mengen van cellen uiten van een constructie van de fusie voor het eiwit van belang, bijvoorbeeld een hechting-receptor. De onderzochte receptoren in de twee interagerende cellen worden aangeduid met twee spectraal gescheiden fluorescente proteïnen (FPs), van de intracellulaire kant (Zie figuur 1A).
De werknemer methoden zijn gebaseerd op de statistische analyse van de fluorescentie schommelingen veroorzaakt door de diffusive motie van fluorescerende fusion eiwitten door het focal volume van een confocale laser scanning microscoop. Meer in detail sondes de bepaling de co verspreiding van de proteïnen van belang in beide naburige PMs op cel contacten. Als de eiwitten ondergaan trans interacties, zal deze trans -complexen fluorescente proteïnen uitstoten in beide spectrale kanalen, waardoor gecorreleerde fluorescentie schommelingen van beide vervuilers dragen. Aan de andere kant, als geen binding treedt op, zal het aantal schommelingen van eiwitten bij het omgaan met PMs onafhankelijk zijn, waardoor geen gecorreleerde schommelingen. De overname kan op twee manieren worden uitgevoerd: 1) sFCCS is gebaseerd op een lijn-vormige scan door de contactpersoon van de cel-cel en effectief onderzoekt de interacties in een plek gelegen in de regio contact. Door middel van een temporele analyse van fluorescentie schommelingen biedt sFCCS ook dynamica informatie, dat wil zeggen, de coëfficiënten van de diffusie van eiwitcomplexen; 2) ccN & B is gebaseerd op een pixel-wise analyse van een reeks beelden die zijn verworven op de cel contact regio's. Het heeft de mogelijkheid om te sonderen en kaart interacties langs de hele Neem contact op met de regio (in één brandvlak), maar levert geen informatie over dynamiek. Beide methoden kunnen worden gecombineerd met een analyse van de moleculaire helderheid, dat wil zeggen, de gemiddelde fluorescentie-signaal in de tijdseenheid uitgestoten door één verspreiden van eiwitcomplexen en schattingen van de stoichiometrie van eiwitcomplexen op dus op te leveren de contactpersonen van de cel.
In dit artikel geven wij gedetailleerde protocollen voor monstervoorbereiding, kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analyse uit te voeren van de voorgestelde bepaling over een commerciële confocale laser scanning microscoop. De experimenten kunnen worden uitgevoerd op elk instrument voorzien van foton tellen of analoge detectoren en een doelstelling met hoge numerieke diafragma. We verder bespreken kritische stappen van het protocol en correctie regelingen voorzien in verschillende processen veroorzaken artefactual signaal schommelingen, bijvoorbeeld detector geluidshinder, photobleaching of cel verkeer. Oorspronkelijk ontwikkeld om sonde interacties tussen Adherente cellen, de bepaling voor schorsing cellen kunnen worden gewijzigd of aangepast aan membraan modelsystemen, bijvoorbeeld gigantische unilamellar blaasjes (GUVs) of gigantische plasma membraan blaasjes (GPMVs), waardoor de kwantificering van interacties in verschillende lipide omgevingen of bij gebreke van een georganiseerde cytoskelet12,13.
Het scannen van fluorescentie cross-correlatie spectroscopie is een gewijzigde versie van fluorescentie cross-correlatie spectroscopie14 en werd specifiek ontworpen om de sonde langzaam diffusive dynamiek in lipide membranen15. Het is gebaseerd op een lijn-scan overname loodrecht op de PM met de fluorescente proteïnen van belang. Om de sonde twee anders gelabelde eiwit soorten interacties, wordt de verwerving uitgevoerd in twee spectrale kanalen met behulp van twee laserlijnen en twee detectie Vensters voor spectraal gescheiden fluorophores. Vanwege de dynamiek van de trage verspreiding van eiwitten in de PM (D≤ ~ 1 µm2/s), een cross-talk-gratis meting kan worden uitgevoerd door afwisselend de regeling van de excitatie van lijn tot lijn15. De analyse begint met: 1) een uitlijning algoritme corrigeren voor laterale cel verkeer op basis van block-wise gemiddeld van ~ 1000 lijnen, 2) bepaling van de positie met maximale fluorescentie signaaldat wil zeggen, de PM positie, in elk blok en 3) verschuiven van alle blokken te een gemeenschappelijke oorsprong12,15, afzonderlijk in elk kanaal. Vervolgens wordt een automatische selectie van pixels die overeenkomen met de PM uitgevoerd door het selecteren van de regio in het midden van een Gaussiaanse pasvorm van de som van alle uitgelijnde lijnen (d.w.z., centrum ± 2.5σ). Integratie van het signaal in elke regel levert de membraan fluorescentie tijdreeksen F(t) in elk kanaal (g = groen kanaal, r = rode kanaal). Opmerking dat de pixelgrootte moet klein genoeg, bijvoorbeeld < 200 nm, te reconstrueren van de vorm van het punt verspreiden op functie en vindt haar center, overeenkomt met de positie van de PM. In de aanwezigheid van aanzienlijke photobleaching, de fluorescentie tijdreeksen in elk kanaal kan worden gemodelleerd met een dubbel-exponentiële functie en vervolgens gecorrigeerd met behulp van de volgende formule:16
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq2.jpg">.    (1)
Het is belangrijk op te merken dat deze formule effectief corrigeert zowel de amplitudes en de diffusie tijden verkregen correlatie analyse van F(t)c, vergeleken met de ramingen van de parameter die uit de niet-gecorrigeerde F(t)zou worden verkregen. Vervolgens, de auto - en cross-correlatie functies (ACFs / CCFs) van de fluorescentie signalen worden berekend:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq3v2.jpg">, (2).
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq4v2.jpg">, (3).
waar δFik = Fik(t) - <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img> Fik(t)<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg"> </img> en ik = g, r.
Het model van een twee-dimensionale diffusie is dan voorzien tot alle functies van de correlatie (CFs):
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq7.jpg">.   (4)
Hier, geeft N het aantal fluorescente proteïnen in de omvang van de observatie en τd de diffusie-tijd voor elk kanaal. Dit model houdt rekening dat in de beschreven experimentele setting, verspreiding van eiwitten in de PM treedt op in het x-z vlak, in tegenstelling tot de veel gebruikte configuratie voor fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) experimenten op membranen sonderen verspreiding in de x-y-vlak van de confocal volume17. De taille w0 en de structuur factor S, met een beschrijving van de rek wz van het focal volume in z, S = wz/w0, een punt FCS kalibratie meting uitgevoerd met spectraal soortgelijke kleurstoffen en dezelfde optische instellingen worden verkregen met behulp van reeds beschikbare waarden voor de diffusie-coëfficiënt Dkleurstof:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq8.jpg">, (5).
waar τd, kleurstof de tijd gemeten gemiddelde verspreiding van de kleurstof moleculen is, verkregen uit de montage van een model voor driedimensionale verspreiding op gegevens, rekening houdend rekening overgangen van een breuk T van alle N -moleculen aan een triplet staat met een tijdconstante ττ:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq9.jpg">.   (6)
Tot slot zijn diffusie coëfficiënten (D), moleculaire helderheidswaarden (ε) en de relatieve cross-correlatie van sFCCS gegevens (rel.cc.) als volgt berekend:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq10.jpg">, (7).
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq11.jpg">, (8).
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq12.jpg">, (9).
waar GKruis(0) is de amplitude van de functie cross-correlatie en <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq14.jpg"> is de amplitude van de autocorrelatiefunctie in het ik-th kanaal.
Deze definitie van de relatieve cross-correlatie, dat wil zeggen met behulp van max in plaats van betekenen in vergelijking 9, houdt rekening dat het maximum aantal complexen van twee eiwit soorten waarvan de aanwezigheid in verschillende concentraties wordt beperkt door de soorten waarvan de aanwezigheid in een lager nummer.
Cross-correlatie nummer en helderheid is gebaseerd op een analyse van het moment van de intensiteit van de fluorescentie voor elke pixel van een afbeeldingsstapel verworven na verloop van tijd op een vaste positie in de steekproef, meestal bestaande uit ~ 100-200 frames, met twee spectrale kanalen () g = groen kanaal, r = rode kanaal). Ten opzichte van de temporele gemiddelde <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img>ik<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg">ik en variantie <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq16.jpg"> </img>, de moleculaire helderheid εi en nummer nik worden berekend in elke pixel en spectrale kanaal (Ik = g, r)18:
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq20.jpg">, (10).
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq21.jpg">. (11)
Het is belangrijk op te merken dat de gegeven vergelijkingen voor de ideale geval voor een ware foton-tellen detector gelden. Voor analoge detectiesystemen gelden de volgende vergelijkingen19,20:
<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq22.jpg">, (12).
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq23.jpg">.   (13)
Hier, S is de omrekeningsfactor tussen gedetecteerde fotonen en de opgenomen digitale graven, <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> is de uitlezing lawaai en offset verwijst naar de verschuiving van de intensiteit van de detector. In het algemeen, deze hoeveelheden moeten worden gekalibreerd, voor elk type van de detector, gebaseerd op de meting van de variatie van de detector als een functie van intensiteit voor constante verlichting19, bijvoorbeeld een reflecterend oppervlak van metalen of gedroogde kleurstof oplossing. De verschuiving kan worden bepaald door het meten van de graaf-tarief voor een monster zonder excitatie licht. Door het uitvoeren van een lineaire regressie van de afwijking van de detector-geassocieerde <img alt="Equation 25" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq25.jpg"> versus intensiteit (ik) perceel, S en <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> kan worden bepaald19:
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq27.jpg">.   (14)
Tot slot, de cross-correlatie helderheid in elke pixel wordt berekend en wordt gedefinieerd in het algemeen als21
<img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq28.jpg">, (15).
waar <img alt="Equation 29" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq29.jpg"> is de Kruis-variantie <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq30.jpg"> </img>.
Om het filteren van langlevende schommelingen, worden alle ccN & B berekeningen uitgevoerd na een boxcar filtering, onafhankelijk voor elke pixel22. Kort, ni, εik (Ik = g, r) en Bcc in glijden segmenten van bijvoorbeeld 8-15 frames worden berekend. De aldus verkregen waarden kunnen vervolgens om te verkrijgen van de laatste pixel aantal en helderheid waarden worden gemiddeld.
Stoichiometrie analyse Om te kunnen inschatten van de stoichiometrie van eiwitcomplexen op cel contactpersonen, kan de moleculaire helderheid afzonderlijk worden geanalyseerd in elke spectrale kanaal voor de sFCCS of ccN & B gegevens. In sFCCS, wordt een helderheidswaarde verkregen per meting in elk kanaal. In ccN & B, een histogram van de helderheid van alle pixels die overeenkomen met de contactpersoon van de cel wordt verkregen en de waarde van de gemiddelde (of mediaan) kan worden gebruikt als vertegenwoordiger helderheid voor de meting. Door het uitvoeren van de dezelfde analyse op een monomeer verwijzing, kunnen alle helderheidswaarden rechtstreeks voor de gemiddelde oligomere staat van de gedetecteerde eiwitcomplexen worden genormaliseerd. Op dit punt, is het belangrijk om te corrigeren voor de aanwezigheid van niet-belichting fluorescerende FPs die leiden een onderschatting van de oligomere staat tot kan. Dit wordt meestal uitgevoerd door het meten van de helderheid van een homo-dimeric referentie eiwit23,24 met één kleur sFCS of nummer en de helderheid (N & B).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:596px;" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM growth medium</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-01548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-35500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P10-023100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TurboFect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:95px;">DSMZ</td>
			<td style="width:119px;">ACC 635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Alexa Fluor 488 NHS Ester</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Alderich</td>
			<td style="width:119px;">83689-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid DNA</td>
			<td style="width:95px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:95px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35-mm glass bottom dishes</td>
			<td style="width:95px;">CellVis</td>
			<td style="width:119px;">D35-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM780 confocal</td>
			<td style="width:95px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MATLAB software package</td>
			<td style="width:95px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">&#160;2015b&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Neubauer cell counting chamber</td>
			<td style="width:95px;">Marienfeld</td>
			<td align="right" style="width:119px;">640110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts

Een scala aan biologische processen omvat cel interacties, meestal gemedieerd door eiwitten die op het raakvlak tussen naburige cellen samenwerken. Van belang zijn slechts weinig testen staat specifiek indringende dergelijke interacties rechtstreeks in levende cellen. Hier presenteren we een test voor het meten van de binding van eiwitten geeft uiting aan de oppervlakken van naburige cellen, op cel contacten. Deze test bestaat uit twee stappen: vermenging van cellen uiten van de proteïnen van belang gesmolten aan verschillende fluorescente proteïnen, gevolgd door fluorescentie schommelingen spectroscopie metingen op cel-cel contacten met behulp van een confocale laser scanning microscoop. We aantonen de haalbaarheid van deze test in een biologisch relevante context door het meten van de interacties van de amyloïde precursor-achtige eiwitten 1 (APLP1) over de cel-cel kruispunten. Wij bieden gedetailleerde protocollen op de data-acquisitie met behulp van fluorescentie gebaseerde technieken (scannen van fluorescentie cross-correlatie spectroscopie, cross-correlatie nummer en helderheid analyse) en het vereiste instrument kalibraties. Verder bespreken we kritische stappen in de data-analyse en hoe te identificeren en corrigeren van externe, vals signaal variaties, zoals die als gevolg van photobleaching of cel verkeer.
In het algemeen, de voorgestelde bepaling is van toepassing op elke homo- of heterotypic eiwit-eiwit interactie op cel contacten, tussen de cellen van de dezelfde of verschillende typen en op een commerciële confocale laser scanning microscoop kan worden uitgevoerd. Een belangrijke voorwaarde is de stabiliteit van het systeem, dat volstaan moet om de sonde diffusive dynamiek van de proteïnen van belang over enkele minuten.

Een eerste test voor de eiwit-eiwit interactie assay, dat wil zeggen, mengen van cellen uiten spectraal verschillende fluorescente proteïnen, gevolgd door sFCCS/ccN & B metingen (Figuur 1), moet worden uitgevoerd op eiwitten die naar verwachting niet werken bij de cel contact (dat wil zeggen, een negatieve controle). Daarom HEK 293T cellen, uiting van myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-palm-mEYFP) of -mCardinal waren gemengd en sFCCS we...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het cel-naar-cel interactieveld te begrijpen, zoals welke receptoren bemiddelen hechting of herkenning in cel-naar-celcontacten en of specifieke liganden hun interacties activeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om dergelijke interacties direct te onderzoeken in levende cellen zonder behoefte aan celfixatie of verstoring. Hoewel deze methode wordt gebruikt om interacties tussen gekweekte cellen te onderzoeken, kan het ook worden toegepast op andere systemen mono-membraan vesikels of zelfs kleine modelorganismen.Over het algemeen individuen nieuw op deze methode moet controleren of hun monster stabiel genoeg is om de verwerving over een paar minuten mogelijk te maken door zorgvuldig te inspecteren celbeweging en langzame signaal variaties. Eerste, zaad het juiste aantal cellen in ten minste vier putten van een zes-put plaat een dag voor de transfectie. Kweek de cellen bij 37 graden Celsius 5%kooldioxide in DMEM medium aangevuld met 10%FBS en 1%L-glutamine.Om een basisexperiment uit te voeren transfect plasmiden voor het eiwit van belang versmolten tot een groen of een geel fluorescerend eiwit en een rood fluorescerend eiwit in afzonderlijke putten. Na vier uur verwijder het groeimedium en was elke put voorzichtig met een milliliter PBS aangevuld met magnesium en calcium dropping PBS op de put rand om onthechting van de cellen te voorkomen tijdens het wassen. Verwijder vervolgens de PBS.Voeg ongeveer 50 microliter EDTA-oplossing dalen verstandig om elke put te vergemakkelijken detachement van de cellen. Na het uitbroeden bij 37 graden Celsius gedurende twee minuten, langzaam schudden de zes-put plaat lateraal om de cellen los te maken. Voeg vervolgens 950 microliters groeimedium toe aan elke put en zet de cellen opnieuw op door een paar keer op en neer te pipetten, waardoor alle cellen van de putbodem worden losgemaakt.Zorg ervoor dat cellen goed worden opgetrokken en van elkaar worden losgemaakt door visueel te controleren op de afwezigheid van grote celaggregaten na resuspension. Breng de celoplossing van een put naar de overeenkomstige put. Meng voorzichtig door pipetteren een paar keer op en neer.Dan zaad de gemengde cellen op een 35-millimeter glazen bodem schotel en cultuur de gezaaide cellen op 37 graden Celsius in 5%kooldioxide voor een dag. In de laser scanning confocale microscoop software het opzetten van de optische pad. Om spectrale crosstalk te voorkomen, selecteert u twee afzonderlijke tracks om mEGFP of mEYFP en mEYFP en mCherry of mCardinale sequentieel te detecteren en selecteer Schakel elke lijn.Voor de detectie gebruik maken van de juiste filters voor beide kanalen. Plaats de schotel met de gemengde cellen op de monsterhouder. Na 10 minuten wachten om temperatuurevenwicht te garanderen en de focusdrift te verminderen, richt u zich op de cellen met behulp van het transmissielicht in het menu Lokaliseren.Zoek naar een paar rode en groene cellen die met elkaar in contact komen. Selecteer vervolgens een scanpad loodrecht op cel-naar-celcontact met de knop Bijsnijden. Zoom in om een pixelgrootte van 50 tot 200 nanometer te bereiken en selecteer Lijn in scanmodus.Stel de framegrootte in op 128 bij één pixels. Stel de scansnelheid in op de maximaal toegestane waarde. Stel cycli in op 100,000 tot 500.000.Kies hierna de juiste laserkrachten. Stel de detectoren in op de fotontelmodus. Druk op Start Experiment om de overname te starten.Exporteer de ruwe gegevensbestanden naar een RGB TIF-afbeelding in onbewerkte gegevensindeling. Dit bestand bevat een kymograaf met de groene en rode kanaalgegevens in het kanaal dat respectievelijk G en R van de afbeelding wordt genoemd. Importeer vervolgens het TIF-bestand met de juiste analysesoftware en voer de analyse uit.Lijn de lijnen uit door een segmentmatig tijdgemiddelde uit te voeren met blokken van 500 tot 1000 lijnen. Bepaal de membraanpositie in elk blok. Schakel vervolgens alle blokken naar dezelfde zijdelingse positie.Vat alle uitgelijnde lijnen langs de tijdsas samen en pas aan op het gemiddelde intensiteitsprofiel met behulp van een Gaussische functie. Definieer de pixels die overeenkomen met het membraan als alle pixels binnen plus of min 2,5 sigma van de membraanpositie en som de intensiteit van deze pixels in elke regel op en verkrijg een enkele fluorescerende signaalwaarde voor elk tijdpunt. Als foto bleken wordt waargenomen, breng een bleekcorrectie door de membraan fluorescentie tijd serie met een dubbele exponentiële functie en de toepassing van de juiste correctie formule.Bereken de functies voor automatische en kruiscorrelaties op basis van de juiste vergelijkingen. Om de betrouwbaarheid van de analyse te verbeteren en artefacten te voorkomen, voert u de berekeningen uit voor 10 tot 20 gelijke segmenten van de totale meting. Inspecteer de fluorescentietijdreeksen en correlatiefuncties in elk segment en verwijder duidelijk vervormde segmenten.Ten slotte, gemiddeld alle niet-vervormde segmenten. Tijdens het analyseren van uw gegevens, zorgvuldig inspecteren van de intensiteit tijdreeksen en correlatie functies van elk segment om vervormingen te voorkomen, bijvoorbeeld als gevolg van intracellulaire blaasjes in het membraan periferie. Hier wordt een intensiteitsbeeld weergegeven van HEK 293T-cellen die myristolyated-palmitoylated-mEYFP of mCardinal uitdrukken.Een relatieve kruiscorrelatie dicht bij nul werd waargenomen terwijl de autocorrelatiefuncties karakteristieke vervaltijden van 10 tot 20 milliseconden vertonen voor de verspreiding van myristolyated-palmitoylated-mEYFP en mCardinal in het plasmamembraan. De kruiscorrelatiefuncties van de sFCCS-metingen van HEK 293T-cellen die membraan-verankerde heterodimer myristolyated-palmitoylated-mCardinal-mEYFP uitdrukken hadden positieve amplitudes en vertoonden vergelijkbare vervaltijden als de autocorrelatiefunctie. sFCCS-metingen op cel-naar-celcontacten tussen APLP1-mEYFP en APLP1-mCardinaalexpresserende cellen resulteerden in een positieve relatieve kruiscorrelatie van 0,45.De sFCCS correlatiefuncties verkregen uit metingen in APLP1 clusters op cel-cel contacten toonde sterk verminderde dynamiek als blijkt uit grote vervaltijden in de schommelingen op grote vertragingstijden. Bij toevoeging van zinkionen steeg de relatieve kruiscorrelatie tot een gemiddelde waarde van 0,8. Verder steeg de moleculaire helderheid beduidend van kleine oligomeren aan grotere multimers die uit 10 tot 50 monomeren op elke cel bestaan.Voorbijgaande instabiliteiten kunnen resulteren in een cross-correlatie functie met negatieve waarden of een hoge vals-positieve kruiscorrelatie. De overeenkomstige correlatiefuncties wijken doorgaans sterk af van die van de meeste segmenten. Als een complementaire benadering van sFCCS cross-correlatie nummer en helderheid kan worden gebruikt om eiwit-eiwit interacties te detecteren.Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het mengen van transfected cellen is een kritieke stap. Meng voorzichtig de cellen en optimaliseer de efficiëntie van transfectie om de kans op het vinden van rode en groene cellen in contact te vergroten. Na de ontwikkeling is deze techniek door onderzoekers op het gebied van immunologie gebruikt om de interacties van signaalmoleculen in immunologische synapsen te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Een fluorescentie-gebaseerde test fosfolipide scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinyleerd cel-penetrating Peptides te bestuderen van intracellulaire eiwit-eiwitinteractie

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Toepassing van Biolayer interferometrie (BLI) voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties in transcriptie

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Gebruik van thermoforese op microschaal om eiwit-lipide-interacties te meten

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Een planaire beweeglijkheidstest om de biomodulating eigenschappen van natuurlijke producten te meten

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Spotvariatie fluorescentie correlatiespectroscopie voor analyse van moleculaire diffusie op het plasmamembraan van levende cellen

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...