Name: a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts
Uploaded: 2018-12-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

Ce travail a été partiellement soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) accorder 254850309. Les auteurs remercient Madlen Luckner pour une lecture critique du manuscrit.

1. préparation : Cellules mélange dosage
Remarque : Le protocole suivant décrit la procédure de mélange pour les cellules adhérentes. Il peut être modifié pour les cellules cultivées en suspension.
<ol><li>Un nombre adéquat de cellules sur une plaque 6 puits, par exemple, 800 000 cellules HEK 293 t (comptées avec un Neubauer chambre de comptage), un jour avant la transfection des semences. Le nombre peut être modifié selon le délai entre l’amorçage et de transfect...

La procédure expérimentale décrite ici permet l’étude des protéines des interactions trans à contacts de cellule-cellule, employant des techniques de spectroscopie par fluorescence fluctuation, à savoir sFCCS et ccN & B. Ces méthodes impliquent une analyse statistique des variations de fluorescence émise par deux FPs spectralement séparés fusionnés pour les protéines d’intérêt au contact de deux cellules voisines, chacune exprimant l’un ou l’autre protéine de fusion. La présence de compl...

Beaucoup de processus biologiques se produire sur les sites des interactions cellule-cellule, par exemple, cellules adhérence1,2,3, cellule-cellule fusion4 et reconnaissance cellulaire5. Ces événements sont particulièrement importants lors du développement des organismes pluricellulaires et pour la communication de cellule-cellule, par exemple, au cours de la réponse immunitaire. Ces processus sont généralement véhiculées par des protéines qui sont localisés à la surface, c'est-à-dire à la membrane plasmique (PM) des cellules voisines et subissent des interactions spécifiques au contact cellule-cellule qui sont précisément réglementées dans l’espace et le temps. Dans de nombreux cas, ces interactions sont directement homo - ou des interactions protéine-protéine hétérotypiques trans , mais peuvent aussi comporter des ions ou des ligands agissant comme linkers extracellulaire1. Bien que d’une importance fondamentale, il y a un manque d’essais probing ces interactions protéine-protéine spécifique directement dans l’environnement natif des cellules vivantes. Plusieurs méthodes nécessitent soit désorganisation cellulaire (par exemple, des tests biochimiques comme co-immunoprécipitation6), la fixation (par exemple, certaines des techniques de microscopie optique de Super-résolution et microscopie électronique de cellules contacts7), ou sont non spécifiques, par exemple, agrégation / adhérence dosages8,9. Pour résoudre ce problème, techniques de fluorescence ont été appliquées à l’issu de la fluorescence resonance energy transfert (FRET)10 ou fluorescence complémentation11. Toutefois, pour atteindre suffisamment petites distances entre les fluorophores, ces méthodes nécessitent des étiquettes fluorescentes du côté extracellulaire des protéines10, potentiellement interférer avec des interactions de trans .
Nous présentons ici une analyse alternative de basés sur la fluorescence pour interactions protéine-protéine à contacts cellule-cellule. Cette approche combine des approches de corrélation de fluorescence (balayage spectroscopie de corrélation de fluorescence (sFCCS), nombre de corrélation croisée et la luminosité (ccN & B)) et le mélange des cellules exprimant une construction de fusion de la protéine de intérêt, par exemple, un récepteur d’adhésion. Les récepteurs étudiés dans les deux cellules qui interagissent sont étiquetés avec deux protéines fluorescentes spectralement séparés (FPs), de l’intracellulaire (voir Figure 1 a).
Les méthodes employés reposent sur l’analyse statistique des variations de fluorescence induite par le mouvement diffusif fluorescent des protéines de fusion par le biais du volume focal d’un confocal laser scanning microscope. Plus en détail, le test des sondes la diffusion conjointe des protéines d’intérêt dans les deux voisins PMs à contacts cellule-cellule. Si les protéines subissent des interactions de trans , ces complexes trans portera des protéines fluorescentes émettant dans les deux canaux spectraux, provoquant des fluctuations de corrélation de fluorescence des deux émetteurs. En revanche, si aucune liaison se produit, les fluctuations des protéines numéros face à PMs sera indépendantes, ne causant aucune fluctuation corrélées. L’acquisition peut être effectuée de deux façons : 1) sFCCS repose sur une analyse en forme de ligne au travers le contact de cellule-cellule et sondes efficacement les interactions dans un endroit situé dans la région de contact. Grâce à une analyse temporelle des variations de fluorescence, sFCCS renseigne aussi dynamique, c'est-à-dire, les coefficients de diffusion des complexes protéiques ; 2) ccN & B repose sur une analyse d’un d’une séquence d’images acquises dans les régions de contact cellule-cellule. Il a une capacité à sonder et le long de l’ensemble des interactions de carte contact région (dans un plan focal), mais ne fournit pas d’informations sur la dynamique. Les deux méthodes peuvent être combinées avec une analyse de la luminosité moléculaire, c'est-à-dire le signal de fluorescence moyenne émise dans l’unité de temps par simple diffusion complexes de protéines et, ainsi, fournir des estimations de la stoechiométrie des complexes protéiques au contacts de cellule-cellule.
Dans cet article, nous fournissons des protocoles détaillés pour la préparation des échantillons, d’étalonnage des instruments, d’acquisition de données et d’analyse effectuer l’essai présenté sur un laser confocal commercial microscope à balayage. Les expériences peuvent être effectuées sur n’importe quel instrument équipé de comptage de photons ou détecteurs analogiques et un objectif à grande ouverture numérique. Plus loin, nous discutons des étapes critiques du protocole et fournissent des systèmes de correction pour plusieurs processus causant des fluctuations artéfactuelles signal, par exemple, bruit de détecteur, photoblanchiment ou cellule mouvement. Développé à l’origine pour sonder les interactions entre cellules adhérentes, l’essai peut être modifié pour les cellules en suspension, ou adaptée aux systèmes à membrane modèle, par exemple, les vésicules unilamellaires géant (GUVs) ou le plasma géant vésicules de la membrane (GPMVs), ce qui permet la quantification des interactions dans des environnements différents lipides ou en l’absence d’un cytosquelette organisé12,13.
Spectroscopie de corrélation de fluorescence de balayage est une version modifiée de la spectroscopie de corrélation de fluorescence14 et a été spécialement conçu pour sonder la lente par diffusion dynamique de membranes lipidiques15. Il repose sur une acquisition de balayage ligne perpendiculaire à la PM contenant les protéines fluorescentes d’intérêt. Pour sonder les interactions entre les deux espèces de protéines marquées différemment, l’acquisition est effectuée en deux canaux spectraux en utilisant deux lignes laser et deux fenêtres de détection de fluorophores spectralement séparés. En raison de la dynamique de diffusion lente des protéines dans la MP (D≤ ~ 1 µm2/s), une mesure cross-talk-gratuit peut être effectuée en alternance le régime de l’excitation de la ligne à la ligne15. L’analyse commence par : 1) l’alignement algorithme correction de mouvement latéral cellulaire basé sur block-wise avec une moyenne de ~ 1000 lignes, 2) Détermination de la position avec fluorescence maximum signal, c'est-à-dire la PM position dans chaque bloc et 3) shifting de tous les blocs d’une commune origine12,15, séparément pour chaque voie. Puis, une sélection automatique des pixels correspondant à la PM est exécutée en sélectionnant la zone centrale d’un ajustement gaussien de la somme de toutes les lignes alignées (c.-à-d., Centre ± 2.5σ). Intégration du signal de chaque ligne donne la série temporelle de fluorescence membranaire f (t) dans chaque canal (g = vert canal, r = canal rouge). Notez que la taille du pixel doit être assez petit par exemple, < 200 nm, pour reconstruire la forme du point de fonction d’étalement et de trouver son centre, correspondant à la position de la MP. En présence de photoblanchiment substantiel, les séries chronologiques de fluorescence dans chaque canal peuvent être modélisés par une fonction exponentielle double et puis corrigés avec la formule suivante :16
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq2.jpg">.    (1)
Il est important de noter que cette formule corrige efficacement tant les amplitudes et les heures de diffusion obtenues par l’analyse de corrélation de f (t)c, par rapport aux estimations de paramètre qui seraient obtenues à partir du non corrigée f (t). Ensuite, les fonctions auto - et la corrélation croisée (ACFs / CCP) de la fluorescence des signaux sont calculées :
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq3v2.jpg">, (2).
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq4v2.jpg">, (3).
où δFj’ai = Fi(t) - <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img> Fi(t)<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg"> </img> et i = g, r.
Un modèle de diffusion bidimensionnelle est ensuite ajusté à toutes les fonctions de corrélation (CFs) :
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq7.jpg">.   (4)
Ici, N désigne le nombre de protéines fluorescentes dans le volume de l’observation et τd le temps de diffusion pour chaque canal. Ce modèle prend en compte que dans le cadre expérimental décrit, diffusion des protéines dans la MP se produit dans le plan x-z, contrairement à la configuration courante de corrélation de fluorescence spectroscopy (FCS) expériences sur les membranes de palpage diffusion dans le plan x-y du confocal volume17. La taille w0 et le facteur de structure S, décrivant l’allongement wz du volume focal en z, S = wz/w0, sont obtenues à partir d’une mesure de calibration de FCS point effectuée avec colorants spectralement similaires et les mêmes paramètres optiques à l’aide de valeurs déjà disponibles pour le coefficient de diffusion Dcolorant:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq8.jpg">, (5).
où τd, colorant est le temps de diffusion moyenne mesurée des molécules de colorant, obtenu à partir d’un modèle pour la diffusion en trois dimensions des données, compte tenu des transitions de compte d’une fraction T de toutes les molécules de N à un état triplet avec une constante de temps ττ:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq9.jpg">.   (6)
Enfin, les coefficients de diffusion (D), les valeurs de luminosité moléculaire (ε) et la corrélation croisée relative des données sFCCS (rel.cc.) sont calculées comme suit :
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq10.jpg">, (7).
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq11.jpg">, (8).
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq12.jpg">, (9).
où GCroix(0) est l’amplitude de la fonction de corrélation croisée et <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq14.jpg"> est l’amplitude de la fonction d’autocorrélation dans le canal du je-th.
Cette définition de la relative corrélation croisée, c'est-à-dire à l’aide de max au lieu de signifier l’équation 9, tient compte du fait que le nombre maximal de complexes des deux espèces de protéines présents à des concentrations différentes est limité par la espèces présentes dans un nombre inférieur.
Luminosité et nombre de corrélation croisée repose sur une analyse de l’instant de l’intensité de fluorescence pour chaque pixel d’une image de pile a acquis au fil du temps à une position fixe dans l’échantillon, généralement composé de ~ 100-200 cadres, avec deux spectrale des canaux () g = vert canal, r = canal rouge). D’après la moyenne temporelle <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img>je<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg">et la variance <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq16.jpg"> </img>, la luminosité moléculaire εi et numéro nj’ai sont calculées dans chaque pixel et de canaux spectraux (j’ai = g, r)18:
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq20.jpg">, (10).
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq21.jpg">. (11)
Il est important de noter que les équations données s’appliquent pour le cas idéal d’un vrai détecteur de comptage de photons. Pour les systèmes de détection analogique, les équations suivantes s’appliquent à19,20:
<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq22.jpg">, (12).
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq23.jpg">.   (13)
Ici, S est le facteur de conversion entre les photons détectés et les comtes numériques enregistrées, <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> est le bruit de lecture et offset fait référence à l’offset d’intensité de détecteur. Généralement, ces quantités doivent être étalonnées, pour n’importe quel type de détecteur, basée sur la mesure de la variance du détecteur en fonction de l’intensité d’éclairage constant19, par exemple, une surface métallique réfléchissante ou solution de colorant séchées. Le décalage peut être déterminé en mesurant le taux de comptage pour un échantillon sans lumière d’excitation. En effectuant une régression linéaire de la variance associée à détecteur <img alt="Equation 25" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq25.jpg"> contre le tracé de l’intensité (I), S et <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> peut être déterminée19:
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq27.jpg">.   (14)
Enfin, la luminosité de la corrélation croisée est calculée dans chaque pixel et est définie en général comme21
<img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq28.jpg">, (15).
où <img alt="Equation 29" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq29.jpg"> est la Croix et la variance <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq30.jpg"> </img>.
Pour filtrer les fluctuations à long terme, toutes les ccN & calculs B sont effectuées suivant un wagon couvert, filtrage, indépendamment pour chaque pixel22. En bref, ni, εj’ai (j’ai = g, r) et Bcc sont calculées en glissant des segments de p. ex. cadres de 8-15. Les valeurs ainsi obtenues peuvent être ensuite la moyenne pour obtenir le pixel final les valeurs de nombre et de la luminosité.
Analyse de stoechiométrie Afin d’estimer la stoechiométrie des complexes protéiques à contacts cellule-cellule, la luminosité moléculaire peut être analysée séparément pour chaque voie spectral pour le sFCCS ou le ccN & B data. Dans sFCCS, une valeur de luminosité est obtenue par la mesure de chaque canal. Dans la ccN & B, on obtient un histogramme de luminosité des pixels situés correspondant au contact cellule-cellule et la valeur moyenne (ou médiane) peut servir de luminosité représentative pour la mesure. En effectuant la même analyse sur une référence monomère, toutes les valeurs de luminosité peuvent être normalisées pour obtenir directement l’État oligomère moyenne des complexes protéine détectée. À ce stade, il est important de corriger la présence de FPs non fluorescent pouvant entraîner une sous-estimation de l’État oligomère. Ceci est généralement effectuée par la mesure de la luminosité d’un homo-dimère référence protéine23,24 utilisant une couleur SCTS-m ou le numéro et la luminosité (N & B).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:596px;" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM growth medium</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-01548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-35500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P10-023100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TurboFect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:95px;">DSMZ</td>
			<td style="width:119px;">ACC 635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Alexa Fluor 488 NHS Ester</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Alderich</td>
			<td style="width:119px;">83689-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid DNA</td>
			<td style="width:95px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:95px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35-mm glass bottom dishes</td>
			<td style="width:95px;">CellVis</td>
			<td style="width:119px;">D35-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM780 confocal</td>
			<td style="width:95px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MATLAB software package</td>
			<td style="width:95px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">&#160;2015b&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Neubauer cell counting chamber</td>
			<td style="width:95px;">Marienfeld</td>
			<td align="right" style="width:119px;">640110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts

Une variété de processus biologiques implique des interactions cellule-cellule, généralement véhiculées par les protéines qui interagissent à l’interface entre les cellules voisines. D’intérêt, seulement quelques essais sont capables de sonder précisément ces interactions directement dans les cellules vivantes. Nous présentons ici un test pour mesurer la liaison des protéines exprimées à la surface des cellules voisines, aux contacts de cellules. Ce test comprend deux étapes : mélange des cellules exprimant les protéines d’intérêt fusionné à différentes protéines fluorescentes, suivie de mesures de spectroscopie de fluorescence fluctuation aux contacts de cellules à l’aide d’un laser confocal microscope à balayage. Nous démontrer la faisabilité de ce test dans un contexte biologiquement pertinent en mesurant les interactions de la protéine amyloïde de précurseurs comme 1 (APLP1) jonctions cellule-cellule. Nous fournissons des protocoles détaillés sur l’acquisition de données à l’aide de techniques axées sur la fluorescence (analyse spectroscopie de corrélation de fluorescence, nombre de corrélation croisée et l’analyse de la luminosité) et l’étalonnage de l’instrument requis. De plus, nous discutons des étapes essentielles dans l’analyse des données et la façon d’identifier et de corriger les variations de signal externe, parasites, telles que celles dues à un mouvement de photoblanchiment ou cellule.
En général, l’analyse présentée est applicable à tout homo - ou d’une interaction de protéines hétérotypiques à contacts de cellule-cellule, entre les cellules des types identiques ou différents et peut être implémentée sur un laser confocal commercial microscope à balayage. Une exigence importante est la stabilité du système, qui doit être suffisante pour sonder par diffusion dynamique des protéines d’intérêt pendant plusieurs minutes.

Un premier test pour le test d’interaction protéine-protéine, c.-à-d., mélange de cellules exprimant des protéines fluorescentes spectralement distinctes suivies sFCCS/ccN & mesures B (Figure 1), doit être effectué sur les protéines qui ne sont pas censés interagir au contact cellule-cellule (par exemple, un contrôle négatif). Par conséquent, les cellules HEK 293 t exprimant myristoylated-palmitoylées-mEYFP (myr-palm-mEYFP) ou...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Ce protocole décrit une approche d’axée sur la spectroscopie de fluorescence fluctuation pour étudier les interactions entre protéines médiant les interactions cellule-cellule, c'est-à-dire des protéines localisées dans les jonctions cellulaires, directement dans les cellules vivantes. Nous fournissons des lignes directrices détaillées sur l’étalonnage de l’instrument, d’acquisition de données et l’analyse, y compris les corrections apportées aux sources de l’artefact possible.

Un dosage de spectroscopie par Fluorescence Fluctuation d’Interactions protéine-protéine à Contacts cellule-cellule

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Cette méthode peut aider à comprendre les questions clés dans le domaine de l’interaction cellule à cellule, telles que les récepteurs qui médiationent l’adhérence ou la reconnaissance dans les contacts cellule à cellule et si des ligands spécifiques déclenchent leurs interactions. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’étudier ces interactions directement dans les cellules vivantes sans avoir besoin de fixation ou de perturbation cellulaire. Bien que cette méthode soit utilisée pour étudier les interactions entre les cellules de culture, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes vésicules monobrasques ou même à de petits organismes modèles.En général, les personnes nouvelles à cette méthode devraient vérifier que leur échantillon est suffisamment stable pour permettre l’acquisition sur quelques minutes en inspectant soigneusement le mouvement cellulaire et les variations lentes du signal. Tout d’abord, ensemencer le nombre approprié de cellules dans au moins quatre puits d’une plaque de six puits par jour avant la transfection. Culture des cellules à 37 degrés Celsius 5% dioxyde de carbone dans le milieu DMEM complété par 10%FBS et 1%L-glutamine.Effectuer une expérience de base plasmides transfect pour la protéine d’intérêt fusionnée à une protéine fluorescente verte ou jaune et une protéine fluorescente rouge dans des puits séparés. Après quatre heures enlever le milieu de croissance et laver chaque puits doucement avec un millilitre de PBS complété avec du magnésium et du calcium tombant PBS sur le bord du puits pour empêcher le détachement des cellules pendant le lavage. Retirez ensuite le PBS.Ajouter environ 50 microlitres de solution EDTA goutte sage à chaque puits pour faciliter le détachement des cellules. Après avoir couver à 37 degrés Celsius pendant deux minutes, secouez lentement la plaque de six puits latéralement pour détacher les cellules. Ensuite, ajoutez 950 microlitres de milieu de croissance à chaque puits et résuspendez les cellules en pipetant à quelques reprises de haut en bas, détachant ainsi toutes les cellules du fond du puits.Assurez-vous que les cellules sont résuspendus correctement et détachées les unes des autres en vérifiant visuellement l’absence de gros agrégats cellulaires après la résuspension. Transférer la solution cellulaire d’un puits au puits correspondant. Mélanger délicatement en pipetant à quelques reprises de haut en bas.Puis ensemencer les cellules mélangées sur un plat de fond en verre de 35 millimètres et la culture des cellules ensemencées à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5% pendant une journée. Dans le logiciel de microscope confocal à balayage laser mis en place le chemin optique. Pour éviter la tige transversale spectrale, sélectionnez deux pistes distinctes pour exciter et détecter mEGFP ou mEYFP et mCherry ou mCardinal séquentiellement et sélectionnez switch pistes chaque ligne.Pour la détection utiliser des filtres appropriés pour les deux canaux. Placer le plat contenant les cellules mélangées sur le porte-échantillon. Après avoir attendu 10 minutes pour assurer l’équilibre de la température et réduire la dérive de mise au point, concentrez-vous sur les cellules en utilisant la lumière de transmission dans le menu Localiser.Recherchez une paire de globules rouges et verts en contact les uns avec les autres. Ensuite, sélectionnez un chemin d’analyse perpendiculaire au contact cellule à cellule à l’aide du bouton Crop. Zoomez pour atteindre une taille de pixel de 50 à 200 nanomètres et sélectionnez Ligne en mode Scan.Réglez la taille du cadre à 128 par un pixels. Réglez la vitesse d’analyse à la valeur maximale autorisée. Réglez ensuite les cycles à 100 000 à 500 000.Par la suite, choisissez les pouvoirs laser appropriés. Réglez les détecteurs en mode Comptage photon. Appuyez sur Démarrer l’expérience pour commencer l’acquisition.Exportez les fichiers de données brutes vers une image RGB TIF en format données brutes. Ce fichier contiendra un kymograph avec les données de canal vert et rouge dans le canal appelé G et R de l’image, respectivement. Ensuite, importez le fichier TIF avec le logiciel d’analyse approprié et procédez à l’analyse.Alignez les lignes en effectuant une moyenne de temps du segment avec des blocs de 500 à 1000 lignes. Déterminer la position de la membrane dans chaque bloc. Déplacez ensuite tous les blocs vers la même position latérale.Résumez toutes les lignes alignées le long de l’axe du temps et adaptez le profil d’intensité moyenne à l’aide d’une fonction gaussienne. Définissez les pixels correspondant à la membrane comme tous les pixels dans plus ou moins 2,5 sigma de la position de la membrane, et résumez l’intensité de ces pixels dans chaque ligne en obtenant une valeur de signal fluorescent unique pour chaque point de temps. Si le blanchiment photo est observé, appliquez une correction de blanchiment en adaptant la série de temps de fluorescence de membrane avec une fonction exponentielle double et en appliquant la formule appropriée de correction.Calculez les fonctions d’auto et de corrélation croisée en fonction des équations appropriées. Pour améliorer la fiabilité de l’analyse et éviter les artefacts effectuer les calculs pour 10 à 20 segments égaux de la mesure totale. Inspectez les séries de temps de fluorescence et les fonctions de corrélation dans chaque segment et supprimez les segments clairement déformés.Enfin, la moyenne de tous les segments non faussés. Lors de l’analyse de vos données, inspectez soigneusement les séries temporelles d’intensité et les fonctions de corrélation de chaque segment afin d’éviter les distorsions, par exemple en raison de vésicules intracellulaires dans la périphérie membranaire. Une image d’intensité des cellules HEK 293T exprimant myristolyated-palmitoylated-mEYFP ou mCardinal est montrée ici.Une corrélation croisée relative proche de zéro a été observée tandis que les fonctions d’autocorrelation montrent des temps de décomposition caractéristiques de 10 à 20 millisecondes pour la diffusion du myristolyated-palmitoylated-mEYFP et du mCardinal dans la membrane plasmatique. Les fonctions de corrélation croisée des mesures sFCCS des cellules HEK 293T exprimant l’heterodimer myterodimé myristolyated-palmitoylated-mCardinal-mEYFP ont eu des amplitudes positives et ont montré des temps de décomposition semblables à la fonction d’autocorréfération. Les mesures de sFCCS sur des contacts de cellule à cellule entre APLP1-mEYFP et aplp1-mCardinal-exprimant des cellules ont eu comme conséquence une corrélation croisée relative positive de 0.45.Les fonctions de corrélation sFCCS obtenues à partir de mesures à travers les clusters APLP1 à des contacts cellule-cellule ont montré une dynamique fortement réduite comme en témoigne les temps de décomposition importants dans les oscillations à de grands moments de décalage. Lors de l’ajout d’ion de zinc, la corrélation croisée relative a augmenté à une valeur moyenne de 0,8. En outre, la luminosité moléculaire a considérablement augmenté de petits oligomers à de plus grands multimères composés de 10 à 50 monomères sur chaque cellule.Les instabilités transitoires peuvent entraîner une fonction de corrélation croisée ayant des valeurs négatives ou une forte corrélation croisée faussement positive. Les fonctions de corrélation correspondantes s’écartent généralement fortement de celles de la majorité des segments. Comme une approche complémentaire au nombre et à la luminosité de la corrélation croisée sFCCS peut être utilisée pour détecter les interactions protéines-protéines.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que le mélange des cellules transfected est une étape critique. Mélangez doucement les cellules et optimisez l’efficacité de la transfection pour augmenter les chances de trouver des cellules rouges et vertes en contact. Après son développement, cette technique a été utilisée par des chercheurs dans le domaine de l’immunologie pour explorer les interactions des molécules de signalisation dans les synapses immunologiques.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Un test basé sur la fluorescence de phospholipides scramblase Activité

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Recherche

Biochimie

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescence anisotropie comme outil pour étudier les interactions protéine-protéine

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilisation de Scaffold Liposomes à Reconstituer interactions protéine-protéine Lipid-proximal<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Peptides de pénétration cellulaire biotinylé pour étudier les Interactions protéine-protéine intracellulaire

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

À l’aide au transfert d’énergie Fluorescence in Vitro pour étudier la dynamique des protéines Complexes à une échelle de temps de milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application de biocouches interferométrie (BLI) pour étudier les interactions protéines-protéines dans la transcription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Évaluation des interactions protéines-protéines à l'aide d'une technique de digestion on-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Utilisation de la thermophorèse à micro-échelle pour mesurer les interactions protéine-lipide

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Un test de motilité planaire pour évaluer les propriétés biomodulantes des produits naturels

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle pour l’analyse de la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules vivantes

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...