Name: a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts
Uploaded: 2018-12-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) 254850309 zu gewähren. Die Autoren danken Madlen Luckner für kritische Lektüre des Manuskripts.

1. Probenvorbereitung: Zell-Zell-mischen-Assay
Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt den Mischvorgang für adhärente Zellen. Er kann für Zellen in Suspension kultiviert geändert werden.
<ol><li>Samen Sie eine entsprechende Anzahl von Zellen auf einem 6-Well-Platte, z. B. 800.000 HEK 293T Zellen (mit einem Neubauer Kammer zählen gezählt), einen Tag vor Transfektion. Die Anzahl kann je nach Jahreszeit zwischen Aussaat und Transfektion geändert und bereinigt um andere Zellty...

Die hier beschriebene experimentelle Vorgehensweise ermöglicht die Untersuchung von Protein-Protein Trans Interaktionen bei Zell-Zell-Kontakten, Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Techniken, nämlich sFCCS und CcN & B. Diese Methoden beinhalten eine statistische Analyse der Fluoreszenz-Schwankungen, die durch zwei spektral getrennte FPs verschmolzen, benutzt von Interesse an einen Kontakt von zwei benachbarten Zellen, jeweils mit dem Ausdruck einer oder der andere Fusionsproteins emittiert. Das Vorhandensein...

Viele biologische Prozesse auftreten, an den Standorten der Zell-Zell-Interaktionen, z.B. Zellezelle Adhäsion1,2,3, Zell-Zell-Fusion-4 und zelluläre Anerkennung5. Solche Ereignisse sind besonders wichtig bei der Entwicklung von mehrzelligen Lebewesen und für die Zell-Zell-Kommunikation, z. B. während Immunantworten. Diese Prozesse werden in der Regel durch Proteine vermittelt, die an der Oberfläche, d. h. an der Plasmamembran (PM) der benachbarten Zellen lokalisiert sind und spezifische Wechselwirkungen, die auf der Zell-Zell-Kontakt genau geregelten in Raum und Zeit sind zu unterziehen. In vielen Fällen diese Interaktionen sind direkte Homo- oder Zellkulturmodells Protein-Protein- Trans -Wechselwirkungen, aber können auch beinhalten, Ionen oder Liganden als extrazelluläre linker1. Obwohl von grundlegender Bedeutung, fehlt von Assays sondieren dieser spezifischen Protein-Protein-Interaktionen direkt in der natürlichen Umgebung von lebenden Zellen. Viele Methoden erfordern entweder Zellaufschluss (z. B. biochemische Tests wie z. B. co-Immunopräzipitation6), Fixierung (z. B. einige der Höchstauflösung optische Mikroskopie-Techniken und der Zell-Zell-Elektronen-Mikroskopie 7Kontakte), oder sind unspezifisch, z. B. Aggregation / Adhäsion assays8,9. Um dieses Problem zu überwinden, wurden Fluoreszenztechniken umgesetzt, basierend auf Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)10 oder Fluoreszenz Ergänzung11. Um ausreichend geringe Abstände zwischen Fluorophore zu erreichen, erfordern diese Methoden jedoch Fluoreszenzmarkierungen auf der extrazellulären Seite der Proteine10, potenziell Trans Interaktionen behinderen.
Hier präsentieren wir Ihnen eine alternative Fluoreszenz basierende Assays für Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten. Dieser Ansatz verbindet Fluoreszenz Kreuzkorrelation Ansätze (Fluoreszenzspektroskopie Kreuzkorrelation Scan (sFCCS), Kreuzkorrelation Anzahl und Helligkeit (CcN & B)) und Mischen von Zellen mit dem Ausdruck einer Fusion-Konstrukt des Proteins Interesse, z. B. eine Adhäsion-Rezeptor. Die untersuchten Rezeptoren in den zwei interagierenden Zellen mit zwei spektral getrennte fluoreszierende Proteine (FPs), von der intrazellulären gekennzeichnet sind (siehe Abbildung 1A).
Die eingesetzten Methoden basieren auf der statistischen Auswertung der Fluoreszenz Schwankungen induziert durch die diffusive Bewegung von fluoreszierenden Fusionsproteinen durch die fokalen Volumen von einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop. Mehr im Detail Sonden der Assay die Co Diffusion der Proteine des Interesses an beiden benachbarten PMs an den Zell-Zell-Kontakten. Wenn die Proteine Trans Interaktionen durchmachen, tragen diese Trans -komplexe fluoreszierende Proteine in beiden spektralen Kanälen ausstrahlen, wodurch korrelierte Fluoreszenz Schwankungen der beiden Strahler. Auf der anderen Seite, wenn keine Bindung auftritt, werden die Nummer Schwankungen der Proteine in PMs vor, verursacht keine korrelierten Schwankungen unabhängig. Die Übernahme kann auf zwei Arten durchgeführt werden: 1) sFCCS basiert auf einer linienförmigen Scan über die Zell-Zell-Kontakt und effektiv Sonden die Interaktionen in einem Ort befindet sich im Kontaktbereich. Durch eine zeitliche Analyse der Fluoreszenz Schwankungen informiert sFCCS auch Dynamik, d. h. die Diffusionskoeffizienten von Proteinkomplexen; (2) CcN & B basiert auf eine pixelweise Analyse einer Sequenz von Bildern bei der Zell-Zell-Kontaktbereichen erworben. Es hat Fähigkeit, Sonde und Karte Interaktionen entlang der gesamten Region (in einer Bildebene) zu kontaktieren, aber liefert keine Informationen auf Dynamik. Beide Methoden sind kombinierbar mit einer Analyse der molekularen Helligkeit, d. h. die durchschnittliche Fluoreszenzsignal einzelne diffundierende Proteinkomplexe in der Zeiteinheit abgegebene und geben damit Schätzungen der Stöchiometrie von Proteinkomplexen im Zell-Zell-Kontakte.
In diesem Artikel bieten wir ausführliche Protokolle zur Probenvorbereitung, Kalibrierung, Datenerfassung und Analyse durchführen den vorgestellten Test auf eine kommerzielle konfokale Laser-scanning-Mikroskop. Die Experimente können auf jedem Instrument ausgestattet mit Photon counting oder analogen Detektoren und einem Objektiv mit hoher numerischer Apertur durchgeführt werden. Weiter wichtige Schritte des Protokolls zu diskutieren und mehrere Prozesse verursacht artifizielle Signalschwankungen, z. B. Detektor Lärm, Immunofluoreszenz oder Zelle Bewegung Korrektur Regelungen vorsehen. Entwickelt um die Wechselwirkungen zwischen adhärente Zellen Sonde, Assays für Aussetzung Zellen geändert werden kann, oder angepasst Modell Membran-Systeme, z. B. giant Unilamellar Vesikeln (GUVs) oder riesigen Plasma Membranvesikel (GPMVs), so dass die Quantifizierung von Interaktionen in verschiedenen Lipid-Umgebungen oder in Ermangelung einer organisierten Zytoskelett12,13.
Scannen Kreuzkorrelation Fluoreszenzspektroskopie ist eine modifizierte Version der Fluoreszenz-Spektroskopie Kreuzkorrelation14 und wurde speziell für die Sonde langsam diffusiven Dynamik in Lipid-Membranen-15. Es basiert auf einer Linie Scan Akquisition senkrecht zur PM mit fluoreszierenden Proteinen von Interesse. Um Wechselwirkungen zwischen zwei unterschiedlich beschriftete Protein Arten Sonde, erfolgt die Übernahme in zwei Spektralkanäle mit zwei Laser-Linien und zwei Erkennung Fenster für die spektral getrennte Fluorophore. Durch die langsame Diffusion Dynamik von Proteinen in der PM (D≤ ~ 1 µm2/s), eine Cross-Talk-freie Messung kann durch den Wechsel der Erregung System von Linie auf15Linie durchgeführt werden. Die Analyse beginnt mit: (1) eine Ausrichtung Algorithmus Korrektur der seitlichen Zellbewegung basierend auf abschnittsweise durchschnittlich ~ 1000 Zeilen, (2) die Bestimmung der Position mit maximale Fluoreszenz-Signald.h. die Uhr Position, in jedem Block und (3) verschieben alle Blöcke bis hin zum gemeinsamen Ursprung12,15, in jeden Kanal separat. Anschließend wird eine automatische Auswahl der Pixel entspricht der PM durchgeführt, indem der Zentralregion aus einem "glockenförmig" Anfall von der Summe aller ausgerichteten Linien (z. B. Zentrum ± 2.5σ). Integration des Signals in jeder Zeile ergibt die Membran Fluoreszenz Zeitreihen F(t) in jedem Kanal (g = Grün-Kanal, R = Rot-Kanal). Beachten Sie, dass die Pixelgröße klein genug, z. B. muss < 200 nm, die Form des Punktes zu rekonstruieren Funktion zu verbreiten und finden Sie ihre Mitte, entsprechend der Position des Premierministers. In Gegenwart von erheblichen Immunofluoreszenz Fluoreszenz Zeitreihen in jedem Kanal können mit einer Doppel-exponential-Funktion modelliert und dann mit der folgenden Formel korrigiert:16
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq2.jpg">.    (1)
Es ist wichtig zu beachten, dass diese Formel effektiv korrigiert die Amplituden und Diffusionszeiten aus der Korrelationsanalyse von F(t)c, im Vergleich zu Parameterschätzungen, die sich aus der unkorrigierte F(t)würde. Dann das Auto und Kreuzkorrelation Funktionen (ACFs / CCFs) der Fluoreszenz Signale werden berechnet:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq3v2.jpg">, (2).
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq4v2.jpg">, (3).
wo δFich = Fich(t) - <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img> Fich(t)<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg"> </img> und ich = g, R.
Eine zweidimensionale Diffusion Modell ist dann auf alle Korrelation Funktionen (CFs) ausgestattet:
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq7.jpg">.   (4)
Dabei bezeichnet N die Anzahl der fluoreszierende Proteine in der Beobachtung Volumen und τd Diffusionszeit für jeden Kanal. Dieses Modell berücksichtigt, dass in der beschriebenen experimentellen Einstellung Diffusion von Proteinen in der Uhr tritt in der X-Z-Ebene, im Gegensatz zu der häufig verwendete Konfiguration der Fluoreszenz Korrelation Spektroskopie (FCS) auf Membranen sondieren Experimente Verbreitung in der X-y-Ebene die konfokale Volumen17. Die Taille w0 und der Struktur Faktor S, beschreibt die Dehnung von fokalen Volumen in Z, S wZ = wZ/w0, stammen aus einer Punkt-FCS Kalibrierung Messung mit spektral ähnliche Farbstoffe und gleichen optischen Einstellungen durchgeführt mit bereits vorhandenen Werten für den Diffusionskoeffizienten DFarbstoff:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq8.jpg">, (5).
wo τd, Farbstoff die gemessene durchschnittliche Verbreitung der Farbstoffmoleküle anpassen eines Modells zur dreidimensionalen Diffusion an den Daten entnommen ist Berücksichtigung Konto Übergänge von einem Bruchteil T aller N Moleküle zu einem Triplett-Zustand mit einer Zeitkonstante ττ:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq9.jpg">.   (6)
Schließlich sind die Diffusionskoeffizienten (D), molekulare Helligkeitswerte (ε) und die relative Kreuzkorrelation von sFCCS Daten (rel.cc.) wie folgt berechnet:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq10.jpg">, (7).
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq11.jpg">, (8).
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq12.jpg">, (9).
Wo befindet sich die Amplitude der Kreuzkorrelation Funktion Güberqueren(0) und <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq14.jpg"> ist die Amplitude der Autokorrelationsfunktion in der ich-th Kanal.
Diese Definition der relativen Kreuzkorrelation, d. h. mit max statt in der Gleichung 9 bedeuten berücksichtigt, die die maximale Anzahl von komplexen zwei Protein-Arten in unterschiedlichen Konzentrationen von begrenzt ist die in einer geringeren Anzahl vorkommenden Arten.
Kreuzkorrelation Anzahl und Helligkeit basiert auf einen Augenblick Analyse der Fluoreszenzintensität für jeden Bildpunkt ein Bildstapel erwarb im Laufe der Zeit an einer festen Position in der Probe in der Regel bestehend aus ca. 100-200 Bildern, mit zwei spektralen Kanäle () g = Grün-Kanal, R = Rot-Kanal). Aus dem zeitlichen Mittelwert <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img>ich<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg">ich und Varianz <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq16.jpg"> </img>, die molekulare Helligkeit εi und Nummer nich werden in jedem Pixel und Spektralkanal berechnet (Ich = g, R)18:
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq20.jpg">, (10).
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq21.jpg">. (11)
Es ist wichtig zu beachten, dass im Idealfall eine wahre Photon counting Detektor Formeln zuweisen. Für analoge Systeme gelten die folgenden Gleichungen19,20:
<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq22.jpg">, (12).
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq23.jpg">.   (13)
Hier, S ist der Umrechnungsfaktor zwischen erkannten Photonen und die aufgezeichneten digitalen Grafen <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> ist das Auslesen Rauschen und Offset bezieht sich auf den Detektor Intensität Offset. Im Allgemeinen sollten diese Mengen für jeden Melder, basierend auf der Messung der Detektor Varianz als eine Funktion der Intensität für stetigen Beleuchtung19, z. B. einer reflektierenden Metalloberfläche oder getrocknete Farbstofflösung kalibriert werden. Der Versatz kann durch Messung der Pulsrate für eine Probe ohne Anregungslicht bestimmt werden. Durch die Durchführung einer linearen Regression der Detektor-assoziierten Varianz <img alt="Equation 25" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq25.jpg"> versus Intensität (ich) Grundstück, S und <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> ermittelten19werden können:
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq27.jpg">.   (14)
Zu guter Letzt die Kreuzkorrelation Helligkeit wird in jedem Pixel berechnet und versteht man im Allgemeinen als21
<img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq28.jpg">, (15).
wo <img alt="Equation 29" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq29.jpg"> ist die Kreuz-Varianz <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq30.jpg"> </img>.
Zur langlebige Schwankungen zu filtern, werden alle CcN & B Berechnungen durchgeführt nach einem Güterwagen, Filterung, unabhängig für jedes Pixel-22. Kurz, ni, εich (Ich = g, f) und Bcc in Schiebe-Segmente von z. B. 8-15 Frames berechnet. Die so erhaltenen Werte können dann gemittelt werden, um das letzte Pixel Anzahl und Helligkeit Werte zu erhalten.
Stöchiometrie-Analyse Um die Stöchiometrie der Proteinkomplexe an den Zell-Zell-Kontakten abschätzen zu können, kann die molekulare Helligkeit separat in jedem spektralen Kanal für die sFCCS oder CcN & B Daten analysiert werden. In sFCCS erhält man einen Helligkeitswert pro Messung in jedem Kanal. In CcN & B erhält man ein Histogramm Helligkeit alle Pixel, die die Zell-Zell-Kontakt und der durchschnittliche (oder mittlere) Wert kann als repräsentative Helligkeit für die Messung verwendet werden. Durch die Ausführung der gleichen Analyse auf eine Monomere Referenz können alle Helligkeitswerte normalisiert werden, um den durchschnittlichen Oligomere Zustand der erkannten Proteinkomplexe direkt zu erhalten. An dieser Stelle ist es wichtig, auf das Vorhandensein von nicht-fluoreszierende FPs zu korrigieren, die zu einer Unterschätzung der oligomere Zustand führen kann. Dies erfolgt in der Regel durch die Messung der Helligkeit von einem Homo-dimeres Referenz Protein23,24 mit einfarbigen sFCS oder Nummer und Helligkeit (N & B).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:596px;" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM growth medium</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-01548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-35500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P10-023100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TurboFect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:95px;">DSMZ</td>
			<td style="width:119px;">ACC 635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Alexa Fluor 488 NHS Ester</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Alderich</td>
			<td style="width:119px;">83689-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid DNA</td>
			<td style="width:95px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:95px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35-mm glass bottom dishes</td>
			<td style="width:95px;">CellVis</td>
			<td style="width:119px;">D35-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM780 confocal</td>
			<td style="width:95px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MATLAB software package</td>
			<td style="width:95px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">&#160;2015b&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Neubauer cell counting chamber</td>
			<td style="width:95px;">Marienfeld</td>
			<td align="right" style="width:119px;">640110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts

Eine Vielzahl von biologischen Prozessen umfasst Zell-Zell-Interaktionen, in der Regel vermittelt durch Proteine, die an der Schnittstelle zwischen benachbarten Zellen interagieren. Von Interesse sind nur einige Proben in der Lage, speziell solche Interaktionen direkt in lebenden Zellen zu sondieren. Hier präsentieren wir Ihnen einen Test um die Bindung der Proteine an den Oberflächen von benachbarten Zellen, Zell-Zell Kontakte zu messen. Dieser Test besteht aus zwei Schritten: Mischen von Zellen mit dem Ausdruck der Proteine des Interesses mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen verschmolzen, gefolgt von Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Messungen bei Zell-Zell-Kontakte mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop. Wir zeigen die Machbarkeit des Assays in einem biologisch relevanten Kontext durch die Messung der Wechselwirkungen von Amyloid Vorläufer-Like Protein 1 (APLP1) über Zell-Zell-Verbindungen. Wir bieten detaillierte Protokolle über die Datenerfassung mit Fluoreszenz-basierte Techniken (Scannen Kreuzkorrelation Fluoreszenzspektroskopie, Kreuzkorrelation Anzahl und Helligkeit Analyse) und den gewünschten Gerätes Kalibrierungen. Darüber hinaus diskutieren wir wichtige Schritte in der Datenanalyse und Gewusst wie: identifizieren und beheben Sie externe, falsche Signal Variationen, wie Sie durch Immunofluoreszenz oder Zelle Bewegung.
Im Allgemeinen der vorgestellte Test gilt für alle Homo- oder Zellkulturmodells Proteinprotein Interaktion auf Zell-Zell Kontakte zwischen den Zellen der gleichen oder unterschiedlichen Typen und kann auf eine kommerzielle konfokale Laser-scanning-Mikroskop implementiert werden. Eine wichtige Voraussetzung ist die Stabilität des Systems, das muss ausreichen, um die Sonde diffusiven Dynamik der interessierenden Proteine über mehrere Minuten.

Ein erster Test für die Protein-Protein-Interaktion-Assay von Zellen mit dem Ausdruck spektral unterschiedliche fluoreszierende Proteine, gefolgt von sFCCS/CcN & B Messungen (Abbildung 1), d. h. mischen durchgeführt werden auf Proteine, die nicht zu erwarten ist bei der Zell-Zell-Kontakt (d. h. eine Negativkontrolle) interagieren. Daher HEK 293T Zellen mit dem Ausdruck Myristoylated-Palmitoylated-mEYFP (Myr-Palm-mEYFP) oder -mCardinal wurd...

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A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Dieses Protokoll beschreibt einen Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie basierende Ansatz zur Untersuchung von Interaktionen zwischen den Proteinen, die Vermittlung von Zell-Zell-Interaktionen, d.h. Proteine in der Zelle Verzweigungen direkt in lebenden Zellen lokalisiert. Wir bieten detaillierte Richtlinien auf Kalibrierung, Datenerfassung und -Analyse, einschließlich Korrekturen möglich Artefakt Quellen.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Zell-zu-Zell-Interaktionsfeld zu verstehen, z. B. welche Rezeptoren Adhäsion oder Erkennung in Zell-zu-Zell-Kontakten vermitteln und ob bestimmte Liganden ihre Wechselwirkungen auslösen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es ermöglicht, solche Wechselwirkungen direkt in lebenden Zellen zu untersuchen, ohne dass eine Zellfixierung oder -störung erforderlich ist. Obwohl diese Methode verwendet wird, um Wechselwirkungen zwischen kultivierten Zellen zu untersuchen, kann es auch auf andere Systeme Monomembran-Vesikeln oder sogar kleine Modellorganismen angewendet werden.Im Allgemeinen sollten Personen, die neu bei dieser Methode sind, überprüfen, ob ihre Probe stabil genug ist, um eine Erfassung über ein paar Minuten zu ermöglichen, indem sie die Zellbewegung sorgfältig und langsame Signalvariationen überprüfen. Erstens, Samen der entsprechenden Anzahl von Zellen in mindestens vier Brunnen einer Sechs-Well-Platte einen Tag vor der Transfektion. Kultur die Zellen bei 37 Grad Celsius 5%Kohlendioxid in DMEM Medium ergänzt mit 10%FBS und 1%L-Glutamin.Um ein grundlegendes Experiment durchzuführen, transsektierende Plasmide für das Protein von Interesse verschmolzen zu einem grünen oder einem gelben fluoreszierenden Protein und einem roten fluoreszierenden Protein in separaten Brunnen. Nach vier Stunden entfernen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie jeden Brunnen sanft mit einem Milliliter PBS, ergänzt mit Magnesium und Kalzium tropfenden PBS auf der Brunnenkante, um eine Ablösung der Zellen während des Waschens zu verhindern. Entfernen Sie dann die PBS.Fügen Sie etwa 50 Mikroliter EDTA-Lösung Tropfen weise zu jedem Brunnen, um die Ablösung der Zellen zu erleichtern. Nach der Inkubation bei 37 Grad Celsius für zwei Minuten, langsam schütteln Sie die Sechs-Gut-Platte seitlich, um die Zellen zu lösen. Als nächstes fügen Sie 950 Mikroliter Wachstumsmedium zu jedem Brunnen hinzu und suspendieren Sie die Zellen, indem Sie ein paar Mal nach oben und unten pfeifen und dadurch alle Zellen vom Brunnenboden lösen.Stellen Sie sicher, dass Zellen ordnungsgemäß resuspendiert und voneinander getrennt werden, indem Sie visuell überprüfen, ob große Zellaggregate nach der Resuspension fehlen. Übertragen Sie die Zelllösung eines Brunnens auf den entsprechenden Brunnen. Mischen Sie sanft durch Pipettieren ein paar Mal nach oben und unten.Dann säen Sie die Mischzellen auf einer 35-Millimeter-Glasbodenschale und kultiieren die gesäten Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für einen Tag. In der Laserscanning Konfokalmikroskop-Software richten Sie den optischen Pfad. Um zu vermeiden, spektrale Übersprechen wählen Sie zwei separate Spuren zu begeistern und zu erkennen mEGFP oder mEYFP und mCherry oder mCardinal sequenziell und wählen Sie Switch Tracks jede Linie.Für die Erkennung sollten Sie geeignete Filter für beide Kanäle verwenden. Legen Sie die Schale mit den gemischten Zellen auf den Probenhalter. Nachdem Sie 10 Minuten gewartet haben, um den Temperaturausgleich zu gewährleisten und die Fokusdrift zu reduzieren, konzentrieren Sie sich auf die Zellen, indem Sie das Übertragungslicht im Menü Locate verwenden.Suchen Sie nach einem Paar roter und grüner Zellen, die miteinander in Kontakt sind. Wählen Sie als Nächstes einen Scanpfad senkrecht zum Zell-zu-Zellen-Kontakt mit der Schaltfläche Zuschneiden aus. Zoomen Sie, um eine Pixelgröße von 50 bis 200 Nanometern zu erreichen, und wählen Sie Linie im Scan-Modus aus.Legen Sie die Framegröße auf 128 x 1 Pixel fest. Legen Sie die Scangeschwindigkeit auf den maximal zulässigen Wert fest. Stellen Sie dann die Zyklen auf 100.000 bis 500.000.Wählen Sie anschließend die entsprechenden Laserstärken aus. Stellen Sie die Detektoren auf den Photonenzählmodus ein. Drücken Sie "Experiment starten", um die Erfassung zu starten.Exportieren Sie die Rohdatendateien in ein RGB-TIF-Bild im Rohdatenformat. Diese Datei enthält einen Kymographen mit den grünen und roten Kanaldaten im Kanal mit den Bezeichnungen G bzw. R des Bildes. Importieren Sie anschließend die TIF-Datei mit der entsprechenden Analysesoftware, und führen Sie die Analyse durch.Richten Sie die Linien aus, indem Sie einen segmentweisen Zeitdurchschnitt mit Blöcken von 500 bis 1000 Zeilen ausführen. Bestimmen Sie die Membranposition in jedem Block. Dann verschieben Sie alle Blöcke in die gleiche seitliche Position.Summieren Sie alle ausgerichteten Linien entlang der Zeitachse und passen Sie das durchschnittliche Intensitätsprofil mithilfe einer Gaußschen Funktion an. Definieren Sie die Pixel, die der Membran entsprechen, als alle Pixel innerhalb von plus oder minus 2,5 Sigma der Membranposition, und summieren Sie die Intensität dieser Pixel in jeder Linie, die einen einzelnen fluoreszierenden Signalwert für jeden Zeitpunkt erhält. Wenn Fotobleichungen beobachtet werden, wenden Sie eine Bleichkorrektur an, indem Sie die Membranfluoreszenzzeitreihe mit einer doppelten Exponentialfunktion ausstatten und die entsprechende Korrekturformel anwenden.Berechnen Sie die Auto- und Kreuzkorrelationsfunktionen entsprechend den entsprechenden Gleichungen. Um die Zuverlässigkeit der Analyse zu verbessern und Artefakte zu vermeiden, führen Sie die Berechnungen für 10 bis 20 gleiche Segmente der Gesamtmessung durch. Prüfen Sie die Fluoreszenzzeitreihen und Korrelationsfunktionen in jedem Segment und entfernen Sie deutlich verzerrte Segmente.Schließlich durchschnittlich alle nicht verzerrten Segmente. Bei der Analyse Ihrer Daten sollten Sie die Intensitätszeitreihen und Korrelationsfunktionen aus jedem Segment sorgfältig prüfen, um Verzerrungen zu vermeiden, z. B. durch intrazelluläre Vesikel in der Membranperipherie. Hier wird ein Intensitätsbild von HEK 293T-Zellen gezeigt, die myristolyated-palmitoylated-mEYFP oder mCardinal exdrücken.Eine relative Kreuzkorrelation nahe Null wurde beobachtet, während die Autokorrelationsfunktionen charakteristische Zerfallszeiten von 10 bis 20 Millisekunden für die Diffusion von myristolyated-palmitoylated-mEYFP und mCardinal in der Plasmamembran aufweisen. Die Kreuzkorrelationsfunktionen der sFCCS-Messungen von HEK 293T-Zellen, die membranverankerte Heterodimer-Myristolyated-Palmitoylated-mCardinal-mEYFP exdrückten, wiesen positive Amplituden auf und zeigten ähnliche Zerfallszeiten wie die Autokorrelationsfunktion. sFCCS-Messungen an Zell-zu-Zell-Kontakten zwischen APLP1-mEYFP und APLP1-mCardinal-exemitten Zellen führten zu einer positiven relativen Kreuzkorrelation von 0,45.Die sFCCS-Korrelationsfunktionen, die aus Messungen über APLP1-Cluster an Zell-Zell-Kontakten gewonnen wurden, zeigten eine stark reduzierte Dynamik, wie sie durch große Zerfallszeiten in den Schwingungen bei großen Verzögerungszeiten ersichtlich ist. Bei Zinkionenzugabe erhöhte sich die relative Kreuzkorrelation auf einen Durchschnittswert von 0,8. Darüber hinaus erhöhte sich die molekulare Helligkeit signifikant von kleinen Oligomeren auf größere Multimere, die aus 10 bis 50 Monomeren auf jeder Zelle bestehen.Vorübergehende Instabilitäten können zu einer Kreuzkorrelationsfunktion mit negativen Werten oder einer hohen falsch positiven Kreuzkorrelation führen. Die entsprechenden Korrelationsfunktionen weichen in der Regel stark von denen der meisten Segmente ab. Als komplementärer Ansatz zur sFCCS-Kreuzkorrelationszahl und -helligkeit kann verwendet werden, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erkennen.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Mischen von transfizierten Zellen ein kritischer Schritt ist. Mischen Sie die Zellen sanft und optimieren Sie die Transfektionseffizienz, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, rote und grüne Zellen in Kontakt zu finden. Nach ihrer Entwicklung wurde diese Technik von Forschern auf dem Gebiet der Immunologie verwendet, um die Wechselwirkungen von Signalmolekülen in immunologischen Synapsen zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Ein Fluoreszenz-basierte Assay von Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Forschung

Biochemie

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylierte Zelle eindringen Peptide, intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu studieren

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anwendung der Biolayer-Interferometrie (BLI) zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Einsatz der mikroskaligen Thermophorese zur Messung von Protein-Lipid-Wechselwirkungen

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Ein planarischer Motilitätstest zur Messung der biomodulierenden Eigenschaften natürlicher Produkte

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Spotvariations-Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie zur Analyse der molekularen Diffusion an der Plasmamembran lebender Zellen

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...