Name: a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts
Uploaded: 2018-12-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

עבודה זו מומן בחלקו על ידי דויטשה פתוח (DFG) להעניק 254850309. המחברים מודים Luckner מכירה את מאדלן על קריאה ביקורתית של כתב היד.

1. הכנה לדוגמה: תא-תא ערבוב Assay
הערה: פרוטוקול הבאים מתאר את תהליך ערבוב עבור תאים חסיד. זה עשוי להיות שונה עבור תאים תרבותי ההשעיה.
<ol><li>זרע מספר מתאים של תאים על צלחת 6-ובכן, למשל, 800,000 HEK 293T תאים (החשבת נויבאואר ספירת קאמרית), יום לפני תרביות תאים. המספר שניתן לשנות בהתאם הז...

ההליך ניסיוני המתוארים כאן מאפשר החקירה של חלבון טרנס אינטראקציות תא-תא באנשי קשר, העסקת פלורסצנטיות תנודות ספקטרוסקופיה טכניקות, כלומר sFCCS, ccN & B. שיטות אלה כוללות ניתוח סטטיסטי של תנודות פלורסצנטיות הנפלטים על ידי שני FPs spectrally מופרדים דבוקה protein(s) עניין אצל איש קשר של שני תאים סמוכים, ...

תהליכים ביולוגיים רבים להתרחש בכל האתרים של תא-תא אינטראקציות, למשל, תא-תא אדהזיה1,2,3, תא-cell fusion4 וזיהוי הסלולר5. אירועים כאלה חשובים במיוחד במהלך הפיתוח של אורגניזמים רב תאיים, תקשורת, למשל, במהלך תגובות מערכת החיסון. תהליכים אלה הם בדרך כלל בתיווך חלבונים אשר מותאמים על פני השטח, קרי, ב קרום פלזמה (PM) של תאים שכנים ומבצעת אינטראקציות ספציפיות-הקשר תא-תא כי הם בדיוק הזמן והמרחב מוסדר. במקרים רבים, אינטראקציות אלה ישירה הומו - או אינטראקציות חלבון heterotypic טרנס , אך עשוי גם לכלול יונים או ליגנדים מתנהג כמו linkers חוץ-תאי1. למרות חשיבות היסוד, יש מחסור של מבחני הבדיקה אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפי אלה ישירות בסביבה הטבעית של תאים חיים. שיטות רבות דורשות גם לשבירת תאים (למשל, הביוכימי מבחני כגון co-immunoprecipitation6), קיבעון (למשל, כמה טכניקות במיקרוסקופ אופטי סופר רזולוציה ו מיקרוסקופ אלקטרונים של תא-תא קשר7), או שאינם ספציפיים, כגון: צבירת / מבחני אדהזיה8,9. כדי להתגבר על בעיה זו, טכניקות קרינה פלואורסצנטית יושמו מבוסס על קרינה פלואורסצנטית תהודה אנרגיה העברה (סריג)10 או קרינה פלואורסצנטית קומפלמנטציה11. עם זאת, כדי להשיג מספיק קטן המרחקים בין fluorophores, שיטות אלה דורשים תוויות פלורסנט בצד חוץ-תאי של חלבונים10, פוטנציאל מתנגש עם טרנס אינטראקציות.
כאן, אנו מציגים חלופי המבוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית assay עבור אינטראקציות חלבון-חלבון תא-תא באנשי קשר. גישה זו משלבת גישות קרוס-המתאם קרינה פלואורסצנטית (סריקה קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה (sFCCS), מספר קרוס-המתאם ואת הבהירות (ccN & B)), ערבוב של תאים המבטאים בונה פיוז'ן של החלבון של . עניין, למשל, קולטן אדהזיה. קולטני ובדוקים בתאים שמעצבת שני מסומנות עם שני חלבונים פלורסנט spectrally מופרדים (FPs), מתאיים הצד (ראה איור 1 א').
השיטות מועסקים מבוססים על ניתוח סטטיסטי של תנודות פלורסצנטיות המושרה על ידי התנועה דיפוזיה של פיוז'ן פלורסנט חלבונים דרך נפח מוקד של לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ סורק. יותר בפירוט, וזמינותו רגשים פעפוע שיתוף של החלבונים עניין במחזור שני שכנים תא-תא באנשי קשר. אם החלבונים עוברים אינטראקציות טרנס , אלה מתחמי טרנס ויישא חלבונים פלורוסנט פולטות בשני ערוצים ספקטרלי, גורם תנודות פלורסצנטיות מתואם של שנינו פולטים. מצד שני, אם הכריכה לא מתרחשת, מספר תנודות של חלבונים מול PMs תהיה עצמאית, גורם תנודות לא מתואם. הרכישה יכול להתבצע בשתי דרכים: 1) sFCCS מבוסס על סריקה בצורת קו לאורך הקשר תא-תא, רגשים ביעילות את האינטראקציות במקום הממוקמים באזור הקשר. דרך ניתוח הטמפורלי של תנודות פלורסצנטיות, sFCCS מספקת גם מידע dynamics, קרי, מקדמי דיפוזיה של מתחמי חלבון; 2) ccN & B מבוססת על ניתוח pixel-wise של רצף של תמונות רכשה את האזורים קשר תא-תא. יש יכולת בדיקה של אינטראקציות מפה לאורך כל קשר עם איזור (ב מישור מוקד אחד), אך אינו מספק מידע על דינמיקה. שתי השיטות יכול להיות משולב עם ניתוח של הבהירות מולקולרית, קרי, האות הממוצע פלורסצנטיות הנפלטת ביחידת זמן אחת מתחמי חלבון באמצעי ולספק, לפיכך, הערכות של סטויכיומטריה של מתחמי חלבון- תא-תא אנשי קשר.
במאמר זה, אנו מספקים נתונים היסטוריים פרוטוקולים עבור הכנת הדוגמא, כיול המכשיר, רכישת נתונים וניתוח לבצע את הבדיקה הציג על לייזר קונפוקלי מסחרי מיקרוסקופ סורק. ניתן לבצע את הניסויים על כל כלי מצויד פוטון לספור או גלאי אנלוגי ולא אובייקטיבית עם מפתח נומרי גבוהה. אנו עוד יותר לדבר על שלבים קריטיים של הפרוטוקול, לספק ערכות תיקון עבור מספר תהליכי גורם תנודות אות artefactual, למשל, גלאי רעש, תנועה photobleaching או תא. פותח במקור כדי לחקור את האינטראקציות בין תאים חסיד, וזמינותו עשוי להיות שונה עבור השעיה תאים, או הותאם מודל ממברנה מערכות, למשל, unilamellar ענק שלפוחית (כשמרוגזים) או פלזמה ענקית קרום שלפוחית (GPMVs), המאפשר כימות של אינטראקציות בסביבות השומנים שונה או בהיעדר שלד התא מאורגן12,13.
סריקת קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה גירסה שונה של קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה14 , תוכננה במיוחד כדי לחקור דינמיקה דיפוזיה איטית השומנים ממברנות15. הוא מבוסס על רכישה סריקה קו בניצב רה מ המכיל את החלבונים פלואורסצנט עניין. כדי לחקור אינטראקציות של שני המינים חלבון שונה שכותרתו, הרכישה מתבצעת בשני ערוצים ספקטרלי באמצעות שני קווי לייזר, שני חלונות איתור עבור fluorophores spectrally מופרדים. בשל הדינמיקה דיפוזיה איטית של חלבונים ברה מ (D≤ ~ 1 /s2מיקרומטר), מידה קרוס-לדבר נטול יכול להתבצע על ידי לסירוגין את ערכת עירור משורת בשורה15. הניתוח מתחיל עם: 1) תיקון אלגוריתם יישור לתנועה לרוחב התא מבוסס על block-wise בממוצע של ~ 1000 שורות, 2) קביעת המיקום עם פלורסצנטיות המרביכלומר הממשלה מיקום האות, בכל בלוק, 3) הסטה של כל הבלוקים על נפוצות מקור12,15, בנפרד בכל אחד מהערוצים. לאחר מכן, מבחר אוטומטית של פיקסלים רה מ מתבצע על-ידי בחירה באזור המרכז התאמה לפי עקומת גאוס הסיכום של כל הקווים מיושר (קרי, מרכז ± 2.5σ). שילוב של האותות בכל שורה התשואות ממברנה פלורסצנטיות סדרת הזמן F(t) בכל אחד מהערוצים (g = ירוק ערוץ, r = הערוץ האדום). שים לב כי גודל פיקסל חייב להיות קטן מספיק, למשל, < 200 ננומטר, לשחזר את צורת הנקודה להפיץ את הפונקציה ולמצוא את המרכז שלו, המתאים למיקום של ראש הממשלה. בנוכחות photobleaching משמעותית, סדרת הזמן פלורסצנטיות בכל אחד מהערוצים ייתכן המודל עם פונקציה מעריכית-כפול ויש לאחר מכן תוקן עם הנוסחה הבאה:16
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq2.jpg">.    (1)
חשוב לציין כי נוסחה זו מתקנת ביעילות amplitudes והן דיפוזיה פעמים המתקבל ניתוח המתאם של F(t)c, לעומת הערכות פרמטר זה ניתן להשיג את שלא תוקנו F(t). ואז, הפונקציות אוטומטי - ואת הצלב-קורלציה (ACFs / CCFs) של קרינה פלואורסצנטית החישוב של אותות:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq3v2.jpg">, (2).
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq4v2.jpg">, (3).
איפה אלפאFאני = Fאני(t) - <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img> Fאני(t)<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg"> </img> , ואני = g, r.
מודל דו מימדי דיפוזיה מצויד ואז המתאם לכל הפונקציות (CFs):
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq7.jpg">.   (4)
כאן, N מציין את מספר חלבונים פלורסנט אמצעי תצפית, τd הזמן דיפוזיה לכל ערוץ. מודל זה לוקח בחשבון כי בהגדרה ניסיוני המתואר, דיפוזיה של חלבונים ברה מ מתרחשת בתוך המטוס x-z, בניגוד נפוץ התצורה של המתאם פלורסצנטיות ספקטרוסקופיה (FCS) ניסויים ממברנות חיטוט דיפוזיה במישור x-y של נפח קונאפוקלית17. המותניים w0 והגורם מבנה S, המתארת את התארכות wz של אמצעי האחסון נקודתית ב- z, S = wz/w0, מתקבלים מ כיול נקודת FCS מדידה המבוצעת עם spectrally דומים צבעי והגדרות באותו האופטי באמצעות הערכים הזמינים כבר מקדם דיפוזיה Dצבע:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq8.jpg">, (5).
איפה τd, צבע זה הזמן נמדד פיזור ממוצע של מולקולות צבען, המתקבל מתאים למודל תלת מימדי דיפוזיה בנתונים, לוקח לתוך חשבון מעברים של השבר T של כל המולקולות N שלישיה המדינה עם קבוע הזמן ττ:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq9.jpg">.   (6)
לבסוף, דיפוזיה (D), ערכי הבהירות מולקולרית (חדוה) והקבוע יחסית קרוס-הקורלציה של נתונים sFCCS (rel.cc.) מחושבים כדלהלן:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq10.jpg">, (7).
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq11.jpg">, (8).
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq12.jpg">, (9).
Gקרוס(0) איפה משרעת הפונקציה קרוס-קורלציה, <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq14.jpg"> הוא משרעת הפונקציה autocorrelation בערוץ אני-th.
הגדרה זו של יחסי קרוס-המתאם, קרי שימוש מרבי במקום כלומר המשוואה 9, לוקח בחשבון את המספר המרבי של קומפלקסים של חלבונים שני מינים נוכח בריכוזים שונים הוא מוגבל על ידי מינים נוכח מספר נמוך יותר.
בהירות ומספר צלב-המתאם מבוסס על ניתוח רגע של עוצמת קרינה פלואורסצנטית לכל פיקסל של אוסף תמונות רכשה במשך הזמן במיקום קבוע במדגם, המורכב בדרך כלל ~ 100-200 מסגרות, עם שני ספקטרלי ערוצי ( g = ירוק ערוץ, r = הערוץ האדום). מהממוצע טמפורלית <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img>אני<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg">, ואני השונות <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq16.jpg"> </img>, הבהירות מולקולרית חדוהi ואת מספר nאני מחושבים ב כל פיקסל וערוץ ספקטרלי (אני = g, r)18:
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq20.jpg">, (10).
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq21.jpg">. (11)
חשוב לציין כי המשוואות נתון חלים במקרה האידיאלי של גלאי ספירת פוטון אמיתי. עבור מערכות זיהוי אנלוגי, המשוואות הבאות חלות19,20:
<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq22.jpg">, (12).
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq23.jpg">.   (13)
כאן, S הוא הגורם המרה בין פוטונים שזוהו הסעיפים דיגיטלי מוקלטות, <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> הוא רעש readout ואת היסט מתייחס ההיסט בעוצמה גלאי. באופן כללי, כמויות אלה צריכים להיות מכויל, עבור כל סוג הגלאי, המבוססת על מדידת השונות גלאי כפונקציה של עוצמת תאורה קבועה19, למשל, משטח מתכת רעיוני או פתרון דיי יבשים. היסט יכול להיקבע על ידי מדידת שיעור ספירה עבור דגימה ללא עירור אור. על ידי ביצוע רגרסיה ליניארית של השונות הקשורות גלאי <img alt="Equation 25" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq25.jpg"> לעומת העוצמה (אני) העלילה, S ו <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> יכול להיות נחוש19:
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq27.jpg">.   (14)
בסופו של דבר, הבהירות קרוס-המתאם מחושב בתוך כל פיקסל ולא מוגדר באופן כללי כמו21
<img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq28.jpg">, (15).
איפה <img alt="Equation 29" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq29.jpg"> הוא קרוס-השונות <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq30.jpg"> </img>.
על מנת לסנן תנודות חיים ארוכים, כל ccN & B החישובים מבוצעים בעקבות קרון מטען סינון, באופן עצמאי עבור כל פיקסל22. בקצרה, ni, חדוהאני (אני = g, r) ו- Bcc מחושבים בהזזה מקטעים של למשל, 8-15 מסגרות. הערכים שהושג ובכך להיות בממוצע אז כדי להשיג הפיקסל האחרון מספר וערכי בהירות.
ניתוח סטויכיומטריה כדי לאמוד את סטויכיומטריה של חלבון מתחמי תא-תא באנשי קשר, הבהירות מולקולרית ניתן בנפרד לנתח בכל אחד מהערוצים ספקטרליות עבור sFCCS או ccN & B נתונים. ב- sFCCS, מתקבל ערך הבהירות אחד לכל מדידה בכל ערוץ. ב ccN & B, היסטוגרמה הבהירות של פיקסלים כל הקשר תא-תא מתקבל, הערך הממוצע (או החציוני) יכול לשמש נציג בהירות למדידה. על ידי ביצוע הניתוח אותו על הפניה monomeric, כל ערכי הבהירות יכול להיות מנורמל להשיג ישירות מדינת oligomeric הממוצע מתחמי חלבון שזוהו. בנקודה זו, חשוב לתקן לנוכחות של FPs שאינו-פלורסנט שעלולים לגרום underestimation המדינה oligomeric. זה מתבצע בדרך כלל על ידי מודדים את הבהירות הפניה ההומו-dimeric חלבון23,24 באמצעות sFCS צבע אחד או מספר והבהירות (N & B).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:596px;" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM growth medium</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-01548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-35500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P10-023100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TurboFect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:95px;">DSMZ</td>
			<td style="width:119px;">ACC 635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Alexa Fluor 488 NHS Ester</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Alderich</td>
			<td style="width:119px;">83689-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid DNA</td>
			<td style="width:95px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:95px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35-mm glass bottom dishes</td>
			<td style="width:95px;">CellVis</td>
			<td style="width:119px;">D35-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM780 confocal</td>
			<td style="width:95px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MATLAB software package</td>
			<td style="width:95px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">&#160;2015b&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Neubauer cell counting chamber</td>
			<td style="width:95px;">Marienfeld</td>
			<td align="right" style="width:119px;">640110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts

מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים כרוך תא-תא אינטראקציות, מתווך בדרך כלל על ידי חלבונים המקיימים אינטראקציה בין תאים שכנים. עניין, רק כמה מבחני מסוגלים במיוחד חיטוט כזה אינטראקציות ישירות בתאים חיים. כאן, אנו מציגים assay כדי למדוד את הכריכה של חלבונים באה לידי ביטוי על פני השטח של התאים הסמוכים, תא-תא באנשי קשר. Assay זו מורכבת משני שלבים: ערבוב של תאים המבטאים את החלבונים עניין התמזגו חלבונים שונה פלורסנט, ואחריו קרינה פלואורסצנטית תנודות ספקטרוסקופיה מדידות-תא-תא אנשי קשר באמצעות לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ סורק. נדגים את הכדאיות של זה וזמינותו בהקשר רלוונטי מבחינה ביולוגית על ידי מודד את האינטראקציה של החלבון קודמן דמוי עמילואיד 1 (APLP1) על פני תאים תאים צמתי. אנו מספקים פרוטוקולים מפורט על רכישת נתונים באמצעות טכניקות מבוססות קרינה פלואורסצנטית (סריקה קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה, קרוס-קורלציה למספר וניתוח בהירות) את הכיול כלי הנדרש. יתר על כן, נדון שלבים קריטיים ניתוח הנתונים וכיצד לזהות ולפתור וריאציות אות חיצוני, כדין, כגון אלה עקב photobleaching או תא תנועה.
באופן כללי, וזמינותו הציג ישימה לכל הומו - או אינטראקציית חלבון heterotypic תא-תא באנשי קשר, בין תאים סוגים זהים או שונים, יכול להיות מיושם על לייזר קונפוקלי מסחרי מיקרוסקופ סורק. דרישה חשובה היא היציבות של המערכת, אשר צריך להיות מספיק לחקור דינמיקה דיפוזיה של החלבונים עניין במשך מספר דקות.

מבחן ראשון עבור אינטראקציית חלבון-חלבון וזמינותו, קרי, ערבוב של תאים המבטאים חלבונים פלורסנט ברורים spectrally, ואחריו sFCCS/ccN & B מדידות (איור 1), צריכה להתבצע על חלבונים אשר אינם אמורים אינטראקציה-הקשר תא-תא (קרי, פקד שלילי). לכן, HEK 293T תאים myristoylated-palmitoylated-...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

פרוטוקול זה מתאר פלורסצנטיות תנודות מבוסס-ספקטרוסקופיה בגישה לחקור אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תא-תא אינטראקציות, כלומר חלבונים מותאם צמתי תא, ישירות בתאים חיים. אנו מספקים הנחיות מפורט על מכשיר כיול, חדרי קירור והקפאה, ניתוח, כולל תיקונים למקורות אפשריים החפץ.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

שיטה זו יכולה לעזור להבין שאלות מפתח בשדה האינטראקציה בין תא לתא, כגון אילו קולטנים מתווים הידבקות או זיהוי באנשי קשר מתא לתא והאם ליגנדים ספציפיים מפעילים את האינטראקציות שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחקור אינטראקציות כאלה ישירות בתאים חיים ללא צורך בקיבוע תאים או הפרעה. למרות שיטה זו משמשת כדי לחקור אינטראקציות בין תאים מתורבתים, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות mono-קרום ורייקים או אפילו אורגניזמים מודל קטן.בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו צריכים לבדוק כי המדגם שלהם הוא יציב מספיק כדי לאפשר רכישה על פני כמה דקות על ידי בדיקה זהירה של תנועת התא וריאציות אות איטי. ראשית, לזרוע את המספר המתאים של תאים לפחות ארבע בארות של צלחת שש בארות ביום לפני transfection. תרבו את התאים ב 37 מעלות צלזיוס 5%פחמן דו חמצני ב- DMEM בינוני בתוספת 10% FBS ו 1%L-גלוטמין.כדי לבצע ניסוי בסיסי לבצע פלסמידים transfect עבור החלבון של עניין התמזגו חלבון פלואורסצנטי ירוק או צהוב חלבון פלואורסצנטי אדום בארות נפרדות. לאחר ארבע שעות להסיר את מדיום הצמיחה ולשטוף כל גם בעדינות עם מיליליטר אחד של PBS בתוספת מגנזיום וסידן הטלת PBS על הקצה היטב כדי למנוע ניתוק של התאים במהלך הכביסה. לאחר מכן הסר את ה- PBS.הוסף כ 50 microliters של פתרון EDTA טיפה חכם לכל באר כדי להקל על ניתוק של התאים. לאחר הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות, לאט לנער את הצלחת שש בארות באופן מאוחר כדי לנתק את התאים. לאחר מכן, להוסיף 950 microliters של צמיחה בינוני לכל באר resuspend התאים על ידי pipetting כמה פעמים למעלה ולמטה ובכך לנתק את כל התאים מלמטה היטב.ודא שהתאים יתווספו מחדש כראוי וינותקו זה מזה על-ידי בדיקה חזותית של היעדר צבירות תאים גדולות לאחר ההתכוונות מחדש. העבר את פתרון התא של באר אחת ל הבאר המתאימה. מערבבים בעדינות על ידי צינורות כמה פעמים למעלה ולמטה.ואז לזרוע את התאים המעורבים על צלחת תחתונה זכוכית 35 מילימטר ותרבות התאים זרעים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני ליום אחד. בתוכנת מיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר להגדיר את הנתיב האופטי. כדי להימנע מצלב ספקטרלי, בחרו שתי רצועות נפרדות כדי לרגש ולזהות mEGFP או mEYFP ו-mCherry או mCardinal ברצף ובחרו 'החלף רצועות בכל קו'.לצורך הזיהוי השתמש במסננים המתאימים עבור שני הערוצים. מניחים את המנה המכילה את התאים המעורבים על מחזיק הדגימה. לאחר המתנה של 10 דקות כדי להבטיח שיווי משקל טמפרטורה ולהפחית את סחף המיקוד, התמקד בתאים באמצעות אור השידור בתפריט איתור.חפש זוג תאים אדומים וירוקים במגע זה עם זה. לאחר מכן, בחר נתיב סריקה בניצב ליצירת קשר בין תא לתא באמצעות לחצן חתוך. הגדל כדי להשיג גודל פיקסל של 50 עד 200 ננומטר ובחר קו במצב סריקה.הגדר את גודל המסגרת ל- 128 בפיקסל אחד. הגדר את מהירות הסריקה לערך המרבי המותר. לאחר מכן הגדר מחזורים ל- 100, 000 עד 500, 000.לאחר מכן, בחר את כוחות הלייזר המתאימים. הגדר את הגלאים למצב ספירת פוטון. לחץ על התחל ניסוי כדי להתחיל את הרכישה.יצא את קובצי הנתונים הגולמיים לתדמית RGB TIF בתבנית נתונים גולמית. קובץ זה יכיל קימוגרף עם נתוני הערוץ הירוק והדדום בערוץ המונשם G ו- R של התמונה, בהתאמה. לאחר מכן, יבא את קובץ ה- TIF עם תוכנת הניתוח המתאימה והמשך לבצע את הניתוח.ישר את הקווים על-ידי ביצוע ממוצע זמן מבחינת מקטע עם בלוקים של 500 עד 1000 שורות. קבע את מיקום הממברנה בכל בלוק. לאחר מכן הסט את כל הבלוקים לאותה תנוחה משנית.סכם את כל הקווים המיושרים לאורך ציר הזמן והתאים לפרופיל העוצמה הממוצע באמצעות פונקציה גאוסיאנית. הגדר את הפיקסלים המתאימים לממברנה כפיקסלים בתוך פלוס או מינוס 2.5 סיגמא של מיקום הממברנה, וסכם את עוצמת הפיקסלים האלה בכל שורה כדי לקבל ערך אות פלואורסצנטי יחיד עבור כל נקודת זמן. אם נצפתה הלבנת תמונות, החל תיקון הלבנה על-ידי התאמת סדרת זמן פלואורסצנטיות הממברנה עם פונקציה מעריכית כפולה והחלת נוסחת התיקון המתאימה.חשב את פונקציות המתאם האוטומטי וההצלבה בהתאם למשוואות המתאימות. כדי לשפר את מהימנות הניתוח ולהימנע ממצאים לבצע את החישובים עבור 10 עד 20 מקטעים שווים של המדידה הכוללת. בדוק את סדרות הזמן והמתאם של הפלואורסצנטיות בכל מקטע והסר מקטעים מעוותים בבירור.לבסוף, ממוצע כל המקטעים שאינם מעוותים. בעת ניתוח הנתונים שלך, בדוק בזהירות את עוצמת סדרות הזמן ואת פונקציות המתאם מכל מקטע כדי למנוע עיוותים, למשל, עקב ורירית תאית בפריפריה של הממברנה. תמונה עוצמתית של תאי HEK 293T המבטאים את מיריסטילציה-פלמיוליט-mEYFP או mCardinal מוצגת כאן.מתאם צולב יחסי קרוב לאפס נצפה בעוד פונקציות התיקון האוטומטי מראות זמני ריקבון אופייניים של 10 עד 20 אלפיות השניה עבור דיפוזיה של מיריסטילציה-palmitoylated-mEYFP ו mCardinal בממברנה פלזמה. הפונקציות חוצות המתאם של מדידות sFCCS של תאי HEK 293T המבטאים הטרודימר מעוגן קרום מיריסטוליטציה-palmitoylated-mCardinal-mEYFP היו משרעת חיובית והראה זמני ריקבון דומים כמו פונקציית תיקון אוטומטי. מדידות sFCCS באנשי קשר בין תא לתא בין תאי APLP1-mEYFP ו- APLP1-mCardinal-ביטוי הביאו למתאם חיובי יחסית של 0.45.פונקציות המתאם sFCCS שהתקבלו ממדידות על פני אשכולות APLP1 באנשי קשר תא-תא הראו דינמיקה מופחתת מאוד כפי שניכר פעמים ריקבון גדולות בתנודות בזמני השהיה גדולים. בתוספת יון אבץ, המתאם הנגדי היחסי עלה לערך ממוצע של 0.8. בהמשך הבהירות המולקולרית גדלה באופן משמעותי מאוליגודרים קטנים למולטימרים גדולים יותר המורכבים מ-10 עד 50 מונומרים בכל תא.אי-יציבות ארעית עלולה לגרום לפונקציה חוצת-מתאם עם ערכים שליליים או מתאם חיובי כוזב גבוה. פונקציות המתאם המתאימות בדרך כלל חורגות מאוד מאלה של רוב המקטעים. כגישה משלימה למספר מתאם צולב של sFCCS ובהירות ניתן להשתמש כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון.בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור כי ערבוב של תאים מנוקטים הוא צעד קריטי. מערבבים בעדינות את התאים ומייעלים את יעילות ההמרה כדי להגדיל את הסיכוי למצוא תאים אדומים וירוקים במגע. לאחר התפתחותה נעשה שימוש בטכניקה זו על ידי חוקרים בתחום האימונולוגיה כדי לחקור את האינטראקציות של מולקולות איתות בסינאפסות אימונולוגיות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Assay מבוסס-הקרינה של פעילות פוספוליפידים Scramblase

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

שימוש בתרמופורזה מיקרומטרית למדידת אינטראקציות בין חלבון לליפיד

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

תסה תנוענות פלנרית כדי לאמוד את המאפיינים של מודולים ביולוגיים של מוצרים טבעיים

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית של וריאציה נקודתית לניתוח דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...