Name: a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts
Uploaded: 2018-12-01T13:00:00
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Questo lavoro è stato parzialmente supportato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) concedere 254850309. Gli autori ringraziano Madlen Luckner per lettura critica del manoscritto.

1. preparazione del campione: Cella di miscelazione dosaggio
Nota: Il seguente protocollo descrive la procedura di miscelazione per le celle aderenti. Può essere modificato per le cellule coltivate in sospensione.
<ol><li>Un numero adeguato di cellule su una piastra a 6 pozzetti, per esempio, 800.000 cellule HEK 293T (contati con un Neubauer camera di conteggio), un giorno prima di transfezione del seme. Il numero può essere modificato a seconda del periodo tra la semina e la tran...

La procedura sperimentale descritta qui permette l'indagine su proteine trans interazioni a contatti cellula-cellula, che impiegano tecniche di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione, vale a dire sFCCS e ccN & B. Questi metodi implicano un'analisi statistica delle fluttuazioni di fluorescenza emessa da FPs spettralmente separati due fusi per la proteina di interesse a un contatto di due cellule vicine, ognuno esprimendo la una o l'altra proteina di fusione. La presenza di complessi trans è quantifi...

Molti processi biologici verificano presso i siti delle interazioni cellula-cellula, per esempio, cellula-cellula adesione1,2,3, cellula-cellula fusion4 e riconoscimento cellulare5. Tali eventi sono particolarmente importanti durante lo sviluppo degli organismi multicellulari e per la comunicazione cellula-cellula, per esempio, durante le risposte immunitarie. Questi processi sono in genere mediati dalle proteine che sono localizzate alla superficie, cioè, alla membrana del plasma (PM) delle cellule vicine e sottoposti a specifiche interazioni al contatto cellula-cellula che sono precisamente regolamentato in spazio e tempo. In molti casi, queste interazioni sono diretto omo - o eterotipiche interazioni della proteina-proteina trans , ma possono anche coinvolgere gli ioni o ligandi che agiscono come linker extracellulare1. Sebbene di fondamentale importanza, c'è una mancanza di saggi sondando queste interazioni proteina-proteina specifica direttamente nell'ambiente nativo di cellule viventi. Molti metodi di distruzione cellulare (ad es., analisi biochimiche come co-immunoprecipitazione6), richiedono la fissazione (ad es., alcune delle tecniche di Super-risoluzione microscopia ottica e microscopia elettronica delle cellule contatti7), o sono non-specifici, ad esempio, aggregazione / adesione saggi8,9. Per ovviare a questo problema, sono state implementate tecniche di fluorescenza basata sulla fluorescenza resonance energy transfer (FRET)10 o fluorescenza complementazione11. Tuttavia, per raggiungere distanze sufficientemente piccole tra fluorofori, questi metodi richiedono etichette fluorescenti sul lato extracellulare delle proteine10, potenzialmente interferenti con interazioni di trans .
Qui, presentiamo un'analisi di fluorescenza-basata alternativa per le interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula. Questo approccio combina approcci di cross-correlazione di fluorescenza (scansione spettroscopia di correlazione di fluorescenza (sFCCS), numero di cross-correlazione e luminosità (ccN & B)) e la miscelazione delle cellule che esprimono un costrutto di fusione della proteina di interesse, ad esempio, un recettore di adesione. I recettori studiati nelle due cellule interagenti sono etichettati con due proteine fluorescenti spettralmente separate (FPs), dall'intracellulare (Vedi Figura 1A).
I metodi impiegati sono basati sull'analisi statistica delle fluttuazioni di fluorescenza indotta dal movimento diffusivo delle proteine di fusione fluorescenti attraverso il volume focale di un microscopio a scansione confocale del laser. Più in dettaglio, il test sonde co-diffusione delle proteine di interesse in entrambi vicini PMs a contatti cellula-cellula. Se le proteine subiscono interazioni trans , questi complessi trans porterà proteine fluorescenti che emettono in entrambi i canali spettrali, causando fluttuazioni di fluorescenza correlata di entrambi gli emettitori. D'altra parte, se si verifica alcuna associazione, le fluttuazioni numero di proteine nell'affrontare PMs sarà indipendente, non causando fluttuazioni correlate. L'acquisizione può essere eseguita in due modi: 1) sFCCS si basa su una scansione a forma di linea attraverso il contatto cellula-cellula e sonde in modo efficace le interazioni in un punto situato nella regione del Contatta. Attraverso un'analisi temporale delle fluttuazioni di fluorescenza, sFCCS fornisce anche informazioni dinamiche, cioè, i coefficenti di diffusione dei complessi della proteina; 2) ccN & B si basa su un'analisi di immagine di una sequenza di immagini acquisite presso le regioni di contatto cellula-cellula. Esso ha la capacità di sondare e mappa interazioni lungo tutta la regione (in un piano focale) di contatto, ma non fornisce informazioni sulle dinamiche. Entrambi i metodi possono essere combinati con un'analisi della luminosità molecolare, cioè, il segnale di fluorescenza media emessa nell'unità di tempo da complessi proteici diffusore singolo e, quindi, fornire stime della stechiometria dei complessi della proteina a contatti cellula-cellula.
In questo articolo, forniamo dettagliati protocolli per la preparazione del campione, calibrazione dello strumento, acquisizione dati e analisi ad eseguire l'analisi presentata su un commerciale scansione microscopio confocale del laser. Gli esperimenti possono essere eseguiti su qualsiasi strumento dotato di conteggio di fotoni o rivelatori analogici e un obiettivo con apertura numerica elevata. Abbiamo ulteriormente discutere passaggi critici del protocollo e forniscono schemi di correzione per diversi processi che causano fluttuazioni artefactual segnale, ad esempio, rivelatore rumore, movimento photobleaching o cella. Originariamente sviluppato per sondare le interazioni tra cellule aderenti, il dosaggio può essere modificato per cellule in sospensione, o adattati ai sistemi di membrane modello, ad esempio, le vescicole unilamellari gigante (GUV) o plasma gigante vescicole di membrana (GPMVs), che consente la quantificazione delle interazioni in lipidi diversi ambienti o in assenza di un citoscheletro organizzato12,13.
Spettroscopia di correlazione di fluorescenza di scansione è una versione modificata di spettroscopia di correlazione di fluorescenza14 ed è stato specificamente progettato per sonda dinamica diffusiva lenta del lipido membrane15. Si basa su un'acquisizione di scansione linea perpendicolare al PM contenenti le proteine fluorescenti di interesse. Per sondare le interazioni delle due specie di proteina marcata in modo diverso, l'acquisizione viene eseguita in due canali spettrali utilizzando due linee laser e due finestre di rilevamento per fluorofori spettralmente separati. A causa della dinamica lenta diffusione di proteine nel PM (D≤ ~ 1 µm2/s), una misura di cross-talk-free possa essere eseguita alternando lo schema di eccitazione da linea a linea15. L'analisi inizia con: 1) un algoritmo di allineamento correggere per movimento laterale cellulare basato su block-wise con una media di ~ 1000 righe, 2) determinazione della posizione con fluorescenza massimo segnale, cioè, il PM posizione ogni blocco e 3) mutevole di tutti i blocchi per una comune origine12,15, separatamente in ciascun canale. Quindi, una selezione automatica dei pixel corrispondenti al PM viene eseguita selezionando la regione centrale da una vestibilità gaussiana della somma di tutte le linee allineate (cioè, centro ± 2.5σ). Integrazione del segnale in ogni linea produce la serie temporale fluorescenza a membrana f (t) in ciascun canale (g = verde canale, r = canale rosso). Nota che la dimensione in pixel deve essere abbastanza piccola, ad esempio, < 200 nm, per ricostruire la forma del punto di diffondere funzione e trovare il suo centro, corrispondente alla posizione del PM. In presenza di sostanziale photobleaching, le serie temporali di fluorescenza in ciascun canale possono essere modellate con una funzione di doppio-esponenziale e poi corretto con la seguente formula:16
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq2.jpg">.    (1)
È importante notare che questa formula corregge efficacemente sia le ampiezze e tempi di diffusione ottenuti da analisi di correlazione di f (t)c, rispetto alle stime dei parametri che si otterrebbe dalla non corretta f (t). Quindi, le funzioni di auto - e cross-correlazione (ACFs / CCFs) della fluorescenza segnali vengono calcolati:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq3v2.jpg">, (2).
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq4v2.jpg">, (3).
dove δFho = Fio(t) - <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img> Fio(t)<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg"> </img> ed io = g, r.
Un modello bidimensionale diffusione è poi montato su tutte le funzioni di correlazione (CFs):
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq7.jpg">.   (4)
Qui, N indica il numero di proteine fluorescenti nel volume di osservazione e τd il tempo di diffusione per ogni canale. Questo modello prende in considerazione che in ambito sperimentale descritto, diffusione delle proteine nel PM si verifica nel piano x-z, in contrasto con la configurazione comunemente usata di correlazione di fluorescenza spettroscopia (FCS) esperimenti sulle membrane di sondaggio diffusione nel piano x-y del confocale volume17. La vita w0 e il fattore di struttura S, descrivendo l'allungamento wz del volume focale in z, S = wz/w0, sono ottenuti da una misura di calibrazione punto FCS effettuata con coloranti spettralmente simili e stesse impostazioni ottiche utilizzando valori già disponibili per il coefficente di diffusione Dtintura:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq8.jpg">, (5).
dove τd, colorante è il tempo di diffusione medio misurato delle molecole della tintura, ottenuta da un modello tridimensionale diffusione ai dati, di montaggio tenendo le transizioni di conto di una frazione T di tutte le molecole di N per un stato di tripletto con una costante di tempo ττ:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq9.jpg">.   (6)
Infine, i coefficenti di diffusione (D), i valori di luminosità molecolare (ε) e la relativa correlazione incrociata dei dati sFCCS (rel.cc.) sono calcolati come segue:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq10.jpg">, (7).
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq11.jpg">, (8).
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq12.jpg">, (9).
dove Gcross(0) è l'ampiezza della funzione di correlazione incrociata e <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq14.jpg"> è l'ampiezza della funzione di autocorrelazione nel canale dei -esima.
Questa definizione della relativa correlazione incrociata, cioè utilizzando max invece di dire all'equazione 9, tiene conto del fatto che il numero massimo dei complessi di due specie proteiche presenti alle concentrazioni differenti è limitato per il specie presenti in un numero inferiore.
Luminosità e il numero di Cross-correlazione si basa su un'analisi del momento dell'intensità di fluorescenza per ogni pixel di una serie di immagini acquisite nel tempo ad un in posizione fisso nel campione, costituiti in genere da ~ 100-200 fotogrammi, con due spettrali canali ( g = verde canale, r = canale rosso). Dalla media temporale <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img>ho<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg">e la varianza <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq16.jpg"> </img>, la luminosità molecolare εi e numero nmi vengono calcolate in ogni pixel e canale spettrale (io = g, r)18:
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq20.jpg">, (10).
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq21.jpg">. (11)
È importante notare che le equazioni determinate si applicano al caso ideale di un vero rilevatore photon-counting. Per sistemi di rivelazione analogica, le seguenti equazioni applicano19,20:
<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq22.jpg">, (12).
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq23.jpg">.   (13)
Qui, S è il fattore di conversione tra fotoni rilevati ed i conteggi digitali registrati, <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> è il rumore di lettura e offset si riferisce all'offset di intensità del rivelatore. Generalmente, queste quantità devono essere calibrate, per qualsiasi tipo di rivelatore, basato su misura la varianza del rivelatore in funzione dell'intensità per illuminazione costante19, ad esempio, una superficie di metallo riflettente o soluzione colorante secchi. L' offset può essere determinato misurando la velocità di conteggio per un campione senza luce di eccitazione. Eseguendo una regressione lineare della varianza rivelatore-associated <img alt="Equation 25" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq25.jpg"> versus trama di intensità (mi), S e <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> può essere determinato19:
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq27.jpg">.   (14)
Infine, la luminosità di cross-correlazione è calcolata in ogni pixel ed è definita in generale come21
<img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq28.jpg">, (15).
dove <img alt="Equation 29" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq29.jpg"> è la croce-varianza <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq30.jpg"> </img>.
Per filtrare le fluttuazioni longeve, tutti ccN & calcoli B vengono eseguiti seguendo un vagone coperto del filtro, in modo indipendente per ogni pixel22. Brevemente, ni, εho (ho = g, r) e Bcc sono calcolati in segmenti di ad esempio, 8-15 infissi scorrevoli. I valori così ottenuti possono essere fatte la media poi per ottenere il pixel finale numero e la luminosità.
Analisi di stechiometria Al fine di stimare la stechiometria dei complessi della proteina a contatti cellula-cellula, la luminosità molecolare possa essere analizzata separatamente in ciascun canale spettrale per il sFCCS o ccN & dati B. In sFCCS, si ottiene un valore di luminosità per misura in ciascun canale. In ccN & B, si ottiene un istogramma di luminosità di tutti i pixel corrispondenti al contatto cellula-cellula e il valore medio (o mediano) può essere utilizzato come luminosità rappresentativo per la misurazione. Eseguendo la stessa analisi su un riferimento monomerico, tutti i valori di luminosità possono essere normalizzati per ottenere direttamente lo stato oligomerico medio dei complessi proteici rilevati. A questo punto, è importante correggere per la presenza di FPs non fluorescente che può comportare una sottovalutazione dello stato oligomerico. Questo viene in genere eseguito misurando la luminosità di un homo-dimerica riferimento proteina23,24 utilizzando SFC un colore o numero e luminosità (N & B).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:596px;" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM growth medium</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-01548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-35500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P10-023100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TurboFect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:95px;">DSMZ</td>
			<td style="width:119px;">ACC 635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Alexa Fluor 488 NHS Ester</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Alderich</td>
			<td style="width:119px;">83689-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid DNA</td>
			<td style="width:95px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:95px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35-mm glass bottom dishes</td>
			<td style="width:95px;">CellVis</td>
			<td style="width:119px;">D35-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM780 confocal</td>
			<td style="width:95px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MATLAB software package</td>
			<td style="width:95px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">&#160;2015b&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Neubauer cell counting chamber</td>
			<td style="width:95px;">Marienfeld</td>
			<td align="right" style="width:119px;">640110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts

Una varietà di processi biologici coinvolge interazioni cellula-cellula, in genere mediati dalle proteine che interagiscono a livello di interfaccia tra le cellule vicine. Di interesse, solo pochi saggi sono in grado di sondare specificamente tali interazioni direttamente nelle cellule viventi. Qui, presentiamo un test per misurare l'associazione di proteine espresse sulle superfici delle cellule vicine, a contatti cellula-cellula. Questo test è costituito da due passaggi: miscelazione delle cellule che esprimono le proteine di interesse fusa a diverse proteine fluorescenti, seguita da misure di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione a contatti cellula-cellula utilizzando un microscopio a scansione confocale del laser. Dimostriamo la fattibilità di questo test in un contesto biologicamente rilevante misurando le interazioni della proteina amiloide precursore-come 1 (APLP1) attraverso giunzioni della cellula-cellula. Forniamo protocolli dettagliati sull'acquisizione dati utilizzando tecniche basate sulla fluorescenza (scansione di spettroscopia di correlazione di fluorescenza, il numero di cross-correlazione e analisi di luminosità) e la taratura dello strumento richiesto. Ulteriormente, discutiamo passaggi critici nell'analisi dei dati e come identificare e correggere le variazioni di segnale esterno, spurie, come quelle dovute a movimenti photobleaching o cella.
In generale, il saggio presentato è applicabile a qualsiasi omo - o interazioni eterotipiche proteina-proteina a contatti cellula-cellula, fra le cellule dei tipi uguali o diversi e può essere implementato su un commerciale scansione microscopio confocale del laser. Un requisito importante è la stabilità del sistema, che deve essere sufficiente per sondare dinamica diffusiva delle proteine di interesse per diversi minuti.

Un primo test per il dosaggio di interazione proteina-proteina, cioè, miscelazione delle cellule che esprimono le proteine fluorescenti spettralmente distinte seguite da sFCCS/ccN & misure B (Figura 1), deve essere eseguita sulle proteine che non sono tenute a interagire al contatto cellula-cellula (cioè, un controllo negativo). Di conseguenza, le cellule HEK 293T che esprimono miristoilate-palmitoilata-mEYFP (myr-palm-mEYFP) o - mCardinal...

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A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Questo protocollo descrive un approccio di basato su spettroscopia di fluorescenza fluttuazione per indagare le interazioni tra proteine che mediano interazioni cellula-cellula, cioè proteine localizzate nelle giunzioni delle cellule, direttamente nelle cellule viventi. Forniamo le linee guida dettagliate sulla calibrazione dello strumento, acquisizione dati e analisi, comprese le correzioni al fonti possibili manufatto.

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Questo metodo può aiutare a comprendere le domande chiave nel campo dell'interazione da cellula a cellula, ad esempio quali recettori mediano l'adesione o il riconoscimento nei contatti da cellula a cellula e se ligandi specifici innescano le loro interazioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di indagare tali interazioni direttamente nelle cellule viventi senza bisogno di fissazione o interruzione cellulare. Sebbene questo metodo sia usato per studiare le interazioni tra cellule coltivate, può anche essere applicato ad altri sistemi vescicole mono-membrana o anche piccoli organismi modello.Generalmente gli individui nuovi a questo metodo dovrebbero verificare che il loro campione sia abbastanza stabile da consentire l'acquisizione per alcuni minuti ispezionando attentamente il movimento cellulare e le variazioni di segnale lente. In primo luogo, seminare il numero appropriato di cellule in almeno quattro pozzi di una piastra di sei po 'al giorno prima della trasfezione. Coltura delle cellule a 37 gradi Celsius 5% di anidride carbonica nel mezzo DMEM integrato con 10%FBS e 1%L-glutammina.Per eseguire un esperimento di base trasfetto plasmidi per la proteina di interesse fuso a una proteina fluorescente verde o gialla e una proteina fluorescente rossa in pozzi separati. Dopo quattro ore rimuovere il mezzo di crescita e lavarlo delicatamente con un millilitro di PBS integrato con PBS in caduta di magnesio e calcio sul bordo del pozzo per evitare il distacco delle cellule durante il lavaggio. Quindi rimuovere il PBS.Aggiungere circa 50 microlitri di soluzione EDTA per rilasciare saggiamente ad ogni pozzo per facilitare il distacco delle cellule. Dopo aver incubato a 37 gradi Celsius per due minuti, agitare lentamente la piastra a sei po 'lateralmente per staccare le cellule. Successivamente, aggiungere 950 microlitri di mezzo di crescita a ciascun pozzo e rimorsi le cellule con pipettando alcune volte su e giù staccando così tutte le cellule dal fondo del pozzo.Assicurarsi che le celle vengano rimorsi correttamente e scollegate l'una dall'altra verificando visivamente l'assenza di aggregati di celle di grandi dimensioni dopo la sospensione. Trasferire la soluzione cellulare di un pozzo al pozzo corrispondente. Mescolare delicatamente pipettando un paio di volte su e giù.Quindi seminare le cellule miste su un piatto inferiore di vetro da 35 millimetri e coltura delle cellule sementi a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per un giorno. Nel software di microscopio confocale a scansione laser impostare il percorso ottico. Per evitare il crosstalk spettrale, selezionare due tracce separate per eccitare e rilevare mEGFP o mEYFP e mCherry o mCardinal in sequenza e selezionare Cambia traccia ogni linea.Per il rilevamento utilizzare filtri appropriati per entrambi i canali. Posizionare il piatto contenente le celle miste sul portacampioni. Dopo aver atteso 10 minuti per garantire l'equilibrio della temperatura e ridurre la deriva di messa a fuoco, concentrati sulle celle utilizzando la luce di trasmissione nel menu Individua.Cercare una coppia di celle rosse e verdi a contatto tra loro. Selezionare quindi un percorso di analisi perpendicolare al contatto da cella a cella utilizzando il pulsante Ritaglia. Ingrandisci per ottenere una dimensione in pixel da 50 a 200 nanometri e seleziona Linea in modalità scansione.Impostare le dimensioni del fotogramma su 128 per un pixel. Impostare la velocità di scansione sul valore massimo consentito. Quindi impostare i cicli su 100.000 a 500.000.In seguito, scegli i poteri laser appropriati. Impostare i rilevatori sulla modalità Conteggio fotoni. Premere Avvia esperimento per avviare l'acquisizione.Esportare i file di dati non elaborati in un'immagine TIF RGB in formato dati non elaborati. Questo file conterrà un kymograph con i dati del canale verde e rosso nel canale vengono definiti rispettivamente G e R dell'immagine. Successivamente, importare il file TIF con il software di analisi appropriato e procedere all'esecuzione dell'analisi.Allineare le linee eseguendo una media del tempo per segmenti con blocchi da 500 a 1000 linee. Determinare la posizione della membrana in ogni blocco. Quindi spostare tutti i blocchi nella stessa posizione laterale.Somma tutte le linee allineate lungo l'asse del tempo e adatta il profilo di intensità media usando una funzione gaussiana. Definire i pixel corrispondenti alla membrana come tutti i pixel all'interno di più o meno 2,5 sigma della posizione della membrana e sommare l'intensità di questi pixel in ogni linea ottenendo un singolo valore del segnale fluorescente per ogni punto di tempo. Se si osserva lo sbiancamento fotografico, applicare una correzione di sbiancamento adattando le serie temporali a fluorescenza della membrana con una doppia funzione esponenziale e applicando la formula di correzione appropriata.Calcolare le funzioni di correlazione automatica e incrociata in base alle equazioni appropriate. Per migliorare l'affidabilità dell'analisi ed evitare artefatti eseguire i calcoli per 10-20 segmenti uguali della misurazione totale. Ispezionare le serie temporali di fluorescenza e le funzioni di correlazione in ogni segmento e rimuovere segmenti chiaramente distorti.Infine, media tutti i segmenti non distorti. Durante l'analisi dei dati, ispezionare attentamente le serie temporali di intensità e le funzioni di correlazione di ogni segmento per evitare distorsioni, ad esempio, dovute a vescicole intracellulari nella periferia della membrana. Un'immagine di intensità delle cellule HEK 293T che esprimono myristolyated-palmitoilated-mEYFP o mCardinal è mostrata qui.È stata osservata una relativa correlazione incrociata vicina allo zero, mentre le funzioni di autocorrelazione mostrano tempi di decadimento caratteristici da 10 a 20 millisecondi per la diffusione di mEYFP miristoliato-palmitoilato e mCardinal nella membrana plasmatica. Le funzioni di correlazione incrociata delle misurazioni sFCCS delle cellule HEK 293T che esprimono cellule eterodimero ancorate a membrana mioripoliato-palmitoilato-mCardinal-mEYFP avevano ampiezze positive e mostravano tempi di decadimento simili a quello della funzione di autocorrelazione. Le misurazioni sFCCS su contatti da cella a cella tra cellule APLP1-mEYFP e APLP1-mCardinal-expressing hanno portato a una correlazione incrociata relativa positiva di 0,45.Le funzioni di correlazione sFCCS ottenute dalle misurazioni su cluster APLP1 a contatti cellulare-cella hanno mostrato dinamiche fortemente ridotte come evidente da grandi tempi di decadimento nelle oscillazioni in grandi tempi di ritardo. Al momento dell'aggiunta di ioni di zinco, la relativa correlazione incrociata è aumentata ad un valore medio di 0,8. Inoltre la luminosità molecolare aumentò significativamente da piccoli oligomeri a multimeri più grandi costituiti da 10 a 50 monomeri su ogni cellula.Le instabilità transitorie possono comportare una funzione di correlazione incrociata con valori negativi o un'alta correlazione incrociata falso positivo. Le corrispondenti funzioni di correlazione in genere si discostano fortemente da quelle della maggior parte dei segmenti. Come approccio complementare al numero di correlazione incrociata sFCCS e alla luminosità può essere utilizzato per rilevare interazioni proteina-proteina.Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che la miscelazione di cellule trasfette è un passaggio critico. Mescolare delicatamente le cellule e ottimizzare le efficienze di trasfezione per aumentare la possibilità di trovare cellule rosse e verdi a contatto. Dopo il suo sviluppo questa tecnica è stata utilizzata dai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare le interazioni delle molecole di segnalazione nelle sinapsi immunologiche.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Un test fluorescenza a base di fosfolipidi Scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Ricerca

Biochimica

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated Cell-penetrating peptidi per studiare le interazioni proteina-proteina intracellulare

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Utilizzo In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer per studiare la dinamica dei complessi della proteina ad una scala di tempo di millisecondo

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Applicazione dell'interferometria biostrato (BLI) per lo studio delle interazioni tra proteine e proteine nella trascrizione

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Valutazione delle interazioni tra proteine e proteine utilizzando una tecnica di digestione On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Uso della termoforesi su microscala per misurare le interazioni proteina-lipidi

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Un'analisi planaria di Motility per misurare le proprietà biomodulanti dei prodotti naturali

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot per l'analisi della diffusione molecolare sulla membrana plasmatica di cellule viventi

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...