Name: a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts
Uploaded: 2018-12-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

이 작품은 부분적으로 도이치 가운데 (DFG)에 의해 지원 254850309를 부여. 저자는 원고의 중요 한 독서에 대 한 Madlen Luckner 감사합니다.

1. 시료 준비:-셀 혼합 분석 결과
참고: 다음 프로토콜 부착 셀 혼합 절차를 설명합니다. 그것은에 경작 하는 셀에 대 한 수정할 수 있습니다.
<ol><li>6 잘 플레이트, 예를 들어, 800000 HEK 293T 세포 (Neubauer 챔버 계산으로 계산), transfection 전에 하루에 셀의를 적절 한 수 씨 수 시드 및 transfection 사이의 시간에 따라 수정 하 고 다른 셀 형식에 대 한 조정 수 있습니다. 기본적인 ...

여기에 설명 된 실험 절차-셀 연락처, 형광 변동 분광학 기술을, 즉 sFCCS 및 ccN & B에서 트랜스 상호 작용 단백질-단백질의 조사를 수 이러한 방법은 두 괴기 하 게 분리 된 FPs 하나 또는 다른 융해 단백질을 표현 하는 각각 두 개의 인접 셀의 연락처에 대 한 관심의 protein(s) 융합에 의해 방출 되는 형광 변동에 대 한 통계 분석을 포함 한다. 트랜스 복합물의 존재는 이웃 PMs에서 단백질의 ...

많은 생물학 과정 세포 세포 상호 작용, 예를 들어, 셀 접착1,2,3, 셀 셀 퓨전4 및 세포 인식5사이트에서 발생합니다. 이러한 이벤트는 특히 중요 한 다세포 생물의 세포-세포 커뮤니케이션, 예를 들어, 면역 반응 동안에 대 한 개발 중입니다. 이 프로세스는 일반적으로 즉, 이웃 세포의 원형질 막 (오후)에 표면에 지역화 되 고 규제에서 공간과 시간을 정확 하 게 세포 세포 접촉에서 특정 상호 작용을 받을 단백질에 의해 중재 됩니다. 대부분의 경우에서 이러한 상호 작용 직접 호모-또는 heterotypic 단백질-단백질 트랜스 상호 작용, 하지만 또한 이온 또는 extracellular 링커1로 작동 하는 ligands를 포함 될 수 있습니다. 비록 기본적인 중요성의, 살아있는 세포의 기본 환경에서 직접 이러한 특정 단백질-단백질 상호 작용을 조사 하는 분석 실험의 부족이 이다. 많은 방법 중 필요 셀 중단 (예, 생 화 확 적인 분석 실험 공동 immunoprecipitation6등), 고정 (예를 들어, 일부 최고 해결책 광학 현미경 검사 법 기술과 세포-세포의 전자 현미경의 7연락처), 또는 일반적인, 예를 들어, 집계 / 접착 분석 실험8,9. 이 문제를 해결 하려면 형광 기법 형광 공명 에너지 전달 (무서 워)10 또는 형광 보완성11기반으로 구현 되었습니다. 그러나, fluorophores 사이 충분히 작은 거리를 위해 이러한 메서드는 단백질10, 트랜스 상호 작용을 잠재적으로 방해의 extracellular 측에 형광 라벨 필요 합니다.
여기, 우리 셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용에 대 한 대체 형광 기반 분석 결과 제시. 이 방법은 결합 형광 크로스-상관 관계 접근 (검색 형광 교차 상관 분광학 (sFCCS), 교차 상관 번호와 밝기 (ccN & B))의 단백질의 융합 개념을 표현 하는 셀의 혼합 관심, 예를 들어, 접착 수용 체. 두 개의 상호 작용 세포에 조사 수용 체는 세포내에서 2 개의 괴기 하 게 분리 된 형광 성 단백질 (FPs), 표시 됩니다 ( 그림 1A참조) 사이드.
고용된 방법 confocal 레이저 스캐닝 현미경의 초점 볼륨을 통해 형광 성 융해 단백질의 방산 움직임에 의해 유도 된 형광 변동에 대 한 통계 분석을 기반으로 합니다. 더 자세히 분석 결과 프로브 셀 연락처에서 두 이웃 PMs에 관심사의 단백질의 공동 보급 합니다. 단백질 트랜스 상호 작용을 받을 경우이 트랜스 단지 두 스펙트럼 채널에 방출, 두에 미터의 상관된 형광 변화를 일으키는 형광 단백질을 수행 한다. 다른 한편으로, 아무 바인딩 경우 PMs를 직면 하 고 있는 단백질의 번호 변동 독립, 아무 상관된 변동 원인이 될 것입니다. 인수는 두 가지 방법으로 수행할 수 있습니다: 1) sFCCS-셀 접촉에서 선 모양의 검사에 근거 하 고 효과적으로 접촉 지역에 위치한 자리에 상호 작용을 조사. 형광 변화의 시간적 분석을 통해 sFCCS 또한 역학 정보를 제공 한다 즉, 단백질 복합물;의 확산 계수를 2) ccN & B 세포 세포 접촉 지역에서 취득 하는 이미지의 시퀀스에 대 한 pixel-wise 분석 기반으로 합니다. 프로브 하는 기능이 고 전체 따라 지도 상호 작용 영역 (하나의 초점 비행기), 문의 하지만 역학에 정보를 제공 하지 않습니다. 두 가지 방법, 즉, 평균 형광 신호 시간 단위에 단일 확산 단백질 복합물에 의해 방출 하 고, 따라서,에서 단백질 복합물의 산출할의 견적을 제공 분자 밝기의 분석 결합 될 수 있다 셀 연락처입니다.
이 문서에서 우리는 상업 confocal 레이저 스캐닝 현미경에 제시 분석 결과 수행 하기 위해 샘플 준비, 계측기 교정, 데이터 수집 및 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 모든 악기와 광자 계산 또는 아날로그 탐지기 높은 숫자 조리개와 목표에 실험을 수행할 수 있습니다. 우리 또한 프로토콜의 중요 한 단계를 토론 하 고 artefactual 신호 변동, 예를 들면, 감지기 소음, photobleaching 또는 셀 운동 발생 하는 여러 프로세스에 대 한 수정 계획을 제공 합니다. 원래 부착 세포 간의 상호 작용을 개발, 분석 결과 현 탁 액 셀을 수정할 수 있습니다 또는 적응 모델 멤브레인 시스템, 예를 들면, 거 대 한 unilamellar 소포 (GUVs) 또는 거 대 한 플라즈마 막 소포 (GPMVs), 수는 상호 작용 다른 지질 환경에서 또는 조직된 골격12,13의 부재에서 부 량이 고
형광 교차 상관 분광학 검색 형광 교차 상관 분광학14 의 수정된 된 버전 이며, 지질 막15의 느린 방산 역학 조사 하도록 특별히 설계 되었습니다. 그것은 관심의 형광 단백질을 포함 하는 오후에 수직 라인 스캔 수집을 기반으로 합니다. 2 개의 다르게 분류 단백질의 상호 작용을, 인수 spectrally 분리 fluorophores에 대 한 두 개의 레이저 라인 및 2 개의 검색 창을 사용 하 여의 스펙트럼 채널 두 개에서 수행 됩니다. 때문에 오후에 있는 단백질의 느린 유포 역학 (D≤ ~ 1 µ m2/s), 크로스 토크 무료 측정15라인을 라인에서 흥분 체계를 대체 하 여 수행할 수 있습니다. 로 시작 하는 분석: block-wise ~ 1000 라인, 2) 위치와 함께 최대 형광 신호즉, 오후, 각 블록에 위치 결정의 평균 3) 변화에 따라 측면 셀 운동 1) 정렬 알고리즘 수정 일반적인 기원12,15, 각 채널에 별도로 모든 블록의 다음, 오후에 해당 하는 픽셀의 자동 선택 모든 정렬된 라인 (즉, 센터 ± 2.5σ)의 합계의 가우스 적합에서 중앙 영역을 선택 하 여 수행 됩니다. 각 줄에 신호의 통합 수익률 막 형광 시계열 f (t) 각 채널에 (g = 녹색 채널, r = 빨강 채널). 픽셀 크기가 작은 만큼, 예를 들어, 수는 < 200 nm, 포인트의 형태를 재구성 하 기능을 확산 하 고에 해당 하는 오후의 위치는 센터. 상당한 photobleaching 존재 각 채널에서 형광 시계열 수 두 배 지 수 함수 모델링 있으며 다음 다음 수식을 사용 하 여 수정:16
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq2.jpg">.    (1)
이 수식은 효과적으로 진폭 및 확산 시간 f (t)c, f (t)교정된 얻어질 것 이다 매개 변수 추정에 비해의 상관 관계 분석에서 얻은 수정 주의에 중요 하다. 다음, 자동 및 교차 상관 기능 (ACFs / CCFs) 형광의 신호 계산 됩니다:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq3v2.jpg">(2)
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq4v2.jpg">(3)
여기서 δF나 Fi(t)-= <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img> Fi(t)<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg"> </img> 와 나 g, r=.
2 차원 확산 모델은 다음 모든 상관 관계 기능 (CFs)에 장착 되어:
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq7.jpg">.   (4)
여기, N 각 채널에 대 한 확산 시간 관찰 볼륨과 τd 에 형광 단백질의 수를 나타냅니다. 이 모델 고려는 설명된 실험 설정에서 x-z 평면에서 발생 하는 오후에 있는 단백질의 유포 형광 상관 관계의 일반적으로 사용 되는 구성 달리 분광학 (FCS) 실험 조사 하는 세포 막에 confocal 볼륨17의 x y 평면에서 보급. 허리 w0 와 구조 인자 S, 설명 하는 신장 z, S에에서 초점 볼륨의 wz = wz/w0, 괴기 하 게 비슷한 염료와 같은 광학 설정 포인트 FCS 교정 측정에서 얻을 수 있습니다 이미 사용 가능한 값을 사용 하 여 확산 계수에 대 한 D염료:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq8.jpg">(5)
τd, 염료는 피팅 데이터를 3 차원 확산에 대 한 모델에서 얻은 염료 분자의 측정 된 평균 보급 시간에 분수 모든 N 분자의 T 의 계정 전환으로 복용 한 시간 상수와 triplet 상태 ττ:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq9.jpg">.   (6)
마지막으로, 확산 계수 (D), 분자 명도 값 (ε) 및 sFCCS 데이터 (rel.cc.)의 상대 교차 상관은 다음과 같이 계산 됩니다.
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq10.jpg">(7)
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq11.jpg">(8)
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq12.jpg">(9)
어디 간 상관 함수의 진폭은 G크로스(0)와 <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq14.jpg"> i-번째 채널의 자기 상관 함수의 진폭은 이다.
이 정의 상대 교차 상관, 즉 의 최대 수식 9에 의미 를 대신 사용 하 여 고려는 단지 두 개의 단백질 종의 다양 한 농도의 최대 수에 의해 제한 됩니다는 낮은 번호에 종입니다.
교차 상관 수와 밝기 기반 샘플에서 고정된 위치에서 시간이 지남에 인수는 이미지 스택의 각 픽셀에 대 한 형광 강도의 순간 분석 일반적으로 100 ~ 200의 구성 된 프레임, 2 개의 스펙트럼 채널 ( g = 그린 채널, r = 빨강 채널). 시간적 의미에서 <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img>나<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg">나 및 분산 <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq16.jpg"> </img>, 분자 밝기 εi 및 숫자 n나 각 픽셀에 스펙트럼 채널 계산 됩니다 (나 = g, r)18:
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq20.jpg">(10)
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq21.jpg">. (11)
그것은 진정한 광자 계수 검출기의 이상적인 경우에는 주어진된 방정식 적용 해야 합니다. 아날로그 탐지 시스템에 대 한 다음 방정식19,20적용:
<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq22.jpg">(12)
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq23.jpg">.   (13)
여기, S는 감지 된 광자와 기록된 디지털 카운트 사이의 변환 계수 <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> 판독 소음 및 오프셋 검출기 강도 오프셋을 나타냅니다. 일반적으로, 이러한 수량 해야 될 보정, 꾸준한 조명19, 예를 들어, 반사 금속 표면 또는 말린된 염료 솔루션에 대 한 강도의 기능으로 측정 하는 검출기 편차에 따라 모든 검출기 종류에 대 한. 오프셋 은 여기 빛 없이 샘플 카운트 속도 측정 하 여 확인할 수 있습니다. 검출기 관련 분산의 선형 회귀를 수행 하 여 <img alt="Equation 25" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq25.jpg"> (나) 강도 플롯, S 대와 <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> 결정된19일 수 있다:
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq27.jpg">.   (14)
마지막으로, 교차 상관 밝기 각 픽셀에 계산 되 고21 으로 일반적 정의
<img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq28.jpg">(15)
어디 <img alt="Equation 29" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq29.jpg"> 크로스-분산은 <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq30.jpg"> </img>.
수명이 긴 동요를 필터링 하기 위해 모든 ccN & B 계산 수행 됩니다 다음 필터링 하지, 독립적으로 각 픽셀22기차. 간단히, ni, ε난 (나 = g, r)와 Bcc 슬라이딩의 예를 들어, 세그먼트 8-15 프레임에서 계산 됩니다. 이렇게 얻어진 값은 다음 값을 가져올 최종 픽셀 수와 밝기 평균 수 있습니다.
산출할 분석 셀 연락처에서 단백질 복합물의 산출할을 추정 하기 위해서는 분자 밝기는 sFCCS 또는 ccN & B 데이터에 대 한 각 스펙트럼 채널에 별도로 분석할 수 있습니다. SFCCS에서 한 명도 값 측정 각 채널에서 당 얻은 것입니다. CcN & B, 셀 연락처에 해당 하는 모든 픽셀의 밝기 히스토그램 취득 하 고 평균 (또는 평균) 값 측정을 위한 대표적인 밝기로 사용할 수 있습니다. 단위체 참조에 동일한 분석을 수행 하 여 모든 명도 값 감지 단백질 복합물의 평균 oligomeric 상태를 직접 정규화 될 수 있습니다. 이 시점에서, 그것은 oligomeric 상태의 과소에 발생할 수 있는 비 형광 FPs의 존재에 대 한 수정 하는 것이 중요. 이는 호모 dimeric 참조 단백질23,24 한 색상 sFCS 또는 번호를 사용 하 여 밝기와 밝기 (N & B)를 측정 하 여 일반적으로 수행 됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:596px;" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM growth medium</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-01548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-35500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P10-023100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TurboFect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:95px;">DSMZ</td>
			<td style="width:119px;">ACC 635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Alexa Fluor 488 NHS Ester</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Alderich</td>
			<td style="width:119px;">83689-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid DNA</td>
			<td style="width:95px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:95px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35-mm glass bottom dishes</td>
			<td style="width:95px;">CellVis</td>
			<td style="width:119px;">D35-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM780 confocal</td>
			<td style="width:95px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MATLAB software package</td>
			<td style="width:95px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">&#160;2015b&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Neubauer cell counting chamber</td>
			<td style="width:95px;">Marienfeld</td>
			<td align="right" style="width:119px;">640110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts

생물 학적 과정의 다양 한 일반적으로 인접 셀 간의 인터페이스에 상호 작용 하는 단백질에 의해 중재-세포 상호 작용을 포함 한다. 관심,만 몇 가지 분석의 특히 살아있는 세포에 직접 그런 상호 작용 할 수 있다. 여기, 선물이 표현-셀 연락처에 이웃 세포의 표면에 단백질의 바인딩을 측정 하는 시험. 이 분석 결과 두 단계로 구성 됩니다: confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 셀 연락처에서 형광 변동 분광학 측정 뒤에 다른 형광 단백질을 융합 하는 관심사의 단백질을 표현 하는 셀의 혼합. 우리 셀 접속점에 걸쳐 녹말 체 선구자 같은 단백질 1 (APLP1)의 상호 작용을 측정 하 여 생물학으로 관련 된 맥락에서이 분석 결과의 타당성을 보여줍니다. 우리는 형광 기반 기술 (형광 교차 상관 분광학, 교차 상관 번호와 밝기 분석 검사)를 사용 하 여 필요한 악기 교정 데이터 수집에 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 또한, 우리는 데이터 분석 및 식별 하 고 외부, 스 퓨 리 어스 신호 변이 때문에 photobleaching 또는 셀 운동 등을 수정 하는 방법에 중요 한 단계를 논의.
일반적으로 제시 분석 결과 호모-또는 같은 또는 다른 종류의 셀 사이의 셀 연락처에서 heterotypic 단백질-단백질 상호 작용에 적용 하 고 상업 confocal 레이저 스캐닝 현미경에 구현 될 수 있습니다. 중요 한 요구 사항은 몇 분 동안 관심사의 단백질의 방산 역학 조사 하기에 충분 해야 하는 시스템의 안정성 이다.

첫 번째 테스트 단백질 단백질 상호 작용 분석 결과 대 한 즉, sFCCS/ccN & B 측정 (그림 1), 괴기 하 게 고유한 형광 단백질을 표현 하는 셀의 혼합 수행 해야 되지 것으로 예상 되는 단백질에 세포 세포 접촉을 (즉, 부정적인 컨트롤)에서 상호 작용 합니다. 따라서, HEK 293T 세포 myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-팜-mEYFP) 또는-mCardinal 표현 했다 혼합...

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A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

이 프로토콜 중재-셀 상호 작용, 즉 단백질 세포 접합, 살아있는 세포에 직접에 단백질 간의 상호 작용을 조사 하는 형광 변동 분광학 기반 방식을 설명 합니다. 우리 악기 교정, 데이터 수집 및 분석, 보정 가능한 인 위 소스에 자세한 지침을 제공 합니다.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

이 방법은 세포 대 세포 접촉에서 접착 또는 인식을 중재하는 수용체와 특정 리간드가 상호 작용을 유발하는지 여부와 같은 세포 대 세포 상호 작용 분야의 주요 질문을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 고정 또는 중단이 필요없는 살아있는 세포에서 직접 그러한 상호 작용을 조사 할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 배양 된 세포 사이의 상호 작용을 조사하는 데 사용되지만 다른 시스템 모노 멤브레인 소포 또는 소형 모델 유기체에도 적용 될 수 있습니다.일반적으로 이 방법을 새로 사용하는 개인은 세포 이동과 느린 신호 변동을 주의 깊게 검사하여 몇 분 동안 수집할 수 있을 만큼 샘플이 충분히 안정적이다는 것을 확인해야 합니다. 첫째, 배설 전 날 6웰 플레이트의 적어도 4개의 우물에서 적절한 수의 세포를 시드한다. DMEM 배지에서 섭씨 37도5%의 이산화탄소를 10%의 FBS와 1%L-글루타민으로 보충하여 세포를 배양합니다.녹색 또는 노란색 형광 단백질및 별도의 우물에서 적색 형광 단백질에 융합된 관심있는 단백질에 대한 기본 실험 트랜스펙트 플라스미드를 수행한다. 4 시간 후 성장 매체를 제거하고 세척 하는 동안 세포의 분리를 방지 하기 위해 잘 가장자리에 마그네슘과 칼슘 떨어지는 PBS로 보충 PBS의 1 밀리 리터와 함께 각 잘 씻어. 그런 다음 PBS를 제거합니다.EDTA 용액의 약 50 마이크로리터를 각 웰에 현명하게 떨어뜨려 세포의 분리를 용이하게 합니다. 2 분 동안 섭씨 37도에서 배양 한 후, 천천히 세포를 분리하기 위해 측면으로 6 웰 판을 흔들어. 다음으로, 각 우물에 950 마이크로리터의 성장 배지를 추가하고 몇 번 위아래로 파이프하여 모든 세포를 우물 바닥에서 분리하여 세포를 다시 중단합니다.셀이 제대로 다시 중단되고 재발 후 큰 셀 응집체가 없는지 시각적으로 확인하여 서로 분리되는지 확인합니다. 하나의 셀 용액을 해당 우물로 전달합니다. 위아래로 몇 번 파이프를 통해 부드럽게 섞는다.그런 다음 혼합 세포를 35mm 유리 바닥 접시에 넣고 1일 동안 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 종자 세포를 배양합니다. 레이저 스캐닝 공초점 현미경 소프트웨어에서 광학 경로를 설정합니다. 스펙트럼 크로스토크를 피하기 위해 두 개의 별도 트랙을 선택하여 mEGFP 또는 mEYFP 및 mCherry 또는 mCardinal를 순차적으로 감지하고 모든 라인을 스위치 트랙을 선택합니다.탐지를 위해 두 채널모두에 적합한 필터를 사용합니다. 혼합 된 세포가 들어있는 접시를 샘플 홀더에 놓습니다. 온도 평형을 보장하고 초점 드리프트를 줄이기 위해 10 분을 기다린 후 찾기 메뉴에서 전송 광을 사용하여 셀에 집중하십시오.서로 접촉하는 빨간색과 녹색 셀 쌍을 검색합니다. 다음으로, 자르기 버튼을 사용하여 셀 간 접촉에 수직으로 스캔 경로를 선택합니다. 확대/축소하여 50~200나노미터의 픽셀 크기를 달성하고 스캔 모드에서 선을 선택합니다.프레임 크기를 1픽셀씩 128으로 설정합니다. 스캔 속도를 허용값으로 설정합니다. 그런 다음 사이클을 100, 000에서 500, 000으로 설정합니다.이 에 따라, 적절한 레이저 힘을 선택합니다. 검출기를 Photon 카운팅 모드로 설정합니다. 시작 실험을 눌러 인수를 시작합니다.원시 데이터 파일을 원시 데이터 형식으로 RGB TIF 이미지로 내보냅니다. 이 파일에는 이미지의 G와 R이라고 불리는 채널의 녹색 및 빨간색 채널 데이터가 있는 키모그래프가 각각 포함됩니다. 다음으로, 적절한 분석 소프트웨어와 TIF 파일을 가져오고 분석을 수행합니다.세그먼트별 시간 평균을 500~1000줄의 블록으로 정렬합니다. 각 블록의 멤브레인 위치를 결정합니다. 그런 다음 모든 블록을 동일한 측면 위치로 이동합니다.시간 축을 따라 정렬된 모든 선을 요약하고 가우시안 함수를 사용하여 평균 강도 프로파일에 맞습니다. 멤브레인 위치에 해당하는 픽셀을 멤브레인 위치의 플러스 또는 마이너스 2.5 시그마 내의 모든 픽셀로 정의하고 각 회선에 대해 단일 형광 신호 값을 얻는 각 라인의 이러한 픽셀의 강도를 합산합니다. 사진 표백이 관찰되면 멤브레인 형광 시계시리즈를 이중 지수 기능으로 피팅하고 적절한 교정 공식을 적용하여 표백 보정을 적용하십시오.적절한 방정식에 따라 자동 및 상관 관계 간 함수를 계산합니다. 분석의 신뢰성을 개선하고 아티팩트를 피하기 위해 총 측정의 10~20개 세그먼트에 대한 계산을 수행합니다. 각 세그먼트의 형광 시계열 및 상관 관계를 검사하고 명확하게 왜곡된 세그먼트를 제거합니다.마지막으로 왜곡되지 않은 모든 세그먼트를 평균값으로 값값으로 구분합니다. 데이터를 분석하는 동안 각 세그먼트의 강도 시계열 및 상관 관계를 주의 깊게 검사하여 멤브레인 주변의 세포내 소포로 인해 왜곡을 방지합니다. MYristolyated-팔미토일레이트-mEYFP 또는 mCardinal를 발현하는 HEK 293T 세포의 강도 이미지가 여기에 나와 있다.자동 상관 기능으로 인해 플라즈마 멤브레인에서 골수-팔미토일레이트-mEYFP 및 mCardinal의 확산을 위해 10~20밀리초의 특징적인 붕괴 시간을 표시하는 동안 0에 가까운 상대교차 상관관계가 관찰되었다. 막 고정 된 이종수 심근을 발현하는 HEK 293T 세포의 sFCCS 측정의 교차 상관 기능은 양진폭을 보였으며 자기 상관 관계 기능과 유사한 부패 시간을 보였다. APLP1-mEYFP와 APLP1-mCardinal 발현 세포 사이의 세포 대 세포 접촉에 대한 sFCCS 측정은 0.45의 양극상대 상호 상관관계를 초래하였다.세포-세포 접촉에서 APLP1 클러스터에 걸쳐 측정에서 얻은 sFCCS 상관 기능 큰 지연 시간에 진동에서 큰 부패 시간에서 분명 하 고 강하게 감소 된 역학을 보였다. 아연 이온을 추가하면 상대적 상호 상관관계가 평균 0.8로 증가했습니다. 또한 분자 밝기는 작은 올리고머에서 각 세포에 10~50개의 단량체로 구성된 더 큰 멀티머로 크게 증가했습니다.과도 성 불안정은 음의 값 또는 높은 거짓 긍정 교차 상관 관계를 갖는 상관 관계 간 함수를 초래할 수 있습니다. 해당 상관 관계 함수는 일반적으로 대부분의 세그먼트에서 강하게 이탈합니다. sFCCS 교차 상관 번호 및 밝기에 대한 보완적인 접근법으로 단백질 단백질 상호 작용을 감지하는 데 사용할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 전염된 세포의 혼합이 중요한 단계라는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 세포를 부드럽게 혼합하고 형질 전환 효율성을 최적화하여 접촉시 적색 및 녹색 세포를 찾을 확률을 높입니다. 개발 후이 기술은 면역학 분야의 연구원에 의해 사용되어 면역학 시냅스에서 신호 분자의 상호 작용을 탐구합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

연구

생화학

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated 세포 관통 펩 티 드 세포내 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

체 외 형광 공명 에너지 전달에 밀리초 시간 규모에서 단백질 복합물의 역학을 공부 하는 사용 하 여

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

전사에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 생체층 간섭측정기(BLI) 적용

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

단백질-지질 상호작용을 측정하기 위한 마이크로스케일 열영동 사용

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

천연 물의 생물 조절 특성을 측정하는 플래니언 모틸리티 분석

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

살아있는 세포의 원형질막에서의 분자 확산 분석을위한 스팟 변이 형광 상관 분광법

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...