Name: a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts
Uploaded: 2018-12-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) gi 254850309. Forfatterne takker Madlen Luckner for kritisk lesning av manuskriptet.

1. sample forberedelse: Celle-celle blanding analysen
Merk: Følgende protokollen beskriver blande fremgangsmåten for tilhenger celler. Det kan endres for cellene kultivert i suspensjon.
<ol><li>Frø et passende antall celler i en 6-vel plate, f.eks 800.000 HEK 293T celler (telt med en Neubauer telling kammer), en dag før transfection. Nummeret kan endres avhengig av tiden mellom såing og transfection og justert for andre celletyper. For å utføre et grunnleggende eksperiment (<...

Den eksperimentelle prosedyren beskrevet her kan etterforskningen av protein-protein trans samhandlinger på celle-celle kontakter, ansette fluorescens svingninger spektroskopi teknikker, nemlig sFCCS og ccN & B. Disse metodene omfatter en statistisk analyse av fluorescens svingninger slippes ut av to spectrally atskilt FPs smeltet sammen til protein(s) rundt på en kontakt med to nabokommunene cellene hver uttrykke en eller andre fusion protein. Tilstedeværelsen av trans komplekser er kvantifisert ved...

Mange biologiske prosesser oppstå ved celle-celle interaksjoner, f.eks celle-celle adhesjon1,2,3, celle-celle fusion4 og mobilnettet anerkjennelse5. Slike hendelser er spesielt viktig i utviklingen av multicellular organismer og for celle-celle kommunikasjon, f.eks under immunreaksjoner. Disse prosessene er vanligvis formidlet av proteiner som er lokalisert på overflaten, dvs. i plasma membranen (PM) til nabokommunene cellene og gjennomgå spesifikke interaksjoner ved celle-celle kontakt som er nøyaktig regulert i rom og tid. I mange tilfeller kan disse interaksjoner er direkte homo- eller heterotypic protein-protein trans interaksjoner, men kan også innebære ioner eller ligander som ekstracellulære linkers1. Selv om du er av grunnleggende betydning, er det mangel på analyser sondering disse bestemt protein-protein interaksjoner direkte i sine opprinnelige omgivelser av levende celler. Mange metoder krever enten celle avbrudd (f.eks biokjemiske analyser som co-immunoprecipitation6), fiksering (f.eks noen super-oppløsning mikroskopi optisk teknikker og elektronmikroskop av celle-celle kontakter7), eller er ikke-spesifikk, f.eks aggregering / vedheft søk8,9. For å overvinne problemet, er fluorescens teknikker gjennomført basert på fluorescens resonans energi overføring (bånd)10 eller fluorescens complementation11. Men for å oppnå tilstrekkelig små avstander mellom fluorophores, krever disse metodene fluorescerende etiketter på ekstracellulære side av proteiner10, potensielt forstyrre trans interaksjoner.
Her presenterer vi en alternativ fluorescens-baserte analysen for protein-protein interaksjoner i celle-celle kontakter. Denne tilnærmingen kombinerer fluorescens kryss-korrelasjon tilnærminger (skanning fluorescens kryss-korrelasjon spektroskopi (sFCCS), cross-korrelasjon nummer og lysstyrke (ccN og B)) og blanding av celler som uttrykker en fusion konstruksjon av protein av interesse, f.eks en vedheft reseptor. Undersøkte receptors i de to samspill cellene er merket med to spectrally atskilt fluorescerende proteiner (FPs), fra den intracellulær side (se figur 1A).
De næringsdrivende metodene er basert på den statistiske analysen fluorescens svingninger forårsaket av diffusive bevegelse fluorescerende fusion proteiner gjennom fokal volumet av en AC confocal laserskanning mikroskop. Mer i detalj sonder analysen co spredningen av proteiner interesse både nabolandet PMs på celle-celle kontakter. Hvis proteiner gjennomgå trans interaksjoner, vil disse trans komplekser bære fluorescerende proteiner emitting i begge spectral kanalene, forårsaker korrelert fluorescens svingninger av både emittere. Derimot, hvis ingen binding, vil antall svingninger proteiner i overfor PMs være uavhengig, forårsaker ingen samsvarende svingninger. Oppkjøpet kan utføres på to måter: 1) sFCCS er basert på en linje-formet skanning over celle-celle kontakten og effektivt sonder samhandlinger i et sted i regionen kontakt. Gjennom en timelig analyse av fluorescens svingninger gir sFCCS også dynamics informasjon, dvs. diffusjon koeffisientene av protein komplekser; 2) ccN & B er basert på en pixel-wise analyse av en sekvens av bilder kjøpt til celle-celle kontakt regionene. Den har evnen å undersøke og kart interaksjoner langs hele kontakt regionen (i en fokalplanet), men gir ikke informasjon på dynamics. Begge metodene kan kombineres med en analyse av molekylære lysstyrken, dvs. gjennomsnittlig fluorescens signalet slippes ut i tidsenheten av enkelt spre protein komplekser, og dermed gir anslag over støkiometri av protein komplekser på celle-celle kontakter.
I denne artikkelen gir vi detaljert protokoller for eksempel forberedelse, instrument kalibrering, datainnsamling og analyse å utføre presentert analysen på en kommersiell AC confocal laserskanning mikroskop. Eksperimenter kan utføres på instrument Foton teller eller analoge detektorer og et mål med høy numeriske blenderåpning. Vi videre diskutere avgjørende skritt av protokollen og gi korreksjon ordninger for flere prosesser forårsaker artefactual signal svingninger, f.eks detektor støy, photobleaching eller celle bevegelse. Opprinnelig utviklet for å undersøke interaksjoner mellom tilhenger celler, analysen kan endres for suspensjon celler eller tilpasset modell membran systemer, f.eks gigantiske unilamellar blemmer (GUVs) eller gigantiske plasma membran blemmer (GPMVs), slik at den kvantifisering av interaksjoner i forskjellige lipid miljøer eller i fravær av en organisert cytoskjelett12,13.
Skanning fluorescens kryss-korrelasjon spektroskopi er en modifisert versjon av fluorescens kryss-korrelasjon spektroskopi14 og var spesielt beregnet på sonde langsom diffusive dynamikk i lipid membraner15. Den er basert på en linje skanning oppkjøpet vinkelrett til PM med fluorescerende proteiner av interesse. For å undersøke interaksjoner av to annerledes merket protein arter, utføres oppkjøpet i to spectral kanaler med to laser linjer og to oppdagelsen Vinduer for spectrally atskilt fluorophores. På grunn av treg diffusjon dynamikken i proteiner i PM (D≤ ~ 1 µm2/s), en cross-talk-fri måling kan utføres av vekslende eksitasjon ordningen fra linje til linje15. Analysen starter med: 1) en justering algoritme korrigere for sideveis celle bevegelse basert på block-wise gjennomsnitt ~ 1000 linjer, 2) fastsettelse av posisjon med maksimal fluorescens signaldvs. PM posisjon, i hver blokk og 3) skiftende Alle blokkene til en felles opprinnelse12,15, separat i hver enkelt kanal. Deretter utføres en automatisk valg av bildepunkter som tilsvarer PM ved å velge den sentrale regionen et Gaussian anfall av summen av alle justerte linjer (dvs. center ± 2.5σ). Integrering av signalet i hver linje gir membran fluorescens tiden serien f (t) i hver enkelt kanal (g = grønn kanal, r = rød sone). Merk at pikselstørrelsen må være små nok, f.eks < 200 nm, å rekonstruere form av punkt spredning funksjon og finne midten, tilsvarer plasseringen av PM. I nærvær av betydelig photobleaching, fluorescens tiden serien i hver kanal kan være modellert med en dobbel-eksponentiell funksjon og deretter korrigert med følgende formel:16
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq2.jpg">.    (1)
Det er viktig å merke seg at denne formelen effektivt korrigerer både amplitudes og diffusion times fra korrelasjon analyse av f (t)c, sammenlignet med parameteren anslår at skulle hentes fra det ukorrigert f (t). Deretter auto - og kryss-korrelasjon funksjonene (ACFs / CCFs) av fluorescensen signaler beregnes:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq3v2.jpg">, (2).
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq4v2.jpg">, (3).
hvor sesFjeg = Fjeg(t) - <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img> Fjeg(t)<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg"> </img> og jeg = g, r.
En todimensjonal diffusjon modell er da utstyrt til alle korrelasjon funksjoner (CFs):
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq7.jpg">.   (4)
Her, angir N antall fluorescerende proteiner i observasjon volumet og τd diffusjon tiden for hver kanal. Denne modellen tar hensyn at beskrevet eksperimentelle innstillingen, spredning av proteiner i PM oppstår i x-z flyet, i motsetning til vanlige konfigurasjonen fluorescens korrelasjon spektroskopi (FCS) eksperimenter på membraner undersøkelser diffusjon i x-y flyet AC confocal volum17. Livet w0 og struktur faktoren S, som beskriver forlengelse wz fokal volumroten i z, S = wz/w0, hentes fra et punkt FCS kalibrering mål med spectrally lignende fargestoffer og optisk innstillingene bruke allerede tilgjengelig for diffusion rthe Dfargestoff:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq8.jpg">, (5).
hvor τd, fargestoff er målt gjennomsnittlig diffusjon tiden av fargestoff molekyler, fra montering en modell for tredimensjonale diffusjon til dataene, tar konto overganger av en brøkdel T alle N molekyler til en trilling stat med en gang konstant ττ:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq9.jpg">.   (6)
Til slutt, diffusjon koeffisientene (D), molekylær lysstyrkeverdier (ε) og relativ kryss-korrelasjonen sFCCS data (rel.cc.) er beregnet som følger:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq10.jpg">, (7).
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq11.jpg">, (8).
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq12.jpg">, (9).
hvor Gcross(0) er amplituden til funksjonen kryss-korrelasjon og <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq14.jpg"> er amplituden til funksjonen autokorrelasjon i jeg-th kanalen.
Denne definisjonen av relativ kryss-korrelasjon, dvs med max i stedet for betyr i ligningen 9, tar hensyn til at maksimalt antall komplekser av to protein arter til stede i ulike konsentrasjoner er begrenset av den arter til stede i et lavere tall.
Cross-korrelasjon tall og lysstyrke er basert på litt analyse av fluorescens intensiteten for hvert bildepunkt i en bildestakk kjøpt over tid til en fast stilling i utvalget, vanligvis bestående av ~ 100-200 rammene, med to spectral kanaler () g = grønn kanal, r = rød sone). Fra timelige middelverdien <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img>jeg<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg">jeg og varians <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq16.jpg"> </img>, den molekylære lysstyrke εjeg og nummer njeg beregnes i hver piksel og spectral kanal (jeg = g, r)18:
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq20.jpg">, (10).
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq21.jpg">. (11)
Det er viktig å merke seg at gitt ligningene gjelder det ideelle tilfellet av en sann Foton-telling detektor. For analoge oppdagingssystemer gjelder følgende ligningene19,20:
<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq22.jpg">, (12).
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq23.jpg">.   (13)
Her, S er omregningsfaktoren mellom oppdaget fotoner og innspilte digitalt teller, <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> er avlesning støy og forskyvning refererer til detektor intensitet forskyvningen. Vanligvis bør disse antallene kalibreres, for alle merker, basert på måling detektor avviket som en funksjon av intensitet for jevn belysning19, f.eks en reflekterende metalloverflate eller tørket fargestoff løsning. Forskyvning kan bestemmes ved å måle antall prisen for et utvalg uten eksitasjon lys. Ved å utføre en lineær regresjon av detektor-assosiert variansen <img alt="Equation 25" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq25.jpg"> versus intensitet (jeg) plot, S og <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> kan være bestemt19:
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq27.jpg">.   (14)
Til slutt, cross-korrelasjon lysstyrken beregnes i hver piksel og defineres generelt som21
<img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq28.jpg">, (15).
hvor <img alt="Equation 29" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq29.jpg"> er kryss-variansen <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq30.jpg"> </img>.
For å filtrere varige svingninger, utføres alle ccN & B beregninger etter en boxcar filtrering, uavhengig for hver piksel22. Kort, njeg, εjeg (jeg = g, r) og Bcc beregnes i skyve segmenter av f.eks 8-15 rammer. Verdiene anskaffes kan være så gjennomsnitt for å få den endelige pixel tall og lysstyrke.
Støkiometri analyse For å beregne støkiometri av protein komplekser på celle-celle kontakter, kan molekylær lysstyrken bli separat analysert i hver spectral kanal for sFCCS eller ccN & B data. I sFCCS hentes en lysstyrkeverdi per måling i hver enkelt kanal. I ccN & B, et lysstyrke histogram for alle bildepunkter ved celle-celle kontakten er innhentet og gjennomsnittlig (eller median) verdien kan brukes som representant lysstyrke for målingen. Ved å utføre den samme analysen på en monomerisk referanse, kan alle lysstyrkeverdier normaliseres for å få direkte gjennomsnittlig oligomeric staten oppdaget protein komplekser. På dette punktet, er det viktig å korrigere for tilstedeværelsen av ikke-fluorescerende FPs som kan resultere i en undervurdering av oligomeric. Dette er vanligvis utføres av måle lysstyrken på en homo-dimeric referanse protein23,24 med én farge sFCS eller tall og lysstyrke (N & B).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:596px;" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM growth medium</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-01548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-35500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P10-023100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TurboFect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:95px;">DSMZ</td>
			<td style="width:119px;">ACC 635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Alexa Fluor 488 NHS Ester</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Alderich</td>
			<td style="width:119px;">83689-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid DNA</td>
			<td style="width:95px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:95px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35-mm glass bottom dishes</td>
			<td style="width:95px;">CellVis</td>
			<td style="width:119px;">D35-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM780 confocal</td>
			<td style="width:95px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MATLAB software package</td>
			<td style="width:95px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">&#160;2015b&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Neubauer cell counting chamber</td>
			<td style="width:95px;">Marienfeld</td>
			<td align="right" style="width:119px;">640110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts

En rekke biologiske prosesser innebærer celle-celle interaksjoner, vanligvis formidlet av proteiner som samhandler på grensesnittet mellom nabokommunene cellene. Rundt er bare få analyser dugelig av spesielt sondering slik interaksjon direkte i levende celler. Her presenterer vi en analyse for å måle binding av proteiner uttrykt på overflater av nabokommunene cellene på celle-celle kontakter. Denne analysen består av to trinn: blanding av celler som uttrykker proteiner rundt smeltet forskjellige fluorescerende proteiner, etterfulgt av fluorescens svingninger spektroskopi målinger på celle-celle kontakter ved hjelp av en AC confocal laserskanning mikroskop. Vi viser muligheten for denne analysen i en biologisk relevante kontekst ved å måle samspillet av amyloid forløper som protein 1 (APLP1) over celle-celle veikryss. Vi gir detaljert protokoller på datainnsamling bruker fluorescens-baserte teknikker (skanning fluorescens kryss-korrelasjon spektroskopi, cross-korrelasjon tall og lysstyrke analyse) og nødvendige instrument kalibreringer. Videre, vi diskutere avgjørende skritt i dataanalyse og hvordan å identifisere og korrigere eksterne, falske signal variasjoner, for eksempel på grunn av photobleaching eller celle bevegelse.
Vanligvis presentert analysen gjelder homo - eller heterotypic protein-protein interaksjon på celle-celle kontakter mellom celler av samme eller forskjellige typer og kan implementeres på en kommersiell AC confocal laserskanning mikroskop. En viktig forutsetning er stabiliteten i systemet, som må være tilstrekkelig å undersøke diffusive dynamikken i proteiner rundt over flere minutter.

En første test for protein-protein samhandling analysen, dvs. blanding av celler som uttrykker spectrally distinkte fluorescerende proteiner etterfulgt av sFCCS/ccN & B målinger (figur 1), skal utføres på proteiner som ikke forventes å samhandle på celle-celle kontakten (dvs. en negativ kontroll). Derfor HEK 293T celler uttrykke myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-palm-mEYFP) eller -mCardinal ble blandet og sFCCS ble utført over ce...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Denne protokollen beskriver en fluorescens svingninger spektroskopi tilnærming for å undersøke interaksjon mellom proteiner formidling celle-celle interaksjoner, dvs proteiner lokalisert i cellen veikryss, direkte i levende celler. Vi gir detaljerte veiledninger på instrumentet kalibrering, datainnsamling og analyse, inkludert rettelser til mulig gjenstanden kilder.

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Denne metoden kan bidra til å forstå viktige spørsmål i celle-til-celle-samhandlingsfeltet, for eksempel hvilke reseptorer som medierer vedheft eller anerkjennelse i celle-til-celle-kontakter, og om bestemte ligande utløser samhandlingene. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater en å undersøke slike interaksjoner direkte i levende celler uten behov for cellefiksering eller forstyrrelse. Selv om denne metoden brukes til å undersøke interaksjoner mellom kultiverte celler, kan den også brukes på andre systemer monomembran vesikler eller til og med små modellorganismer.Vanligvis bør personer som er nye på denne metoden, kontrollere at prøven er stabil nok til å tillate oppkjøp over noen få minutter ved å nøye inspisere cellebevegelse og langsomme signalvariasjoner. Først frø riktig antall celler i minst fire brønner av en seks-brønns plate om dagen før transfection. Kultur cellene ved 37 grader Celsius 5% karbondioksid i DMEM medium supplert med 10% FBS og 1% L-glutamin.For å utføre et grunnleggende eksperiment transfect plasmider for protein av interesse smeltet til et grønt eller et gult fluorescerende protein og et rødt fluorescerende protein i separate brønner. Etter fire timer fjerne vekstmediet og vaske hver godt forsiktig med en milliliter PBS supplert med magnesium og kalsium slippe PBS på brønnkanten for å hindre løsrivelse av cellene under vask. Fjern deretter PBS.Tilsett ca 50 mikroliter EDTA-løsningsdråpe klokt til hver brønn for å lette løsrivelse av cellene. Etter inkubering ved 37 grader Celsius i to minutter, rist sakte seksbrønnsplaten sideveis for å løsne cellene. Deretter legger du til 950 mikroliter vekstmedium til hver brønn og bruker cellene ved å pipettere noen ganger opp og ned og dermed løsne alle celler fra brønnbunnen.Sørg for at cellene blir brukt på riktig og løsrevet fra hverandre ved å visuelt se etter fravær av store celleaggregater etter gjenoppliving. Overfør celleløsningen til en brønn til tilsvarende brønn. Bland forsiktig ved å pipettere noen ganger opp og ned.Så frø de blandede cellene på en 35-millimeter glass bunnrett og kultur seedede celler på 37 grader Celsius i 5% karbondioksid for en dag. I laserskanning confocal mikroskop programvare satt opp den optiske banen. For å unngå spektral crosstalk, velg to separate spor for å opphisse og oppdage mEGFP eller mEYFP og mCherry eller mCardinal sekvensielt og velg Switch spor hver linje.For deteksjon bruk passende filtre for begge kanalene. Plasser fatet som inneholder de blandede cellene på prøveholderen. Etter å ha ventet i 10 minutter for å sikre temperaturlikevekt og for å redusere fokusdrift, fokuser på cellene ved hjelp av overføringslyset i Finn-menyen.Søk etter et par røde og grønne celler i kontakt med hverandre. Deretter velger du en skannebane vinkelrett på celle-til-celle-kontakt ved hjelp av Beskjæring-knappen. Zoom for å oppnå en pikselstørrelse på 50 til 200 nanometer og velg Linje i skannemodus.Angi rammestørrelse til 128 med én bildepunkter. Sett skannehastigheten til den maksimale tillatte verdien. Sett deretter sykluser til 100 000 til 500 000.Etter dette velger du de riktige laserkreftene. Sett detektorene i Fotontellingsmodus. Trykk på Start eksperiment for å starte oppkjøpet.Eksporter rådatafilene til et RGB TIF-bilde i rådataformat. Denne filen vil inneholde en kymograf med de grønne og røde kanaldata i kanalen betegnes G og R av bildet, henholdsvis. Deretter importerer du TIF-filen med riktig analyseprogramvare og fortsetter å utføre analysen.Juster linjene ved å utføre et segmentvis tidsgjennomsnitt med blokker på 500 til 1000 linjer. Bestem membranposisjonen i hver blokk. Deretter flytter du alle blokkene til samme sidestilling.Summer alle justerte linjer langs tidsaksen og monter gjennomsnittsintensitetsprofilen ved hjelp av en gaussisk funksjon. Definer pikslene som tilsvarer membranen som alle piksler innenfor pluss eller minus 2,5 sigma av membranposisjonen, og oppsummere intensiteten av disse pikslene i hver linje som får en enkelt fluorescerende signalverdi for hvert tidspunkt. Hvis fotobleking observeres, påfør en blekekorreksjon ved å montere membranen fluorescens tidsserie med en dobbel eksponentiell funksjon og bruke riktig korreksjonsformel.Beregn de automatiske og krysskorrelasjonsfunksjonene i henhold til de riktige ligningene. For å forbedre påliteligheten til analysen og unngå artefakter, utfør beregningene for 10 til 20 like segmenter av den totale målingen. Inspiser fluorescenstidsseriene og korrelasjonsfunksjonene i hvert segment og fjern tydelig forvrengte segmenter.Til slutt, gjennomsnittlig alle ikke-forvrengte segmenter. Mens du analyserer dataene dine, må du nøye inspisere intensitetstidsseriene og korrelasjonsfunksjonene fra hvert segment for å unngå forvrengninger, for eksempel på grunn av intracellulære vesikler i membranperdiffæren. Et intensitetsbilde av HEK 293T-celler som uttrykker myristolyated-palmitoyated-mEYFP eller mCardinal er vist her.En relativ krysskorrelasjon nær null ble observert mens autokorrelasjonsfunksjonene viser karakteristiske forfallstider på 10 til 20 millisekunder for diffusjon av myristolyated-palmitoylert-mEYFP og mCardinal i plasmamembranen. Krysskorrelasjonsfunksjonene til sFCCS-målingene av HEK 293T-celler som uttrykker membranforankret heterodimer myristolyated-palmitoyated-mCardinal-mEYFP hadde positive amplituder og viste lignende forfallstider som autokorrelasjonsfunksjonen. sFCCS-målinger på celle-til-celle-kontakter mellom APLP1-mEYFP og APLP1-mCardinal-uttrykkende celler resulterte i en positiv relativ krysskorrelasjon på 0,45.SFCCS-korrelasjonsfunksjonene hentet fra målinger på tvers av APLP1-klynger ved cellecellekontakter viste sterkt redusert dynamikk som tydelig fra store forfallstider i svingningene ved store forsinkelser. Ved sinkiontilsetning økte den relative krysskorrelasjonen til en gjennomsnittlig verdi på 0,8. Videre økte den molekylære lysstyrken betydelig fra små oligomerer til større multimere bestående av 10 til 50 monomerer på hver celle.Forbigående ustabiliteter kan føre til at en tverrkorrelasjonsfunksjon har negative verdier eller en høy falsk positiv krysskorrelasjon. De tilsvarende korrelasjonsfunksjonene avviker vanligvis sterkt fra de fleste segmenter. Som en komplementær tilnærming til sFCCS krysskorrelasjonsnummer og lysstyrke kan brukes til å oppdage protein-protein interaksjoner.Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å huske at blanding av trans infiserte celler er et kritisk skritt. Bland forsiktig cellene og optimaliser transfection effektivitet for å øke sjansen for å finne røde og grønne celler i kontakt. Etter utviklingen har denne teknikken blitt brukt av forskere innen immunologi for å utforske samspillet mellom signalmolekyler i immunologiske synapser.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

En fluorescens-baserte analysen av fosfolipid Scramblase aktivitet

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescens anisotropi som et verktøy for å studere protein-protein interaksjoner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated celle-gjennomtrengende peptider å studere intracellulær Protein-protein interaksjoner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anvendelse av Biolayer laboratoriefasiliteter (BLI) for å studere protein-protein interaksjoner i transkripsjon

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluering av protein-protein interaksjoner ved hjelp av en on-membran fordøyelsen Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Bruk av mikroskala termoforese for å måle protein-lipid interaksjoner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

En planarisk motilitetsanalyse for å måle de biomodulerende egenskapene til naturlige produkter

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Spotvariasjon Fluorescenskorrelasjonsspektroskopi for analyse av molekylær diffusjon ved plasmamembranen til levende celler

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...