Name: a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts
Uploaded: 2018-12-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

Este trabalho foi parcialmente financiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) conceder 254850309. Os autores agradecer Madlen Luckner leitura crítica do manuscrito.

1. amostra preparação: Celular ensaio de mistura
Nota: O seguinte protocolo descreve o procedimento de misturando de células aderentes. Pode ser modificado para células cultivadas em suspensão.
<ol><li>Sementes de um número adequado de células em uma placa de 6, por exemplo, 800.000 células HEK 293T (contadas com uma contagem câmara de Neubauer), um dia antes do transfection. O número pode ser modificado dependendo do tempo entre a semeadura e transfecção e ajustado para...

O procedimento experimental descrito aqui permite a investigação da proteína-proteína trans interações em contatos de celular, empregando técnicas de espectroscopia de flutuação de fluorescência, ou seja, sFCCS e ccN & B. Esses métodos envolvem uma análise estatística das flutuações de fluorescência emitida por dois espectralmente separados FPs fundido para as somáticas de interesse em um contato de duas células vizinhas, cada uma expressando uma ou a outra proteína de fusão. A presença de c...

Muitos processos biológicos ocorrem aos sítios de interações célula-célula, por exemplo, célula-célula adesão1,2,3, celular fusão4 e reconhecimento celular5. Tais eventos são particularmente importantes durante o desenvolvimento de organismos multicelulares e para a comunicação célula-célula, por exemplo, durante as respostas imunes. Esses processos são normalmente mediados por proteínas que são localizadas na superfície, ou seja, na membrana plasmática (PM) de vizinhos células e passam por interações específicas no contato célula-célula que são precisamente regulamentados no espaço e no tempo. Em muitos casos, essas interações são homo direto - ou heterotypic-interações da proteína proteína trans , mas também podem envolver íons ou ligantes atuando como extracelular linkers1. Apesar de fundamental importância, há uma falta de ensaios de sondagem essas interações proteína-proteína específica diretamente no ambiente nativo de células vivas. Muitos métodos exigem também o rompimento da pilha (por exemplo, ensaios bioquímicos como co-imunoprecipitação6), fixação (por exemplo, algumas das técnicas de microscopia óptica de super-resolução e microscopia eletrônica de célula-célula entra em contato com7), ou são não-específicos, por exemplo, agregação /8,9ensaios de aderência. Para superar esse problema, técnicas de fluorescência foram implementadas com base na ressonância de fluorescência a energia transferência (FRET)10 ou fluorescência complementação11. No entanto, para atingir suficientemente pequenas distâncias entre fluorophores, esses métodos exigem etiquetas fluorescentes no lado extracelular das proteínas10, potencialmente interferir com interações trans .
Aqui, apresentamos um ensaio alternativo baseado em fluorescência para interações da proteína-proteína em contatos do celular. Esta abordagem combina abordagens de correlação cruzada de fluorescência (espectroscopia de correlação cruzada de fluorescência digitalização (sFCCS), número de correlação cruzada e brilho (ccN & B)) e a mistura de células expressando um construto de fusão da proteína de interesse, por exemplo, um receptor de adesão. Os receptores investigados nas duas células interagindo são rotulados com duas proteínas fluorescentes espectralmente separadas (FPs), do intracelular lateral (veja figura 1A).
Os métodos empregados são baseados na análise estatística das flutuações da fluorescência induzida pelo movimento difusiva de proteínas fluorescentes fusão através do volume focal de um laser confocal microscópio. Mais detalhadamente, o ensaio de sondas a difusão co das proteínas de interesse em ambos os PMs vizinhas em contatos do celular. Se as proteínas sofrem interações trans , estes complexos trans vão levar proteínas fluorescentes emitem em ambos os canais espectrais, causando a fluorescência correlacionados flutuações de ambos os emissores. Por outro lado, se nenhuma ligação ocorre, as flutuações números de proteínas para enfrentar a TPM será independentes, causando flutuações não correlacionadas. A aquisição pode ser realizada de duas maneiras: 1) sFCCS é baseado em uma varredura em forma de linha através do contato célula-célula e sondas efetivamente as interações em um ponto localizado na região de contato. Através de uma análise temporal das flutuações de fluorescência, sFCCS fornece também informação dinâmica, ou seja, os coeficientes de difusão de complexos de proteínas; 2) ccN & B baseia-se numa análise pixel-wise de uma sequência de imagens adquiridas nas regiões de contato célula-célula. Tem a capacidade de sondar e interações do mapa ao longo de toda a região (em um plano focal) entre em contato com, mas não fornece informações sobre a dinâmica. Ambos os métodos podem ser combinados com uma análise do brilho molecular, ou seja, o sinal de média fluorescência emitida na unidade de tempo por simples difusão complexos de proteínas e, assim, proporcionar estimativas a estequiometria de complexos de proteínas no contatos do celular.
Neste artigo, nós fornecemos protocolos detalhados para preparação de amostras, calibração de instrumentos, aquisição de dados e análise realizar o ensaio apresentado em um comercial laser confocal microscópio. As experiências podem ser executadas em qualquer instrumento equipado com contagem de fótons ou detectores analógicos e um objectivo com abertura numérica elevada. Mais discutimos os passos críticos do protocolo e fornecem esquemas de correção para vários processos, causando flutuações artefactual sinal, por exemplo, de detector de ruído, movimento fotobranqueamento ou célula. Originalmente desenvolvida para sonda interações entre as células aderentes, o ensaio pode ser modificado para células de suspensão, ou adaptados para sistemas de membrana modelo, por exemplo, vesículas de gigante unilamellar (GUVs) ou plasma gigante vesículas de membrana (GPMVs), permitindo que o quantificação de interações em ambientes diferentes lipídios ou, na falta de um citoesqueleto organizado12,13.
Espectroscopia de fluorescência correlação cruzada de digitalização é uma versão modificada da fluorescência espectroscopia de correlação cruzada14 e foi projetado especificamente para sondar a dinâmica difusiva lenta em lipídios membranas15. É baseado na aquisição de digitalizar linha perpendicular ao PM contendo as proteínas fluorescentes de interesse. Para sondar as interações de duas espécies de proteína rotulada de forma diferente, a aquisição é realizada em dois canais espectrais usando duas linhas de laser e duas janelas de deteção para fluorophores espectralmente separados. Devido a dinâmica de difusão lenta de proteínas no PM (D≤ ~ 1 µm2/s), uma cruz-conversa livre de medição pode ser realizada alternando-se o esquema de excitação de linha a linha15. A análise começa com: 1) é um algoritmo de alinhamento corrigindo para o movimento lateral da célula com base na block-wise uma média de ~ 1000 linhas, 2) determinação da posição com fluorescência máximo sinalou seja, a PM posição, em cada bloco e 3) deslocando de todos os blocos para uma comum origem12,15, separadamente em cada canal. Em seguida, uma seleção automática de pixels correspondentes ao PM é executada selecionando a região central de um ajuste Gaussian da soma de todas as linhas alinhadas (i.e., centro ± 2.5σ). Integração do sinal em cada linha produz a série de tempo de fluorescência do membrana f (t) em cada canal (g = green channel, r = canal vermelho). Nota que o tamanho do pixel deve ser pequeno o suficiente, por exemplo, < 200 nm, para reconstruir a forma do ponto de espalhar a função e encontrar o seu centro, correspondente à posição da PM. Na presença de fotobranqueamento substancial, a série de tempo de fluorescência em cada canal pode ser modelada com uma função dupla-exponencial e então corrigida com a seguinte fórmula:16
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq2.jpg">.    (1)
É importante notar que esta fórmula efetivamente corrige o amplitudes e tempos de difusão resultantes da análise de correlação de f (t)c, em comparação com as estimativas do parâmetro que seria obtidas da não corrigida f (t). Então, as funções de autoe correlação cruzada (ACFs / CCFs) da fluorescência, calculam-se os sinais:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq3v2.jpg">, (2).
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq4v2.jpg">, (3).
onde δFeu = Feu(t) - <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img> Feu(t)<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg"> </img> e eu = g, r.
Um modelo de difusão bidimensional então é equipado para todas as funções de correlação (CFs):
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq7.jpg">.   (4)
Aqui, N denota o número de proteínas fluorescentes no volume de observação e τd o tempo de difusão para cada canal. Este modelo leva em conta que no cenário experimental descrito, difusão de proteínas no PM ocorre no plano x-z, em contraste com a configuração comumente usada de correlação de fluorescência espectroscopia (FCS) experiências com membranas de sondagem difusão no plano x-y do confocal volume17. A cintura w0 e o fator de estrutura S, descrevendo o alongamento wz do volume focal em z, S = wz/w0, são obtidos a partir de uma medição de calibração de ponto FCS realizada com corantes espectralmente similares e mesmas configurações ópticas usando valores já está disponíveis para o coeficiente de difusão Dtintura:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq8.jpg">, (5).
onde τd, a tintura é o tempo medido difusão média das moléculas do corante, obtidos a partir da montagem de um modelo para difusão tridimensional para os dados, tendo em transições de conta de uma fração T de todas as moléculas de N para um Estado de trio com uma constante de tempo ττ:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq9.jpg">.   (6)
Finalmente, coeficientes de difusão (D), valores de brilho molecular (ε) e a correlação cruzada relativa dos dados de sFCCS (rel.cc.) são calculados como segue:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq10.jpg">, (7).
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq11.jpg">, (8).
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq12.jpg">, (9).
onde GCruz(0) é a amplitude da função de correlação cruzada e <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq14.jpg"> é a amplitude da função de autocorrelação no canal eu-th.
Esta definição da relativa correlação cruzada, ou seja, usando o máximo em vez de dizer na equação 9, leva em conta que o número máximo de complexos de duas espécies de proteínas presentes em diferentes concentrações é limitado pelo espécies presentes em um número menor.
Brilho e número de correlação cruzada é baseado em uma análise do momento da intensidade da fluorescência para cada pixel de uma pilha de imagem adquirida ao longo do tempo em uma posição fixa na amostra, geralmente constituídos por ~ 100-200 quadros, com espectral dois canais ( g = verde canal, r = canal vermelho). Da média temporal <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img>eu<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg">eu e a variância <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq16.jpg"> </img>, o brilho molecular εi e número n são calculados em cada pixel e canal espectral (eu = g, r)18:
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq20.jpg">, (10).
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq21.jpg">. (11)
É importante notar que as equações determinadas se aplicam para o caso ideal de um verdadeiro detector de contagem de fótons. Para sistemas de detecção analógica, as equações seguintes aplicam-se a19,20:
<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq22.jpg">, (12).
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq23.jpg">.   (13)
Aqui, S é o fator de conversão entre fótons detectados e as contagens de Digitas gravadas, <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> é o ruído de leitura e deslocamento refere-se ao deslocamento de intensidade do detector. Geralmente, essas quantidades devem ser calibradas, para qualquer tipo de detector, com base na variação do detector de medição em função da intensidade de iluminação constante19, por exemplo, uma superfície reflexiva de metal ou solução corante seco. O deslocamento pode ser determinada medindo-se a taxa de contagem para uma amostra sem luz de excitação. Realizando-se uma regressão linear da variância associada detector <img alt="Equation 25" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq25.jpg"> contra o enredo de intensidade (eu), S e <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> pode ser determinado19:
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq27.jpg">.   (14)
Finalmente, o brilho de correlação cruzada é calculado em cada pixel e é definido em geral como21
<img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq28.jpg">, (15).
onde <img alt="Equation 29" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq29.jpg"> é a Cruz-variância <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq30.jpg"> </img>.
Para filtrar as flutuações long-lived, todos ccN & cálculos B são executados seguindo um vagão de filtragem, de forma independente para cada pixel de22. Brevemente, ni, εeu (eu = g, r) e Bcc são calculados em deslizamento segmentos de , por exemplo, 8-15 frames. Assim obtidos podem ser então a média dos valores para obter o último pixel valores número e brilho.
Análise de estequiometria A fim de estimar a estequiometria de complexos de proteínas em contatos do celular, o brilho molecular pode ser analisado separadamente em cada canal espectral para o sFCCS ou ccN & B dados. No sFCCS, um valor de brilho é obtido por medição em cada canal. Em ccN & B, um histograma de brilho de todos os pixels correspondentes para o contato célula-célula é obtido e o valor médio (ou mediano) pode ser usado como brilho representativo para a medição. Realizando a mesma análise em uma referência monomérica, todos os valores de brilho podem ser normalizados para obter diretamente o estado oligoméricos médio dos complexos proteína detectada. Neste ponto, é importante corrigir a presença de FPs não-fluorescente, que pode resultar em uma subestimação do estado oligoméricas. Isto normalmente é realizado medindo-se o brilho de uma proteína dimérica homo referência do23,24 usando uma cor sFCS ou número e brilho (N & B).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:596px;" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM growth medium</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-01548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-35500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P10-023100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TurboFect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:95px;">DSMZ</td>
			<td style="width:119px;">ACC 635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Alexa Fluor 488 NHS Ester</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Alderich</td>
			<td style="width:119px;">83689-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid DNA</td>
			<td style="width:95px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:95px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35-mm glass bottom dishes</td>
			<td style="width:95px;">CellVis</td>
			<td style="width:119px;">D35-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM780 confocal</td>
			<td style="width:95px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MATLAB software package</td>
			<td style="width:95px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">&#160;2015b&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Neubauer cell counting chamber</td>
			<td style="width:95px;">Marienfeld</td>
			<td align="right" style="width:119px;">640110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts

Uma variedade de processos biológicos envolve interações célula-célula, normalmente mediadas por proteínas que interagem na interface entre células vizinhas. De interesse, apenas alguns ensaios são capazes de sondagem especificamente tais interações diretamente em células vivas. Aqui, apresentamos um ensaio para medir a ligação de proteínas expressado nas superfícies das células vizinhas, em contatos do celular. Este ensaio consiste em duas etapas: mistura de celulas que expressam as proteínas de interesse fundido a diferentes proteínas fluorescentes, seguido por medições de espectroscopia de flutuação de fluorescência em contatos de celular usando um laser confocal microscópio. Podemos demonstrar a viabilidade deste teste em um contexto biologicamente relevante medindo as interações da proteína amiloide precursora, como 1 (APLP1) através de junções célula-célula. Nós fornecemos protocolos detalhados sobre a aquisição de dados usando técnicas baseadas em fluorescência (varredura de espectroscopia de correlação cruzada de fluorescência, número de correlação cruzada e análise de brilho) e as calibrações de instrumentos necessários. Além disso, discutimos os passos críticos na análise dos dados e como identificar e corrigir as variações de sinal externo, espúrios, tais como as causadas por movimento fotobranqueamento ou célula.
Em geral, o ensaio apresentado é aplicável a qualquer homo - ou interação da proteína-proteína heterotypic em contatos de celular, entre as células dos tipos iguais ou diferentes e pode ser implementado em um comercial laser confocal microscópio. Um requisito importante é a estabilidade do sistema, que deve ser suficiente para sondar difusiva dinâmica das proteínas de interesse ao longo de vários minutos.

Um primeiro teste para o ensaio de interação da proteína-proteína, ou seja, mistura de celulas que expressam proteínas fluorescentes espectralmente distintas, seguidas por sFCCS/ccN & B as medições (Figura 1), deve ser realizada em proteínas que não são esperadas para interagir no contato célula-célula (ou seja, um controle negativo). Portanto, misturavam-se células HEK 293T expressando myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-pal...

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A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Este protocolo descreve uma abordagem de baseados em espectroscopia de flutuação de fluorescência para investigar interações entre proteínas mediando as interações célula-célula, ou seja, as proteínas localizadas em cruzamentos de célula, diretamente em células vivas. Nós fornecemos orientações detalhadas na calibração de instrumentos, aquisição de dados e análise, incluindo correcções de fontes possível artefato.

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Esse método pode ajudar a entender questões-chave no campo de interação célula-celular, como quais receptores mediam a adesão ou reconhecimento em contatos célula-célula e se ligands específicos desencadeiam suas interações. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite investigar tais interações diretamente em células vivas sem necessidade de fixação celular ou interrupção. Embora este método seja usado para investigar interações entre células cultivadas, ele também pode ser aplicado a outros sistemas de vesículas mono-membranas ou mesmo pequenos organismos modelo.Geralmente, indivíduos novos neste método devem verificar se sua amostra é estável o suficiente para permitir a aquisição ao longo de alguns minutos, inspecionando cuidadosamente o movimento celular e variações lentas de sinal. Primeiro, semear o número apropriado de células em pelo menos quatro poços de uma placa de seis poços por dia antes da transfecção. Cultura as células a 37 graus Celsius 5% dióxido de carbono no DMEM médio suplementado com 10% FBS e 1%L-glutamina.Para realizar um experimento básico transfect plasmids para a proteína de interesse fundido a uma proteína verde ou amarela fluorescente e uma proteína fluorescente vermelha em poços separados. Após quatro horas, remova o meio de crescimento e lave cada poço suavemente com um mililitro de PBS suplementado com magnésio e cálcio caindo PBS na borda do poço para evitar o descolamento das células durante a lavagem. Em seguida, remova o PBS.Adicione aproximadamente 50 microliters de solução EDTA para soltar-se em cada poço para facilitar o descolamento das células. Depois de incubar a 37 graus Celsius por dois minutos, agite lentamente a placa de seis poços lateralmente para desprender as células. Em seguida, adicione 950 microliters de meio de crescimento a cada poço e resuspense as células, pipetando algumas vezes para cima e para baixo, desprendendo todas as células do fundo do poço.Certifique-se de que as células são resuspended adequadamente e separados uns dos outros, verificando visualmente a ausência de grandes agregados celulares após a ressuspensão. Transfira a solução celular de um poço para o poço correspondente. Misture suavemente por pipetting algumas vezes para cima e para baixo.Em seguida, semear as células mistas em um prato de fundo de vidro de 35 milímetros e cultivar as células semeadas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por um dia. No software de microscópio confocal de varredura a laser configurar o caminho óptico. Para evitar o crosstalk espectral, selecione duas faixas separadas para excitar e detectar mEGFP ou mEYFP e mCherry ou mCardinal sequencialmente e selecione faixas do Switch em todas as linhas.Para a detecção use filtros apropriados para ambos os canais. Coloque o prato contendo as células mistas no suporte da amostra. Depois de esperar 10 minutos para garantir o equilíbrio da temperatura e reduzir a deriva do foco, concentre-se nas células usando a luz de transmissão no menu Localizar.Procure por um par de células vermelhas e verdes em contato entre si. Em seguida, selecione um caminho de varredura perpendicular para contato célula-celular usando o botão Crop. Zoom para alcançar um tamanho de pixel de 50 a 200 nanômetros e selecione Linha no modo Scan.Defina o tamanho do quadro para 128 por um pixel. Defina a velocidade de varredura para o valor máximo permitido. Em seguida, definir ciclos para 100.000 a 500.000.Depois disso, escolha os poderes laser apropriados. Ajuste os detectores para o modo de contagem de fótons. Pressione o Experimento Start para iniciar a aquisição.Exporte os arquivos de dados brutos para uma imagem TIF RGB em formato de dados brutos. Este arquivo conterá um kymograph com os dados do canal verde e vermelho no canal denominado G e R da imagem, respectivamente. Em seguida, importe o arquivo TIF com o software de análise apropriado e prossiga para realizar a análise.Alinhe as linhas executando uma média de tempo de segmento com blocos de 500 a 1000 linhas. Determine a posição da membrana em cada bloco. Em seguida, mude todos os blocos para a mesma posição lateral.Resumindo todas as linhas alinhadas ao longo do eixo temporal e ajuste o perfil de intensidade média usando uma função gaussiana. Defina os pixels correspondentes à membrana como todos os pixels dentro de mais ou menos 2,5 sigma da posição da membrana, e resumir a intensidade desses pixels em cada linha obtendo um único valor de sinal fluorescente para cada ponto de tempo. Se for observado branqueamento de foto, aplique uma correção de branqueamento, encaixando a série temporal de fluorescência da membrana com uma função exponencial dupla e aplicando a fórmula de correção apropriada.Calcule as funções de auto e correlação de acordo com as equações apropriadas. Para melhorar a confiabilidade da análise e evitar artefatos realizar os cálculos para 10 a 20 segmentos iguais da medição total. Inspecione as séries temporências de fluorescência e as funções de correlação em cada segmento e remova segmentos claramente distorcidos.Finalmente, média de todos os segmentos não distorcidos. Ao analisar seus dados, inspecione cuidadosamente as séries temporâneas de intensidade e as funções de correlação de cada segmento para evitar distorções, por exemplo, devido a vesículas intracelulares na periferia da membrana. Uma imagem de intensidade das células HEK 293T expressando myristolyated-palmitoylated-mEYFP ou mCardinal é mostrada aqui.Observou-se uma correlação cruzada relativa perto de zero, enquanto as funções de autocorrelação mostram tempos característicos de decomposição de 10 a 20 milissegundos para a difusão de myristolyated-palmitoylated-mEYFP e mCardinal na membrana plasmática. As funções de correlação cruzada das medidas sFCCS das células HEK 293T expressando heterodimer miristolyated-palmitoylated-mCardinal-mEYFP tiveram amplitudes positivas e mostraram tempos de decomposição semelhantes à função de autocorrelação. As medições de sFCCS em contatos célula-celular entre células aplp1-mEYFP e APLP1-mCardinal resultou em uma correlação relativa positiva de 0,45.As funções de correlação sFCCS obtidas a partir de medições em clusters APLP1 em contatos célula-célula mostraram dinâmica fortemente reduzida como evidente de grandes tempos de decadência nas oscilações em grandes tempos de defasagem. Após a adição de íons de zinco, a correlação cruzada relativa aumentou para um valor médio de 0,8. Além disso, o brilho molecular aumentou significativamente de pequenos oligômeros para multimers maiores, consistindo de 10 a 50 monômeros em cada célula.Instabilidades transitórias podem resultar em uma função de correlação cruzada com valores negativos ou uma alta correlação cruzada falsa positiva. As funções de correlação correspondentes normalmente se desviam fortemente das da maioria dos segmentos. Como uma abordagem complementar ao número de correlação cruzada sFCCS e brilho pode ser usado para detectar interações proteína-proteína.Ao tentar este procedimento é importante lembrar que a mistura de células transfeinadas é um passo crítico. Misture suavemente as células e otimize a eficiência de transfecção para aumentar a chance de encontrar células vermelhas e verdes em contato. Após seu desenvolvimento, essa técnica tem sido utilizada por pesquisadores no campo da imunologia para explorar as interações de moléculas de sinalização em sinapses imunológicas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Peptídeos biotinylated célula-penetrante para estudar interações da proteína-proteína intracelular

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Usando na transferência de energia de ressonância de fluorescência de Vitro para estudar a dinâmica dos complexos de proteínas em uma escala de tempo de milissegundo

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Aplicação de interferometria Biolayer (BLI) para o estudo de interações proteína-proteína em transcrição

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Avaliação de interações proteína-proteína usando uma técnica de digestão na membrana

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Uso de Termoforese microescala para medir interações proteína-lipídicas

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Um ensaio planário de motilidade para medir as propriedades biomodulantes de produtos naturais

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Espectroscopia de correlação de fluorescência de variação spot para análise de difusão molecular na membrana plasmática de células vivas

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...