Name: a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts
Uploaded: 2018-12-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

Эта работа была частично поддерживается, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Грант 254850309. Авторы благодарят Мадлен Luckner для критических чтении рукописи.

1. Пробоподготовка: Ячеек смешивания Assay
Примечание: Следующий протокол описывает перемешивания для адэрентных клеток. Он может быть изменен для клетки культивировали в подвеска.
<ol><li>Семя соответствующее количество клеток на тарелке 6-Ну, например, 800000 ГЭС 293T клетк?...

Экспериментальная процедура, описанная здесь позволяет расследование протеин транс взаимодействий в ячейке контактов, флуоресценции колебания спектроскопии методы, а именно sFCCS и ccN & B. Эти методы включают статистический анализ флуоресценции колебаний, излучаемых два спектральн...

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:596px;" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM growth medium</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-01548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-35500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P10-023100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TurboFect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:95px;">DSMZ</td>
			<td style="width:119px;">ACC 635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Alexa Fluor 488 NHS Ester</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Alderich</td>
			<td style="width:119px;">83689-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid DNA</td>
			<td style="width:95px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:95px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35-mm glass bottom dishes</td>
			<td style="width:95px;">CellVis</td>
			<td style="width:119px;">D35-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM780 confocal</td>
			<td style="width:95px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MATLAB software package</td>
			<td style="width:95px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">&#160;2015b&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Neubauer cell counting chamber</td>
			<td style="width:95px;">Marienfeld</td>
			<td align="right" style="width:119px;">640110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts

Целый ряд биологических процессов предполагает взаимодействие ячеек, обычно при посредничестве белки, которые взаимодействуют на уровне интерфейса между соседними ячейками. Интерес только несколько анализов способны конкретно зондирующего такого взаимодействия непосредственно в живых клетках. Здесь мы представляем assay измерить связывания белков, выраженных на поверхности соседние клетки, в ячейке контактов. Этот assay состоит из двух этапов: Микширование клеток, выражая протеинов интереса, сливается с различными флуоресцентных белков, следуют флуоресценции колебания спектроскопии измерений в ячейке контактов с помощью конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. Мы продемонстрировать возможности этот assay в биологически соответствующий контекст путем измерения взаимодействия белков амилоида прекурсоров как 1 (APLP1) через узлы ячеек. Мы предоставляем подробные протоколы на сбор данных, используя методы, основанные на флуоресцирования (сканирование флуоресцентной спектроскопии кросс корреляции, номер кросс корреляции и анализа яркости) и требуемый инструмент калибровки. Кроме того мы обсуждаем важнейшие шаги в анализ данных и как определить и исправить внешний, ложный сигнал вариации, например, те из-за Фотообесцвечивание или ячейки движения.
В целом представленные применима к любому гомо - или гетеротипичной протеин взаимодействия в ячейке контактов, между ячейками в одной или разных типов и могут быть реализованы на коммерческой конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. Важным требованием является стабильность системы, которая должна быть достаточной для зонда диффузионное динамики протеинов интереса в течение нескольких минут.

Первый тест для assay взаимодействия протеин протеина, т.е. смешивание клеток, выражая спектрально собственный флуоресцентных белков, следуют sFCCS/ccN & B измерений (рис. 1), должна быть выполнена на белки, которые не ожидается взаимодействие в ячейке конт...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Этот протокол описывает флуоресценции колебания спектроскопии-подход на основе для изучения взаимодействия белков, посредничество ячеек взаимодействия, т.е. белки локализованы в ячейке развязок, непосредственно в живых клетках. Мы предоставляем подробные руководящие принципы по калибровке, сбора и анализа данных, включая исправления возможных артефакт источникам.

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Этот метод может помочь понять ключевые вопросы в области взаимодействия от клетки к клетке, такие как, какие рецепторы являются посредниками в адгезии или распознавании контактов от клетки к клетке и вызывают ли конкретные лиганды их взаимодействия. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет исследовать такие взаимодействия непосредственно в живых клетках без необходимости фиксации клеток или нарушения. Хотя этот метод используется для исследования взаимодействий между культурными клетками, он также может быть применен к другим системам моно мембранных пузырьков или даже небольших модельных организмов.Как правило, лица, новые для этого метода должны проверить, что их образец достаточно стабилен, чтобы позволить приобретение в течение нескольких минут, тщательно проверяя движение клеток и медленные колебания сигнала. Во-первых, посеять соответствующее количество клеток, по крайней мере в четырех скважинах из шести скважин пластины за день до трансфекции. Культура клеток при 37 градусах по Цельсию 5%углекислый газ в среде DMEM дополняется 10%FBS и 1%L-глутамин.Для выполнения основного эксперимента трансфект плазмиды для белка интереса сливаются с зеленым или желтым флуоресцентным белком и красным флуоресцентным белком в отдельных скважинах. Через четыре часа удалить рост среды и мыть каждый хорошо осторожно с одним миллилитрОМ PBS дополняется магнием и кальцием снижается PBS на краю хорошо, чтобы предотвратить отслоение клеток во время стирки. Затем удалите PBS.Добавьте приблизительно 50 микролитров раствора EDTA падение мудрым к каждому хорошо, чтобы облегчить отслоение клеток. После инкубации при 37 градусах по Цельсию в течение двух минут, медленно встряхните шесть хорошо пластины боковой, чтобы отделить клетки. Далее добавьте 950 микролитров среды роста к каждой хорошо и повторно использовать клетки путем трубопроводов несколько раз вверх и вниз, тем самым отделяя все клетки от дна хорошо.Убедитесь, что клетки перерасходуются должным образом и отсоединяются друг от друга, визуально проверяя на отсутствие больших агрегатов клеток после повторного успения. Перенесите клеточный раствор одного хорошо в соответствующий колодец. Смешайте осторожно по трубе несколько раз вверх и вниз.Затем семя смешанных клеток на 35-миллиметровой стеклянной нижней блюдо и культуры семенных клеток при 37 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа в течение одного дня. В лазерном сканировании конфокального микроскопа программное обеспечение настроить оптический путь. Чтобы избежать спектрального перекрестного разговора, выберите два отдельных трека для возбуждения и обнаружения mEGFP или mEYFP и mCherry или mCardinal последовательно и выберите Switch треков каждой строки.Для обнаружения используйте соответствующие фильтры для обоих каналов. Поместите блюдо, содержащее смешанные клетки, на держатель образца. После ожидания 10 минут, чтобы обеспечить эквивалентность температуры и уменьшить дрейф фокусировки, сосредоточьтесь на ячейках, использующих трансмиссионный свет в меню Locate.Поиск пары красных и зеленых клеток в контакте друг с другом. Затем выберите путь сканирования перпендикулярно контакту от ячейки к ячейке с помощью кнопки Crop. Увеличьте масштаб, чтобы достичь размера пикселя от 50 до 200 нанометров и выберите линию в режиме сканирования.Установите размер кадра до 128 на один пиксель. Установите скорость сканирования до максимально допустимого значения. Затем установите циклы до 100 000 до 500 000.После этого выберите соответствующие лазерные силы. Установите детекторы в режим фотон-подсчета. Нажмите Начать эксперимент, чтобы начать приобретение.Экспорт необработанных файлов данных на изображение RGB TIF в формате необработанных данных. Этот файл будет содержать кимограф с зелеными и красными данными канала в канале, который называют G и R изображения, соответственно. Затем импорт файл TIF с соответствующим программным обеспечением анализа и приступить к проведению анализа.Выровняй линии, выполняя среднее время сегмента с блоками от 500 до 1000 линий. Определите положение мембраны в каждом блоке. Затем переложить все блоки в одно и то же боковое положение.Суммировать все выровненные линии вдоль оси времени и соответствовать среднему профилю интенсивности с помощью функции Gaussian. Определите пиксели, соответствующие мембране, как все пиксели в пределах плюс-минус 2,5 сигмы положения мембраны, и подведем итог интенсивности этих пикселей в каждой строке, получая единое флуоресцентное значение сигнала для каждой точки времени. Если наблюдается отбеливание фотографий, нанесите коррекцию отбеливания, уместив серию времени мембраны флуоресценцией с двойной экспоненциальной функцией и применяя соответствующую формулу коррекции.Рассчитайте функции автоматической и кросс-корреляции в соответствии с соответствующими уравнениями. Для повышения надежности анализа и избегая артефактов выполняются расчеты по 10-20 равным сегментам общего измерения. Проинспектировать функции времени и корреляции флуоресценции в каждом сегменте и удалить четко искаженные сегменты.Наконец, средние все не искажаемые сегменты. Анализируя данные, тщательно проверяйте сроки интенсивности и функции корреляции из каждого сегмента, чтобы избежать искажений, например, из-за внутриклеточных пузырьков на мембранной периферии. Интенсивность изображения HEK 293T клеток, выражаюющих миристолиированные-пальмитоилированные-mEYFP или mCardinal показано здесь.Относительная поперечная корреляция близка к нулю наблюдалась в то время как функции автокорреляции показывают характерные времена распада от 10 до 20 миллисекунд для диффузии миристолитарно-пальмитоилированных-mEYFP и mCardinal в плазменной мембране. Кросс-корреляционные функции измерений sFCCS клеток HEK 293T, выражают мембранные гетенодимеры миристолиированные-пальмитоилированные-mCardinal-mEYFP, имели положительные амплитуды и показывали те же времена распада, что и функция автокорреляции. Измерения sFCCS на контактах от клетки к клетке между APLP1-mEYFP и APLP1-mCardinal-выражая клетками привели к положительной относительной перекрестной корреляции 0.45.Функции корреляции sFCCS, полученные в результате измерений в кластерах APLP1 при контактах клеток-клеток, показали сильно сниженную динамику, о чем свидетельствуют большие периоды распада в колебаниях в большие периоды отставания. При добавлении иона цинка относительная поперечная корреляция увеличилась до среднего значения 0,8. Далее молекулярная яркость значительно увеличилась от мелких олигомеров до больших мультимеров, состоящих из от 10 до 50 мономеров на каждой клетке.Переходные нестабильности могут привести к кросс-корреляционные функции, имеющие отрицательные значения или высокой ложноположимой кросс-корреляции. Соответствующие функции корреляции обычно сильно отклоняются от функций большинства сегментов. В качестве дополнительного подхода к sFCCS кросс-корреляции число и яркость могут быть использованы для обнаружения белково-белковых взаимодействий.При попытке этой процедуры важно помнить, что смешивание трансфектных клеток является критическим шагом. Аккуратно смешайте клетки и оптимизируйте эффективность трансфекции, чтобы увеличить вероятность нахождения красных и зеленых клеток в контакте. После его развития этот метод был использован исследователями в области иммунологии для изучения взаимодействий сигнальных молекул в иммунологических синапсах.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Флуоресцентным на основе анализа фосфолипида Scramblase деятельности

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Анизотропию, как флуоресценция инструмента для изучения белок-белковых взаимодействий

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Биотинилированным клеток-проникая пептиды для изучения внутриклеточный белок белковых взаимодействий

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Применение биослойной интерферометрии (BLI) для изучения белково-белковых взаимодействий в транскрипции

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Оценка взаимодействия белкови-белков с использованием метода пищеварения On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Использование микромасштабного термофореза для измерения белково-липидных взаимодействий

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Планарный анализ подвижности для оценки биомодулирующих свойств натуральных продуктов

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Точечная вариационная флуоресцентная корреляционная спектроскопия для анализа молекулярной диффузии на плазматической мембране живых клеток

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...