Name: a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts
Uploaded: 2018-12-01T13:00:00
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Este trabajo fue parcialmente financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) conceder 254850309. Los autores agradecen Madlen Luckner para lectura crítica del manuscrito.

1. Preparación: Célula mezcla ensayo
Nota: El siguiente protocolo describe el procedimiento de mezcla para células adherentes. Puede ser modificada para que las células cultivadas en suspensión.
<ol><li>Un número apropiado de células en una placa de 6 pozos, por ejemplo, 800.000 células HEK 293T (cuentan con una cámara de recuento de Neubauer), un día antes de la transfección de la semilla. El número puede ser modificado dependiendo del tiempo entre siembra y transfecci?...

El procedimiento experimental que se describe aquí permite la investigación de proteínas trans interacciones en los contactos célula-célula, empleando técnicas de espectroscopia fluctuación de fluorescencia, a saber sFCCS y ccN & B. Estos métodos implican un análisis estadístico de las fluctuaciones de la fluorescencia emitida por dos separados espectralmente FPs fusionado a la proteína de interés en un contacto de dos células vecinas, cada una expresando uno o la otra proteína de fusión. La prese...

Muchos procesos biológicos ocurren en los sitios de las interacciones célula-célula, por ejemplo, célula adhesión1,2,3, célula fusion4 y reconocimiento celular5. Estos eventos son particularmente importantes durante el desarrollo de los organismos multicelulares y para la comunicación de la célula, por ejemplo, durante la respuesta inmune. Estos procesos son típicamente mediados por las proteínas que se localizan en la superficie, es decir, en la membrana plasmática (PM) de los vecinos de las células y sufren interacciones en el contacto de la célula que son precisamente regulado en espacio y tiempo. En muchos casos, estas interacciones son directo homo - o heterotípicos proteínas trans interacciones, pero pueden también implicar iones o ligandos actuando como enlazadores extracelulares1. Aunque de fundamental importancia, hay una falta de análisis de sondeo estas interacciones proteína-proteína específica directamente en el ambiente natural de las células vivas. Muchos métodos requieren o interrupción de la célula (por ejemplo, ensayos bioquímicos tales como co-inmunoprecipitación6), fijación (por ejemplo, algunas de las técnicas de súper-resolución de microscopía óptica y microscopia electrónica de la célula contacto con7), o son no específicos, por ejemplo, la agregación / ensayos de adherencia8,9. Para resolver este problema, se han implementado técnicas de fluorescencia basada en fluorescencia de resonancia energética transferencia (traste)10 o fluorescencia complementación11. Sin embargo, para lograr distancias suficientemente pequeñas entre fluoróforos, estos métodos requieren etiquetas fluorescentes en el lado extracelular de las proteínas10, potencialmente interferir con las interacciones trans .
Aquí, presentamos un ensayo alternativo basado en la fluorescencia para las interacciones proteína-proteína en los contactos célula-célula. Este enfoque combina enfoques de cross-correlación de fluorescencia (análisis espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia (sFCCS), número de la correlación cruzada y brillo (ccN & B)) y la mezcla de células que expresan un concepto de fusión de la proteína de interés, por ejemplo, un receptor de adhesión. Los receptores investigados en las dos células interactuantes están marcados con dos proteínas fluorescentes separadas espectralmente (FPs), desde el intracelular lado (ver figura 1A).
Los métodos empleados se basan en el análisis estadístico de las fluctuaciones de la fluorescencia inducida por el movimiento difusivo de las proteínas fluorescentes de fusión a través del volumen focal de un láser confocal de barrido microscopio. Más detalladamente, el análisis de sondas la difusión conjunta de las proteínas de interés en ambos vecinos PMs en los contactos célula-célula. Si las proteínas se someten a las interacciones trans , estos complejos trans llevará a proteínas fluorescentes emiten en dos canales espectrales, causando fluorescencia correlacionada fluctuaciones de ambos emisores. Por otro lado, si se produce no vinculante, las fluctuaciones del número de proteínas frente a PMs será independientes, no causando fluctuaciones correlacionadas. La adquisición puede realizarse de dos maneras: 1) sFCCS se basa en un análisis en forma de línea a través del contacto célula-célula y efectiva puntas de prueba de las interacciones en un lugar situado en la región de contacto. A través de un análisis temporal de las fluctuaciones de la fluorescencia, sFCCS proporciona también información dinámica, es decir, los coeficientes de difusión de complejos de proteína; 2) ccN & B se basa en un análisis pixel-wise de una secuencia de imágenes adquiridas en las regiones de contacto célula-célula. Tiene capacidad para sondear y mapa interacciones a lo largo de toda la región (en un plano focal) de contacto, pero no proporciona información sobre la dinámica. Ambos métodos pueden combinarse con un análisis de la luminosidad molecular, es decir, la señal de fluorescencia promedio emitida en la unidad de tiempo por solo difunde complejos de proteína y, así, proporcionar estimaciones de la estequiometría de los complejos de proteína en contactos de la célula.
En este artículo, le ofrecemos protocolos detallados para la preparación de la muestra, calibración del instrumento, adquisición de datos y análisis realizar el ensayo presentado en un comercial láser confocal de barrido microscopio. Los experimentos pueden realizarse en cualquier instrumento equipado con conteo de fotones o detectores analógicos y un objetivo con alta apertura numérica. Además discutir pasos críticos del protocolo y proporcionar esquemas de corrección para varios procesos causando fluctuaciones de señal artefactual, p. ej., detector ruido, movimiento fotoblanqueo o celular. Originalmente desarrollado para probar las interacciones entre las células adherentes, el ensayo puede ser modificado para que las células de suspensión, o adaptados a los sistemas modelo de membranas, por ejemplo, propiedades gigantes vesículas (2.fino) o plasma gigante vesículas de membrana (GPMVs), que permite la cuantificación de las interacciones en entornos diferentes lípidos o en la ausencia de un citoesqueleto organizado12,13.
Análisis de espectroscopia de fluorescencia de la correlación cruzada es una versión modificada de la espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia14 y fue diseñado específicamente para sonda lenta dinámica difusión en membranas de lípidos15. Se basa en una adquisición de exploración de línea perpendicular a la PM que contiene las proteínas fluorescentes de interés. Para probar las interacciones de dos especies de proteínas diferentemente etiquetadas, la adquisición se realiza en dos canales espectrales usando dos líneas láser y dos ventanas de detección de fluoróforos espectralmente separados. Debido a la dinámica de la difusión lenta de las proteínas en el PM (D≤ ~ 1 μm2/s), puede realizarse una medición libre de charla Cruz alternando el esquema de excitación de la línea a la línea15. El análisis comienza con: 1) un algoritmo de alineamiento corregir para el movimiento lateral de la célula basado en block-wise con un promedio de ~ 1000 líneas, 2) determinación de la posición con fluorescencia máxima señales decir, el PM posición, en cada bloque y cambio de 3) de todos los bloques a un común origen12,15, por separado en cada canal. A continuación, una selección automática de píxeles correspondiente a la PM se realiza seleccionando la región central de un ajuste gaussiano de la suma de todas las líneas alineadas (es decir, centro ± 2.5σ). Integración de la señal en cada línea produce la membrana fluorescencia serie f (t) en cada canal (g = green canal, r = canal rojo). Nota que el tamaño del pixel ha de ser pequeño, por ejemplo, < 200 nm, para reconstruir la forma del punto de difundir la función y encontrar su centro, correspondiente a la posición de la PM. En presencia de fotoblanqueo substancial, la serie de tiempo de fluorescencia en cada canal puede modelada con una función doble exponencial y luego corregir con la fórmula siguiente:16
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq2.jpg">.    (1)
Es importante tener en cuenta que esta fórmula corrige eficazmente las amplitudes y tiempos de difusión obtenidos del análisis de correlación de f (t)c, en comparación con las estimaciones del parámetro que se obtendría de la no corregida f (t). Entonces, las funciones de auto - y la correlación cruzada (ACFs / CCFs) de la fluorescencia señales se calculan:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq3v2.jpg">, (2).
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq4v2.jpg">, (3).
donde δF = F(t) - <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img> F(t)<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg"> </img> y = g, r.
Un modelo de difusión bidimensional entonces se acopla a todas las funciones de correlación (SFC):
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq7.jpg">.   (4)
Aquí N denota el número de proteínas fluorescentes en el volumen de observación y τd el tiempo de difusión para cada canal. Este modelo toma en cuenta que en la configuración experimental descrita, difusión de proteínas en la PM se presenta en el plano x-z, en contraste con la configuración de uso general de correlación de fluorescencia espectroscopia (FCS) experimentos en las membranas de sondeo difusión en el plano x-y del confocal volumen17. La cintura w0 y el factor de estructura S, describiendo la elongación wz del volumen focal en z, S = wz/w0, se obtienen de una medida de calibración punto de FCS realizada con tintes espectral similares y misma configuración óptica utilizando valores ya están disponibles para el coeficiente de difusión Dtinte:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq8.jpg">, (5).
donde τd, tinte es el tiempo medido medio difusión de las moléculas de colorante, de un modelo de difusión tridimensional de los datos, teniendo en las transiciones de la cuenta de una fracción T de todas las moléculas de N a una Estado triplete con una constante de tiempo ττ:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq9.jpg">.   (6)
Por último, coeficientes de difusión (D), los valores de brillo molecular (ε) y la relativa correlación cruzada de datos sFCCS (rel.cc.) se calculan como sigue:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq10.jpg">, (7).
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq11.jpg">, (8).
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq12.jpg">, (9).
donde GCruz(0) es la amplitud de la función de correlación cruzada y <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq14.jpg"> es la amplitud de la función de autocorrelación en el -ésimo canal.
Esta definición de la relativa correlación cruzada, es decir, utilizando máximo en lugar de decir en la ecuación 9, toma en cuenta que el número máximo de conjuntos de dos especies de proteínas presentes en diferentes concentraciones se ve limitado por la especies presentes en un número inferior.
Brillo y el número de la correlación cruzada se basa en un análisis del momento de la intensidad de fluorescencia para cada píxel de una pila de imagen adquirida con el tiempo en una posición fija en la muestra, por lo general consisten en ~ 100-200 marcos, con dos espectral canales () g = green canal, r = canal rojo). De la media temporal <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img>I<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg">i y varianza <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq16.jpg"> </img>, el brillo molecular εi y número n se calculan en cada pixel y canal espectral ( = g, r)18:
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq20.jpg">, (10).
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq21.jpg">. (11)
Es importante tener en cuenta que las ecuaciones dadas se aplican al caso ideal de un verdadero detector de recuento de fotones. Las ecuaciones siguientes aplican para sistemas de detección analógico,19,20:
<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq22.jpg">, (12).
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq23.jpg">.   (13)
Aquí, S es el factor de conversión entre fotones detectados y las cuentas de digitales grabadas, <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> es el ruido de lectura y offset se refiere a la compensación de la intensidad de detector. Por lo general, estas cantidades se deberán calibrar, para cualquier tipo de detector, basado en la medición de la variación del detector en función de la intensidad de iluminación constante19, p. ej., una superficie metálica reflectora o solución colorante seco. El offset puede determinarse midiendo la tasa de conteo para una muestra sin luz de excitación. Realizando una regresión lineal de la varianza asociados detector <img alt="Equation 25" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq25.jpg"> contra la trama de la intensidad (), S y <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> puede ser resuelto19:
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq27.jpg">.   (14)
Por último, el brillo de la correlación cruzada se calcula en cada pixel y se define en general como21
<img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq28.jpg">, (15).
donde <img alt="Equation 29" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq29.jpg"> es la varianza de la Cruz <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq30.jpg"> </img>.
Para filtrar las fluctuaciones de larga duración, todos ccN y cálculos de B se realizan siguiendo un furgón filtrado, independientemente para cada pixel22. En Resumen, ni, ε ( = g, r) y Bcc se calculan en desplazamiento de segmentos de p. ej., 8-15 marcos. Los valores así obtenidos pueden ser promediados entonces para obtener el pixel final valores de número y brillo.
Análisis de la estequiometría Para estimar la estequiometría de los complejos de la proteína en los contactos célula-célula, el brillo molecular puede analizarse por separado en cada canal espectral para la sFCCS o ccN y B los datos. En sFCCS, un valor de brillo se obtiene por medición de cada canal. En ccN y B, se obtiene un histograma de brillo de los píxeles correspondientes al contacto célula-célula y el valor promedio (o mediano) puede utilizarse como brillo representativo para la medición. Por realizar el mismo análisis en referencia monomérica, todos los valores de brillo pueden ser normalizados para obtener directamente el estado oligomérico promedio de los complejos de proteína detectado. En este punto, es importante corregir la presencia de FPs no fluorescente que puede resultar en una subestimación del estado oligomérico. Normalmente esto se realiza midiendo el brillo de un homo dimérico referencia proteína23,24 con sFCS un color o número y el brillo (N & B).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:596px;" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM growth medium</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-01548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-35500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P10-023100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TurboFect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:95px;">DSMZ</td>
			<td style="width:119px;">ACC 635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Alexa Fluor 488 NHS Ester</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Alderich</td>
			<td style="width:119px;">83689-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid DNA</td>
			<td style="width:95px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:95px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35-mm glass bottom dishes</td>
			<td style="width:95px;">CellVis</td>
			<td style="width:119px;">D35-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM780 confocal</td>
			<td style="width:95px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MATLAB software package</td>
			<td style="width:95px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">&#160;2015b&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Neubauer cell counting chamber</td>
			<td style="width:95px;">Marienfeld</td>
			<td align="right" style="width:119px;">640110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts

Una variedad de procesos biológicos implica las interacciones célula-célula, generalmente mediadas por las proteínas que interactúan en la interfaz entre células vecinas. De interés, sólo algunos ensayos son capaces de sondear específicamente tales interacciones directamente en las células vivas. Aquí, presentamos un ensayo para medir la Unión de las proteínas expresadas en las superficies de las células vecinas, en los contactos célula-célula. Este análisis consisten de dos pasos: mezcla de células que expresan las proteínas de interés unida a diversas proteínas fluorescentes, seguido por las medidas de espectroscopia de fluorescencia fluctuación en los contactos de la célula usando un láser confocal de barrido microscopio. Demostramos la factibilidad de este ensayo en un contexto biológico pertinente mediante la medición de las interacciones de la proteína amiloidea del precursor-como 1 (APLP1) a través de las ensambladuras de la célula. Ofrecemos protocolos detallados en la adquisición de datos usando técnicas basadas en fluorescencia (análisis de espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia, número de la correlación cruzada y análisis de brillo) y las calibraciones del instrumento requerido. Además, discutimos los pasos críticos en el análisis de datos y cómo identificar y corregir las variaciones de la señal externa, falsas, tales como debido al movimiento de fotoblanqueo o celular.
En general, el análisis presentado es aplicable a cualquier homo - o heterotípicos proteínas interacción en los contactos de la célula, las células de las misma o diferentes tipos y pueden implementarse en un comercial láser confocal de barrido microscopio. Un requisito importante es la estabilidad del sistema, que debe ser suficiente para sondear la dinámica de difusión de las proteínas de interés durante varios minutos.

Una primera prueba para el análisis de interacción de proteínas, es decir, mezcla de células que expresan proteínas fluorescentes espectralmente distintas seguidas por sFCCS/ccN y las mediciones de B (figura 1), debe realizarse en las proteínas que no se esperan que interactuar en el contacto célula-célula (es decir, un control negativo). Por lo tanto, se mezclaron células HEK 293T expresando myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-P...

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A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Este protocolo describe un enfoque basado en la espectroscopia de la fluorescencia fluctuación para investigar las interacciones entre las proteínas median las interacciones célula-célula, es decir, proteínas localizadas en las ensambladuras de la célula, directamente en las células vivas. Ofrecemos directrices detalladas sobre la calibración del instrumento, adquisición de datos y análisis, incluyendo las correcciones a las fuentes de posible artefacto.

Un análisis de espectroscopia de fluorescencia fluctuación de interacciones de proteínas en los contactos célula-célula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Este método puede ayudar a comprender las preguntas clave en el campo de interacción de célula a célula, como qué receptores median la adhesión o el reconocimiento en los contactos de célula a célula y si los ligandos específicos desencadenan sus interacciones. La principal ventaja de esta técnica es que permite investigar tales interacciones directamente en células vivas sin necesidad de fijación o interrupción celular. Aunque este método se utiliza para investigar las interacciones entre las células cultivadas, también se puede aplicar a otros sistemas de vesículas mono-membrana o incluso pequeños organismos modelo.Generalmente, los individuos nuevos en este método deben comprobar que su muestra es lo suficientemente estable como para permitir la adquisición durante unos minutos inspeccionando cuidadosamente el movimiento de la célula y las variaciones lentas de la señal. En primer lugar, sembrar el número adecuado de células en al menos cuatro pocillos de una placa de seis pocillos al día antes de la transfección. Cultivo de las células a 37 grados Celsius 5%dióxido de carbono en el medio DMEM complementado con 10%FBS y 1%L-glutamina.Realizar un experimento básico de plásmidos transfectos para la proteína de interés fusionado con una proteína fluorescente verde o amarilla y una proteína fluorescente roja en pozos separados. Después de cuatro horas retirar el medio de crecimiento y lavar cada pozo suavemente con un mililitro de PBS complementado con magnesio y calcio cayendo PBS en el borde del pozo para evitar el desprendimiento de las células durante el lavado. A continuación, quite el PBS.Añadir aproximadamente 50 microlitros de solución EDTA gota sabia a cada pozo para facilitar el desprendimiento de las células. Después de incubar a 37 grados Celsius durante dos minutos, agitar lentamente la placa de seis pozos lateralmente para separar las células. A continuación, agregue 950 microlitros de medio de crecimiento a cada pozo y resuspendir las células pipeteando unas cuantas veces hacia arriba y hacia abajo, separando así todas las células del fondo del pozo.Asegúrese de que las celdas se resuspenden correctamente y se desprendan unas de otras comprobando visualmente la ausencia de agregados de celdas grandes después de la resuspensión. Transfiera la solución celular de un pozo al pozo correspondiente. Mezclar suavemente pipeteando unas cuantas veces hacia arriba y hacia abajo.Luego siembra las células mixtas en un plato inferior de vidrio de 35 milímetros y cultiva las células de las semillas a 37 grados Celsius en 5% dióxido de carbono durante un día. En el software de microscopio confocal de escaneo láser configurar la ruta óptica. Para evitar la interferencia espectral, seleccione dos pistas separadas para excitar y detectar mEGFP o mEYFP y mCherry o mCardinal secuencialmente y seleccione Cambiar pistas cada línea.Para la detección utilice filtros adecuados para ambos canales. Coloque el plato que contiene las células mezcladas en el portacuchillas. Después de esperar 10 minutos para asegurar el equilibrio de temperatura y reducir la deriva de enfoque, concéntrese en las celdas utilizando la luz de transmisión en el menú Localizar.Busque un par de celdas rojas y verdes en contacto entre sí. A continuación, seleccione una ruta de exploración perpendicular al contacto de celda a celda mediante el botón Recortar. Zoom para lograr un tamaño de píxel de 50 a 200 nanómetros y seleccione Línea en modo de escaneo.Establezca el tamaño del fotograma en 128 por uno de los píxeles. Establezca la velocidad de escaneo en el valor máximo permitido. A continuación, establezca los ciclos en 100.000 a 500.000.Después de esto, elija las potencias láser adecuadas. Establezca los detectores en el modo de recuento de fotones. Pulse Iniciar experimento para iniciar la adquisición.Exporte los archivos de datos sin procesar a una imagen TIF RGB en formato de datos sin procesar. Este archivo contendrá un kymograph con los datos del canal verde y rojo en el canal llamado G y R de la imagen, respectivamente. A continuación, importe el archivo TIF con el software de análisis adecuado y proceda a realizar el análisis.Alinee las líneas realizando un promedio de tiempo de segmento con bloques de 500 a 1000 líneas. Determinar la posición de la membrana en cada bloque. A continuación, cambie todos los bloques a la misma posición lateral.Sume todas las líneas alineadas a lo largo del eje de tiempo y ajuste el perfil de intensidad media utilizando una función gaussiana. Defina los píxeles correspondientes a la membrana como todos los píxeles dentro de más o menos 2,5 sigma de la posición de la membrana, y sume la intensidad de estos píxeles en cada línea obteniendo un único valor de señal fluorescente para cada punto de tiempo. Si se observa blanqueo fotográfico, aplique una corrección de blanqueo ajustando la serie temporal de fluorescencia de membrana con una doble función exponencial y aplicando la fórmula de corrección adecuada.Calcule las funciones de correlación automática y cruzada de acuerdo con las ecuaciones adecuadas. Para mejorar la fiabilidad del análisis y evitar artefactos, realice los cálculos de 10 a 20 segmentos iguales de la medición total. Inspeccione la serie temporal de fluorescencia y las funciones de correlación en cada segmento y elimine los segmentos claramente distorsionados.Por último, promedia todos los segmentos no distorsionados. Al analizar los datos, inspeccione cuidadosamente las series temporales de intensidad y las funciones de correlación de cada segmento para evitar distorsiones, por ejemplo, debido a las vesículas intracelulares en la periferia de la membrana. Aquí se muestra una imagen de intensidad de las células HEK 293T que expresan myristolyated-palmitoylated-mEYFP o mCardinal.Se observó una correlación cruzada relativa cercana a cero, mientras que las funciones de autocorrelación muestran tiempos de descomposición característicos de 10 a 20 milisegundos para la difusión de miristolyated-palmitoylated-mEYFP y mCardinal en la membrana plasmática. Las funciones de correlación cruzada de las mediciones sFCCS de células HEK 293T que expresaban heterodimermero anclado por membrana miristolyated-palmitoylated-mCardinal-mEYFP tenían amplitudes positivas y mostraban tiempos de descomposición similares a los de la función de autocorrelación. Las mediciones de sFCCS en contactos de célula a célula entre APLP1-mEYFP y APLP1-mCardinal-expressinging dio como resultado una correlación cruzada relativa positiva de 0,45.Las funciones de correlación sFCCS obtenidas a partir de mediciones a través de clústeres APLP1 en contactos de células celulares mostraron una dinámica fuertemente reducida como evidente a partir de grandes tiempos de decaimiento en las oscilaciones en tiempos de retraso grandes. Tras la adición de iones de zinc, la correlación cruzada relativa aumentó a un valor promedio de 0,8. Además, el brillo molecular aumentó significativamente de pequeños oligómeros a multimers más grandes que consisten en 10 a 50 monómeros en cada célula.Las inestabilidades transitorias pueden dar lugar a una función de correlación cruzada que tenga valores negativos o una alta correlación cruzada falsa positiva. Las funciones de correlación correspondientes normalmente se desvían fuertemente de las de la mayoría de los segmentos. Como un enfoque complementario al número de correlación cruzada sFCCS y el brillo se puede utilizar para detectar interacciones proteína-proteína.Al intentar este procedimiento es importante recordar que la mezcla de células trans infectadas es un paso crítico. Mezcle suavemente las células y optimice la eficiencia de la transfección para aumentar la posibilidad de encontrar células rojas y verdes en contacto. Después de su desarrollo esta técnica ha sido utilizada por investigadores en el campo de la inmunología para explorar las interacciones de las moléculas de señalización en las sinapsis inmunológicas.

Research

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Biochemistry

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Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Uso en transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de Vitro para el estudio de la dinámica de los complejos de la proteína en una escala de tiempo de milisegundos

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Aplicación de la interferometría de Biolayer (BLI) para el estudio de las interacciones proteínas y proteínas en la transcripción

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluación de interacciones proteínas-proteínas utilizando una técnica de digestión en la membrana

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Uso de la termoforesis a microescala para medir las interacciones proteína-lípido

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Un ensayo de motilidad planarian para medir las propiedades biomodulantes de los productos naturales

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Espectroscopía de correlación de fluorescencia de variación puntual para el análisis de difusión molecular en la membrana plasmática de células vivas

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...