Name: a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts
Uploaded: 2018-12-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

Detta arbete var delvis stöds av Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG) bevilja 254850309. Författarna vill tacka Madlen Luckner för kritisk läsning av manuskriptet.

1. provberedning: Cell-Cell blandning Assay
Obs: Följande protokoll beskriver hur blandning vidhäftande celler. Det kan ändras för celler odlade i suspension.
<ol><li>Kärna ur ett lämpligt antal celler på en 6-well platta, exempelvis 800 000 HEK 293T celler (räknat med en Neubauer räknar kammare), en dag innan transfection. Numret kan ändras beroende på vilken tid mellan sådd och transfection och justerat för andra celltyper. För att utföra en grundläggande experimen...

Den experimentella metod som beskrivs här kan utredningen av protein-protein trans interaktioner på cell-cell kontakter, anställa fluorescens fluktuation spektroskopi tekniker, nämligen sFCCS och ccN & B. Dessa metoder innebär en statistisk analys av fluorescens fluktuationer som avges av två spektralt separerade FPs smält till proteinernas sevärdheter på en kontakt med två angränsande celler, var och en uttrycker en eller den andra fusionsprotein. Förekomsten av trans komplex kvantifieras i...

Många biologiska processer inträffar på platser av cell-cell interaktioner, t.ex., cell-cell adhesion1,2,3, cell-cell fusion4 och cellulära erkännande5. Sådana händelser är särskilt viktigt under utvecklingen av flercelliga organismer och för cell-cell kommunikation, exempelvis under immunsvar. Dessa processer är typiskt medierad av proteiner som är lokaliserade på ytan, dvs på plasmamembranet (PM) på angränsande celler och genomgå särskilda interaktioner i cell cell kontakt som är tydligt reglerad i utrymme och tid. I många fall, dessa interaktioner är direkt homo- eller heterotypic protein-protein trans interaktioner, men kan också innebära joner eller ligander egenskap extracellulära linkers1. Även om det är av grundläggande betydelse, finns det brist på analyser sondera dessa specifika protein-protein interaktioner direkt i den ursprungliga miljön i levande celler. Många metoder antingen kräva cell störningar (t.ex. biokemiska analyser såsom co-immunoprecipitation6), fixering (t.ex. vissa super-upplösning optisk mikroskopi tekniker och elektronmikroskopi av cell-cell kontakter7), eller är icke-specifika, t.ex. aggregering / vidhäftning analyser8,9. För att lösa problemet, har fluorescens tekniker genomförts utifrån fluorescens resonans energi överföring (bandet)10 eller fluorescens komplettering11. Men för att uppnå tillräckligt små avstånd mellan fluorophores, kräver dessa metoder fluorescerande etiketterna på den extracellulära sidan av proteiner10, potentiellt störa trans interaktioner.
Här presenterar vi alternativa fluorescens-baserat test för protein-protein interaktioner på cell-cell kontakter. Denna strategi kombinerar fluorescens cross-korrelation strategier (skanning fluorescens cross-korrelation spektroskopi (sFCCS), cross-korrelation nummer och ljusstyrka (ccN och B)) och blandning av celler som uttrycker en fusion konstruktion av proteinet av intresse, t.ex. en vidhäftning-receptorn. De undersökta receptorerna i två samverkande cellerna är märkta med två spektralt separerade fluorescerande proteiner (FPs), från den intracellulära (se figur 1A).
De sysselsatta metoderna baseras på den statistiska analysen av fluorescens fluktuationer inducerad av diffus rörelse av fluorescerande fusionsproteinerna genom fokal volymen av en confocal laser skanning Mikroskop. Mer i detalj sonder analysens samtidig diffusionen av proteinerna av intresse för båda angränsande PMs på cell-cell kontakter. Om proteinerna genomgå trans interaktioner, kommer dessa trans komplex bära fluorescerande proteiner avger i båda spektrala kanaler, orsakar korrelerade fluorescens fluktuationer i både utsläppsländerna. Däremot, om ingen bindning uppstår, blir de antal svängningarna av proteiner i inför PMs oberoende, orsakar inga korrelerade fluktuationer. Förvärv kan utföras på två sätt: 1) sFCCS är baserat på en rad-formade scan hela cell cell kontakten och effektivt sonder samspelet i en plats som ligger i regionen kontakt. Genom en temporal analys av fluorescens svängningar ger sFCCS också dynamics information, dvs Diffusionskoefficienterna av proteinkomplex; (2) ccN & B bygger på en pixel-wise analys av en sekvens av bilder som förvärvats på cell-cell kontakt regionerna. Den har förmåga att söka och karta interaktioner längs hela kontakta region (i ett fokalplan), men ger inte information om dynamics. Båda metoderna kan kombineras med en analys av molekylär ljusstyrka, dvs genomsnittliga fluorescens signal som avges i tidsenheten av enda diffuserande proteinkomplex och, således ge uppskattningar av stökiometri av proteinkomplex på cell-cell kontakter.
I denna artikel tillhandahåller vi detaljerade protokoll för provberedning, instrumentkalibrering, datainsamling och analys att utföra presenterade analysen på en kommersiell confocal laserscanning mikroskopet. Experimenten kan utföras på något instrument utrustat med photon counting eller analoga detektorer och ett mål med hög numeriska bländaröppningen. Vi har ytterligare diskutera kritiska steg i protokollet och ger korrigering system för flera processer som orsakar tingsliga signal fluktuationer, exempelvis detektor buller, fotoblekning eller cell rörelse. Utvecklades ursprungligen för att undersöka samspelet mellan vidhäftande celler, analysen kan ändras för suspension celler eller anpassad till modellen membransystem, t.ex. giant unilamellar blåsor (GUVs) eller giant plasma membranet blåsor (GPMVs), så att den kvantifiering av interaktioner i olika lipid miljöer eller i avsaknad av en organiserad cytoskelettet12,13.
Scanning fluorescens cross-korrelation spektroskopi är en modifierad version av fluorescens cross-korrelation spektroskopi14 och utformades sond långsam diffus dynamics i lipid membran15. Den är baserad på en linje scan förvärv vinkelrätt till PM som innehåller de fluorescerande proteinerna av intresse. För att undersöka samspelet mellan två olika märkta proteinet arter, utförs förvärvet i två spektrala kanaler med två laserlinjer och två upptäckt windows för spektralt separerade fluorophores. På grund av långsam diffusion dynamiken av proteiner i PM (D≤ ~ 1 µm2per sekund), en cross-talk-gratis mätning kan utföras av omväxlande excitation systemet från linje till linje15. Analysen börjar med: 1) en justering algoritm korrigera för laterala cell rörelse utifrån block-wise genomsnitt ~ 1000 rader, 2) bestämning av placerar med maximal fluorescens signaldvs PM position, i varje block och 3) skiftande av alla block till ett gemensamt ursprung12,15, separat i varje kanal. Ett automatiskt val av pixlar motsvarar PM utförs sedan genom att välja regionen centrala från en Gaussisk passform av summan av alla anpassade linjer (dvs center ± 2.5σ). Integration av signalera i varje rad ger membran fluorescens tidsserierna F(t) i varje kanal (g = grön kanal, r = röda kanalen). Observera att pixelstorlek måste vara liten nog, t.ex. < 200 nm, att rekonstruera formen på punkten sprida funktion och hitta dess centrerar, motsvarar positionen för PM. I närvaro av betydande fotoblekning, fluorescens tidsserierna i varje kanal kan modelleras med en dubbel-exponentialfunktionen och sedan korrigeras med följande formel:16
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq2.jpg">.    (1)
Det är viktigt att notera att denna formel effektivt korrigerar både amplituder och diffusion gånger erhållits från korrelation analys av F(t)c, jämfört med parametern uppskattningar som skulle erhållas från den okorrigerade F(t). Sedan funktionerna auto - och cross-korrelation (ACFs / CCFs) av fluorescensen signaler beräknas:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq3v2.jpg">, (2).
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq4v2.jpg">, (3).
där δFjag = Fjag(t) - <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img> Fjag(t)<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg"> </img> och jag = g, r.
En tvådimensionell diffusion modell monteras sedan alla korrelation funktioner (CFs):
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq7.jpg">.   (4)
Här, betecknar N antalet fluorescerande proteiner i observation volym och τd diffusion tiden för varje kanal. Denna modell tar hänsyn att beskrivs i experimentell inställningen diffusion av proteiner i PM uppstår i x-z planet, i motsats till den vanliga konfigurationen av fluorescens korrelation spektroskopi (FCS) experiment på membran sondering diffusion i x-y-planet av confocal volym17. Midjan w0 och struktur faktor S, som beskriver töjning wz av fokal volymen i z, S = wz/w0, erhålls från en punkt FCS kalibrering mätning utförs med spektralt liknande färgämnen och samma optiska inställningar använder redan tillgängliga värden för den diffusionskoefficienten Dfärgämne:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq8.jpg">, (5).
där τd, färgämne är den uppmätta genomsnittliga diffusion tid av färgämne molekylerna, erhållits från passande modell för tredimensionellt diffusion till data, med hänsyn till konto övergångar av en bråkdel T alla N molekyler till en triplett stat med en tidskonstant ττ:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq9.jpg">.   (6)
Slutligen beräknas Diffusionskoefficienterna (D), molekylär ljusstyrkevärden (ε) och den relativa cross-korrelationen av sFCCS data (rel.cc.) enligt följande:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq10.jpg">, (7).
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq11.jpg">, (8).
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq12.jpg">, (9).
där Gcross(0) är amplituden av funktionen cross-korrelation och <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq14.jpg"> är amplituden av autokorrelation funktion i jag-th kanal.
Denna definition av den relativa cross-korrelationen, dvs med max istället för menar i ekvation 9, tar hänsyn till att det maximala antalet komplex av två protein arter vid olika koncentrationer begränsas av den arter som finns i ett lägre nummer.
Cross-korrelation nummer och ljusstyrka är baserad på en stund analys av fluorescensintensiteten för varje pixel i en bildstapel förvärvade med tiden till en fast position i urvalet, vanligtvis bestående av ~ 100-200 ramar, med två spektrala kanaler () g = grön kanal, r = röda kanalen). Från temporal medelvärdet <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img>jag<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg">jag och variansen <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq16.jpg"> </img>, de molekylära ljusstyrka εi och nummer njag beräknas i varje pixel och spektrala kanal (jag = g, r)18:
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq20.jpg">, (10).
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq21.jpg">. (11)
Det är viktigt att Observera att de givna ekvationerna gäller för det ideala fallet av en sann fotonräknande detektor. För analoga detektionssystem tillämpas följande ekvationer19,20:
<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq22.jpg">, (12).
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq23.jpg">.   (13)
Här, S är konverteringsfaktorn mellan upptäckta fotoner och inspelade digitala räkningarna, <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> är utslaget buller och offset hänvisar till detektorn intensitet offset. Generellt, dessa kvantiteter bör kalibreras, för någon Detektortyp, baserat på mätning detektor variansen som en funktion av intensitet för jämn belysning19, t.ex. en reflekterande metallyta eller torkade dye lösning. Förskjutning kan bestämmas genom mätning räkna räntan för ett prov utan excitation ljus. Genom att utföra en linjär regression av detektor-associerade variansen <img alt="Equation 25" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq25.jpg"> kontra intensitet (jag) tomt, S och <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> kan vara beslutsamt19:
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq27.jpg">.   (14)
Slutligen, cross-korrelation ljusstyrkan beräknas i varje pixel och definieras i allmänhet som21
<img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq28.jpg">, (15).
där <img alt="Equation 29" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq29.jpg"> är cross-variansen <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq30.jpg"> </img>.
För att filtrera långlivat fluktuationer, utförs alla ccN & B beräkningar efter en boxcar filtrering, självständigt för varje pixel22. Kort, ni, εjag (jag = g, r) och Bcc beräknas i glidande segment av t.ex., 8-15 bildrutor. Erhållits på detta sätt kan vara då medelvärdet för att få den slutliga pixeln nummer och ljusstyrka värden.
Stökiometri analys För att uppskatta stökiometri av proteinkomplex på cell-cell kontakter, kan molekylär ljusstyrkan analyseras separat för varje spektrala kanal för sFCCS eller ccN & B data. I sFCCS erhålls ett intensitetsvärde per mätning i varje kanal. I ccN & B, ett ljusstyrka histogram över alla pixlar motsvarar den cell-cell kontakten erhålls och värdet genomsnitt (eller median) kan användas som representativa ljusstyrka för mätning. Genom att utföra samma analys på en monomer referens, kan alla ljusstyrkevärden normaliseras för att direkt få den genomsnittliga Oligomera delstaten de upptäckta proteinkomplex. Vid denna punkt, är det viktigt att korrigera för förekomst av icke-fluorescerande FPs som kan leda till en underskattning av Oligomera staten. Detta görs vanligtvis genom att mäta ljusstyrka en homo-dimeriskt referens protein23,24 använder en färg sFCS eller nummer och ljusstyrka (N & B).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:596px;" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM growth medium</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-01548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-35500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P10-023100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TurboFect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:95px;">DSMZ</td>
			<td style="width:119px;">ACC 635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Alexa Fluor 488 NHS Ester</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Alderich</td>
			<td style="width:119px;">83689-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid DNA</td>
			<td style="width:95px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:95px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35-mm glass bottom dishes</td>
			<td style="width:95px;">CellVis</td>
			<td style="width:119px;">D35-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM780 confocal</td>
			<td style="width:95px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MATLAB software package</td>
			<td style="width:95px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">&#160;2015b&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Neubauer cell counting chamber</td>
			<td style="width:95px;">Marienfeld</td>
			<td align="right" style="width:119px;">640110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts

En mängd biologiska processer innebär cell-cell interaktioner, typiskt medierad av proteiner som samverkar i gränssnittet mellan angränsande celler. Av intresse klarar bara några analyser av specifikt sondera sådana interaktioner direkt i levande celler. Här presenterar vi ett test för att mäta bindningen av proteiner som uttrycks på ytbehandlar av närliggande celler, på cell-cell kontakter. Denna analys består av två steg: blandning av celler som uttrycker proteinerna av intresse smält till olika fluorescerande proteiner, följt av fluorescens fluktuation spektroskopi mätningar vid cell-cell kontakter med hjälp av en confocal laser skanning Mikroskop. Vi demonstrera genomförbarheten av denna analys i ett biologiskt relevanta sammanhang genom att mäta interaktioner av proteinet amyloid prekursor-liknande 1 (APLP1) över cell cell korsningar. Vi tillhandahåller detaljerade protokoll på dataförvärvet med fluorescens-baserade tekniker (Skanna fluorescens cross-korrelation spektroskopi, cross-korrelation nummer och ljusstyrka analys) och krävs instrument kalibreringar. Vidare diskuterar vi kritiska steg i dataanalys och hur att identifiera och korrigera externa, falska signal variationer, exempelvis på grund av fotoblekning eller cell rörelse.
I allmänhet presenterade analysen är tillämplig på alla homo- eller heterotypic protein-protein interaktioner på cell-cell kontakter, mellan celler av samma eller olika typer och kan genomföras på en kommersiell confocal laserscanning mikroskopet. Ett viktigt krav är stabiliteten i systemet som måste vara tillräckligt sond diffus dynamics av proteinerna av intresse under flera minuter.

Ett första test för protein-protein interaktioner analysen, d.v.s. blandning av celler som uttrycker spektralt distinkta fluorescerande proteiner följt av sFCCS/ccN & B mätningar (figur 1), bör utföras på proteiner som inte förväntas interagera i cell cell kontakt (dvs. en negativ kontroll). Därför HEK 293T celler som uttrycker myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-palm-mEYFP) eller -mCardinal blandades och sFCCS utfördes över ...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Det här protokollet beskriver ett fluorescens fluktuation spektroskopi-baserat tillvägagångssätt för att undersöka interaktioner mellan proteiner medla cell-cell interaktioner, dvs proteiner lokaliserade i cell korsningar, direkt i levande celler. Vi tillhandahåller detaljerade riktlinjer på instrumentkalibrering, datainsamling och analys, inklusive korrigeringar till möjlig artefakt källor.

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Denna metod kan bidra till att förstå viktiga frågor i cell-till-cell interaktionsfältet såsom vilka receptorer som förmedlar vidhäftning eller igenkänning i cell-till-cell kontakter och om specifika ligander utlösa deras interaktioner. Den största fördelen med denna teknik är att den tillåter en att undersöka sådana interaktioner direkt i levande celler utan behov av cellfixering eller störningar. Även om denna metod används för att undersöka interaktioner mellan odlade celler, det kan också tillämpas på andra system mono-membran vesiklar eller ens små organismer modell.Generellt individer nya till denna metod bör kontrollera att deras prov är stabil nog att tillåta förvärv under några minuter genom att noggrant inspektera cellrörelser och långsam signal variationer. Först utsäde lämpligt antal celler i minst fyra brunnar av en sex-brunn platta en dag före transfection. Odla cellerna vid 37 grader Celsius 5%koldioxid i DMEM medium kompletterat med 10%FBS och 1%L-glutamin.Att utföra ett grundläggande experiment transfect plasmider för proteinet av intresse smält till en grön eller en gul fluorescerande protein och ett rött fluorescerande protein i separata brunnar. Efter fyra timmar bort tillväxten medium och tvätta varje brunn försiktigt med en milliliter PBS kompletteras med magnesium och kalcium släppa PBS på brunnen kanten för att förhindra lossnar av cellerna under tvätt. Ta sedan bort PBS.Tillsätt cirka 50 mikroliter EDTA-lösning droppe klokt att varje brunn för att underlätta lossnar av cellerna. Efter inkubering vid 37 grader Celsius i två minuter, skaka långsamt sex-väl plattan i senare fall för att lossa cellerna. Därefter lägger du till 950 mikroliter tillväxtmedium till varje brunn och återanvänder cellerna genom att pipettera några gånger upp och ner och därigenom lossa alla celler från brunnsbotten.Se till att celler återanvänds på rätt sätt och lossnar från varandra genom att visuellt kontrollera om det saknas stora cellaggregat efter återfpension. Överför celllösningen av en brunn till motsvarande brunn. Blanda försiktigt genom att pipettera några gånger upp och ner.Sedan utsäde de blandade cellerna på en 35-millimeters glas botten skålen och kultur de seedade cellerna på 37 grader Celsius i 5% koldioxid för en dag. I lasern scanning confocal mikroskop programvara inrätta den optiska vägen. För att undvika spektralöverhör välj två separata spår att excitera och upptäcka mEGFP eller mEYFP och mCherry eller mCardinal sekventiellt och välj Switch spår varje Linje.För detektionen använd lämpliga filter för båda kanalerna. Placera skålen som innehåller blandcellerna på provhållaren. Efter att ha väntat 10 minuter för att säkerställa temperaturjämvikt och för att minska fokusdriften, fokusera på cellerna med hjälp av transmissionslampan i Locate-menyn.Sök efter ett par röda och gröna celler i kontakt med varandra. Därefter väljer du en genomsökningsbana vinkelrätt mot cell-till-cell-kontakt med knappen Beskär. Zooma för att uppnå en pixelstorlek på 50 till 200 nanometer och välj Linje i skanningsläge.Ange bildrutestorlek till 128 med en bildpunkter. Ställ in skanningshastighet till det högsta tillåtna värdet. Ställ sedan in cykler till 100, 000 till 500, 000.Efter detta väljer du lämpliga laserkrafter. Ställ in detektorerna på Photon Counting-läget. Tryck på Starta experiment för att starta förvärvet.Exportera rådatafilerna till en RGB TIF-bild i rådataformat. Denna fil kommer att innehålla en kymograph med den gröna och röda kanaldata i kanalen som benämns G och R av bilden, respektive. Därefter importerar du TIF-filen med lämplig analysprogramvara och fortsätter att utföra analysen.Justera linjerna genom att utföra ett segmentvis tidsmedelvärde med block på 500 till 1 000 rader. Bestäm membranpositionen i varje block. Flytta sedan alla block till samma laterala position.Summera alla linjer som är anpassade längs tidsaxeln och passa in den genomsnittliga intensitetsprofilen med hjälp av en Gaussisk funktion. Definiera de pixlar som motsvarar membranet som alla pixlar inom plus eller minus 2,5 sigma av membranet position, och summera intensiteten av dessa pixlar i varje linje erhålla en enda fluorescerande signalvärde för varje tidspunkt. Om fotoblekning observeras, applicera en blekningskorrigering genom att montera membranfluorescenstidsserien med en dubbel exponentiell funktion och tillämpa lämplig korrigeringsformula.Beräkna de automatiska och korskorrelationsfunktionerna enligt lämpliga ekvationer. För att förbättra analysens tillförlitlighet och undvika att artefakter utför beräkningarna för 10 till 20 lika stora segment av den totala mätningen. Inspektera tidsserien fluorescens och korrelationsfunktionerna i varje segment och ta bort tydligt förvrängda segment.Slutligen genomsnitt alla icke-snedvridna segment. Medan du analyserar dina data, noggrant inspektera intensiteten tidsserier och korrelationsfunktioner från varje segment för att undvika snedvridningar, till exempel, på grund av intracellulära vesiklar i membranet periferi. En intensitetsbild av HEK 293T-celler som uttrycker myristolyated-palmitoylated-mEYFP eller mCardinal visas här.En relativ korskorrelation nära noll observerades medan autocorrelation funktionerna visar karakteristiska förfall gånger 10 till 20 millisekunder för diffusion av myristolyated-palmitoylated-mEYFP och mCardinal i plasma membranet. Korskorrelation funktionerna i sFCCS mätningar av HEK 293T celler uttrycker membran-förankrade heterodimer myristolyated-palmitoylated-mCardinal-mEYFP hade positiva amplituder och visade liknande förfall gånger som autocorrelation funktion. sFCCS-mätningar på cell-till-cell-kontakter mellan APLP1-mEYFP och APLP1-mCardinal-expressing celler resulterade i en positiv relativ korskorrelation av 0,45.De sFCCS korrelationsfunktioner som erhållits från mätningar över APLP1 kluster vid cell-cell kontakter visade starkt minskad dynamik som framgår av stora förfall gånger i svängningarna vid stora eftersläpning gånger. Vid zinkjontillredning ökade den relativa korskorrelationen till ett genomsnittsvärde på 0,8. Ytterligare ökade den molekylära ljusstyrkan betydligt från små oligomerer till större multimers som består av 10 till 50 monomerer på varje cell.Transienta instabiliteter kan resultera i att en korskorrelationsfunktion har negativa värden eller en hög falsk positiv korskorrelation. Motsvarande korrelationsfunktioner avviker typiskt starkt från de som förs av majoriteten av segment. Som ett kompletterande tillvägagångssätt för sFCCS korskorrelation nummer och ljusstyrka kan användas för att upptäcka protein-protein interaktioner.Samtidigt försöker detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att blandning av transfekterade celler är ett kritiskt steg. Blanda försiktigt cellerna och optimera effektivitetsvinsterna för att öka risken för att hitta röda och gröna celler i kontakt. Efter dess utveckling denna teknik har använts av forskare inom immunologi för att utforska interaktioner av signalmolekyler i immunologiska synapser.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

En fluorescensbaserad analys av Phospholipid Scramblase Aktivitet

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescensanisotropi som ett verktyg för att studera protein-proteininteraktioner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylerade Cell-penetrerande peptider att studera intracellulära Protein-protein interaktioner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Använda i Vitro fluorescens resonans energiöverföring att studera dynamiken i proteinkomplex på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Tillämpning av Biolayer interferometri (BLI) för att studera protein-proteininteraktioner vid transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Utvärdering av protein-proteininteraktioner med hjälp av en on-membran rötnings teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Användning av mikroskala termofores för att mäta protein-lipidinteraktioner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

En Planarian Motility Assay att mäta biomodulerande egenskaper naturliga produkter

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Spotvariation Fluorescenskorrelationsspektroskopi för analys av molekylär diffusion vid plasmamembranet i levande celler

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...