Name: a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts
Uploaded: 2018-12-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

Bu eser kısmen Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından desteklenen 254850309 verin. Yazarlar Madlen Luckner el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz.

1. örnek hazırlama: Hücre-hücre karıştırma tahlil
Not: Aşağıdaki protokol yapışık hücreleri için karıştırma yordamı açıklar. Süspansiyon kültürlü hücreler için değiştirilebilir.
<ol><li>6-şey plaka, Örneğin, 800.000 HEK 293T hücreleri (bir Neubauer odası sayma sayılır), bir gün önce transfection sayfasında bulunan bir hücreler uygun bir rakam tohum. Numarayı tohum ve transfection arasındaki süreye bağlı olarak değiştirilebilir ve diğer...

Burada açıklanan deneysel işlemin protein-protein incelenmesi trans etkileşimleri floresans dalgalanma Spektroskopi teknikleri, yani sFCCS ve ccN & b hücre-hücre kişiler sağlar Bu yöntemler floresans dalgalanmaları iki komşu hücrelerin bir ilgili kişi her birini veya diğer füzyon protein ifade faiz protein(s) için erimiş iki hayalice ayrılmış FPs tarafından yayılan bir istatistiksel analize dahil. Trans kompleksleri varlığı içinde komşu PMs proteinlerin Co difüzyon derecesini...

Birçok biyolojik süreçlerin hücre-hücre etkileşimleri, Örneğin, hücre-hücre adezyon1,2,3, hücre-hücre füzyon4 ve hücresel tanıma5sitelerinde oluşur. Bu tür olayların çok hücreli organizmalar ve hücre-hücre iletişim, Örneğin, bağışıklık yanıtı sırasında için geliştirme sırasında özellikle önemlidir. Bu işlemler genellikle yüzeyde, Yani, komşu hücreler plazma zarı (PM), lokalize ve tam olarak düzenlenmiş uzay ve zamanın çoğu belirli etkileşimler hücre-hücre iletişim tabi proteinler tarafından aracılık. Birçok durumda, bu etkileşimler doğrudan homo - ya da heterotypic protein-protein trans etkileşimleri, ama da iyonları veya hücre dışı bağlayıcı1hareket ligandlar içerebilir. Temel öneme sahip olsa da, bu belirli protein-protein etkileşimler yaşayan hücrelerin doğal ortamda doğrudan sondalama deneyleri eksikliği vardır. Pek çok yöntem de hücre bozulması (Örneğin, biyokimyasal deneyleri co-immunoprecipitation6gibi), gerektiren fiksasyon (Örneğin, bazı süper çözümleme optik mikroskobu teknikleri ve hücre-hücre elektron mikroskobu rehber7), ya da non-spesifik, Örneğin, toplama / yapışma deneyi8,9. Bu sorunu aşmak için floresans teknikleri floresans rezonans enerji transferi (FRET)10 veya floresan uluslara11temel uygulanmıştır. Ancak, fluorophores arasında yeterince kısa mesafelerde elde etmek için potansiyel olarak trans etkileşimleri ile müdahale belgili tanımlık protein10, hücre dışı tarafındaki floresan etiketleri bu yöntemler gerektirir.
Burada, hücre-hücre kişiler bir alternatif floresans tabanlı tahlil protein-protein etkileşimleri için mevcut. Bu yaklaşım floresans çapraz korelasyon yaklaşımlar (tarama floresans çapraz korelasyon spektroskopisi (sFCCS), çapraz korelasyon numarası ve parlaklık (ccN ve B)) ve protein bir füzyon yapı ifade hücrelerinin karıştırma birleştirir faiz, Örneğin, bir yapışma reseptör. İncelenen reseptörleri iki etkileşen hücrelerde iki hayalice ayrılmış floresan proteinlerin (FPs) ile hücre içi etiketlenir ( Şekil 1A' ya bakınız) yan.
İstihdam yöntemleri, floresans mikroskobu tarama confocal lazer odak hacmi ile floresan füzyon proteinlerin diffusive hareket tarafından indüklenen dalgalanmaları istatistiksel analizi temel alır. Daha ayrıntılı olarak, proteinler, hücre-hücre kişiler her iki komşu PMs ilgi ortak difüzyon tahlil sondalar. Proteinler trans etkileşimleri tabi eğer bu trans komplekslerin spektral her iki kanal yayan, her iki yayıcılar ilişkili floresans dalgalanmalar neden floresan proteinler taşıyacak. Öte yandan, hiçbir bağlama ortaya çıkarsa, PMs bakan numara dalgalanmaları proteinlerin bağımsız, hiçbir ilişkili dalgalanmaları neden olacaktır. Satın iki yolla yapılabilir: 1) sFCCS bir çizgi şeklinde tarama hücre-hücre iletişim karşıdan karşıya dayanmaktadır ve etkili iletişim bölgesinde bulunan bir noktada etkileşimleri sondalar. Floresans dalgalanmaları zamansal analizi ile sFCCS dynamics bilgi, Yani, aynı zamanda protein kompleksleri difüzyon katsayıları sağlar; 2) ccN & B hücre-hücre iletişim bölgeler alınan görüntüleri bir dizi pixel-wise bir analizine dayalı. Soruşturma için yeteneği ve harita etkileşimler tüm boyunca bölgede (bir odak düzlemi) başvurun, ama bilgi dinamikleri üzerinde sağlamaz. Her iki yöntem ortalama floresans sinyal zaman biriminde tek akışkanın protein kompleksleri tarafından yayılan ve böylece, protein kompleksleri stoichiometry tahminleri sağlamak Yani, moleküler parlaklık analizi ile kombine edilebilir hücre-hücre kişiler.
Bu makalede sunulan tahlil üzerinde bir ticari confocal lazer mikroskobu tarama gerçekleştirmek numune hazırlama, aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi için detaylı iletişim kuralları sağlar. Deneyler foton sayma veya analog dedektörleri ve bir amacı ile yüksek sayısal diyafram ile donatılmış herhangi bir enstrüman üzerinde gerçekleştirilebilir. Biz daha fazla Protokolü'nün önemli adımlar ele ve neden artefactual sinyal dalgalanmaları, Örneğin, Dedektör gürültü, photobleaching veya hücre hareketi birkaç işlemleri için düzeltme düzenleri sağlar. Aslında yapışık hücreleri arasındaki etkileşimler soruşturma için geliştirilmiş, tahlil için süspansiyon hücreler değiştirilebilir veya modeli membran sistemleri, Örneğin, dev unilamellar veziküller (GUVs) veya dev plazma membran veziküller (GPMVs), izin adapte miktar etkileşimleri farklı lipid ortamlarda veya bir organize sitoiskeleti12,13yokluğunda.
Floresans çapraz korelasyon spektroskopisi tarama floresans spektroskopisi çapraz korelasyon14 değiştirilmiş bir versiyonu ve yavaş diffusive dynamics lipid membranlar15soruşturma için özel olarak tasarlanmıştır. Bir satır tarama satın alma ilgi floresan protein içeren PM dikey dayanmaktadır. İki farklı etiketli protein türlerin etkileşimleri soruşturma için satın alma iki spektral kanalları iki lazer satır ve iki algılama windows için hayalice ayrı fluorophores kullanarak gerçekleştirilir. Başbakanın proteinler yavaş difüzyon dinamikleri nedeniyle (D≤ ~ 1 µm2/s), çapraz konuşma ücretsiz ölçüm15hizalamak için satır uyarma düzeninden alternatif tarafından gerçekleştirilebilir. Analizi ile başlar: 1) bir hizalama algoritması yanal hücre hareketi için düzeltme dayalı block-wise ~ 1000 satır, 2) maksimum floresans sinyalYani, Başbakanın pozisyonda, her blok pozisyonla belirlenmesi ortalama ve 3) değişen üzerinde bir ortak kökenli12,15, ayrı ayrı her kanaldaki tüm blokları. Sonra bir otomatik seçim için PM karşılık gelen piksel, tüm hizalanmış çizgileri (Yani, Merkezi ± 2.5σ) toplamı Gauss uygun bir merkez bölgesi seçerek gerçekleştirilir. Entegrasyon-in her satırdaki sinyal verir her kanaldaki membran floresans saat serisi F(t) (g = yeşil kanal, r = kırmızı channel). Piksel boyutu kadar küçük Örneğin, olmak zorunda Not < 200 nm nokta şeklinde yeniden oluşturmak için işlev yaymak ve PM konumuna karşılık gelen merkezini bulmak. Önemli photobleaching huzurunda floresans saat serisi her kanaldaki olabilir çift Üstel fonksiyon ile örnek alınarak ve aşağıdaki formülü ile düzeltilmiş:16
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq2.jpg">.    (1)
Bu formül etkili genlikleri ve korelasyon analizi F(t)cdüzeltilmeyen F(t)elde edilen parametre tahminleri karşılaştırıldığında, elde edilen difüzyon kez düzeltir unutmamak gerekir. O zaman, otomatik ve çapraz korelasyon fonksiyonları (ACFs / CCFs) Floresan sinyallerini hesaplanır:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq3v2.jpg">, (2).
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq4v2.jpg">, (3).
Burada δFben benF(t) - = <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img> benF(t)<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg"> </img> ve ben g, r=.
Bir iki boyutlu difüzyon model sonra tüm korelasyon fonksiyonları (CFs) için düzenlenmiştir:
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq7.jpg">.   (4)
Burada, N gözlem birim ve τd floresan proteinlerin difüzyon zaman her kanal için gösterir. Bu model açıklanan Deneysel ortamda proteinlerin difüzyon PM içinde x-z düzlemde oluşur floresans korelasyon yaygın olarak kullanılan yapılandırma aksine spektroskopisi (FCS) sondalama membranlar üzerinde deneyler dikkate alır confocal cilt17difüzyon XY düzlemde. Bel w0 ve yapısı faktörü S, uzama açıklayan wz z, S odak hacmindeki = wz/w0, hayalice benzer boyalar ve aynı optik ayarları ile gerçekleştirilen bir nokta FCS kalibrasyon ölçüm elde edilir zaten kullanılabilir değerler için difüzyon katsayısı kullanarak Dboya:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq8.jpg">, (5).
τd, boya boya moleküllerin üç boyutlu difüzyon veri için bir model uygun elde ölçülen ortalama difüzyon zaman olduğu yerde hesap geçişleri için bir kısmı T tüm N moleküllerin, dikkate alarak bir bir süre sabit durumuyla üçlüsü ττ:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq9.jpg">.   (6)
Son olarak, difüzyon katsayısını (D), moleküler parlaklık değerlerini (ε) ve göreceli çapraz korelasyon sFCCS veri (rel.cc.) aşağıdaki gibi hesaplanır:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq10.jpg">, (7).
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq11.jpg">, (8).
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq12.jpg">, (9).
çapraz korelasyon işlevi genliği nerede Gçapraz(0) ve <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq14.jpg"> ben-th kanal otokorelasyon işlevinde genliği olduğunu.
Göreli çapraz korelasyon, yani bu tanımı denklem 9, demek yerine max kullanma alır kompleksleri farklı konsantrasyonlarda mevcut iki protein türlerin sayısı sınırlıdır dikkate sayı ne kadar küçükse mevcut bir tür.
Çapraz korelasyon numarası ve parlaklık esas floresan yoğunluğu zamanla örnek sabit bir pozisyonda alınan görüntü yığını her piksel için bir an Analizi genellikle ~ 100-200 itibaren oluşan çerçeve, spektral iki kanal () g = yeşil kanal, r = kırmızı channel). Zamansal anlamına gelen <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> </img>ben<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg">ben ve varyans <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq16.jpg"> </img>, moleküler parlaklık εi ve numara nben her piksel ve spektral kanal hesaplanır (ben g, r=)18:
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq20.jpg">, (10).
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq21.jpg">. (11)
Verilen denklemler gerçek bir foton sayma dedektörü ideal durumda için geçerli olduğunu unutmamak gerekir. Analog tespit sistemleri, aşağıdaki denklemler19,20uygulanır:
<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq22.jpg">, (12).
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq23.jpg">.   (13)
S algılanan fotonlar ve kaydedilen dijital sayıları arasında dönüştürme faktörünü işte <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> okuma gürültü olduğunu ve ofset dedektörü yoğunluğu Ofset için başvurur. Genellikle, bu miktarlar, yoğunluğu sabit aydınlatma19, Örneğin, yansıtıcı metal bir yüzeye veya kuru boya çözüm için bir fonksiyonu olarak Dedektör farkı ölçme üzerinde dayalı herhangi bir dedektör türünün ayarlanması. Ofset için uyarma ışık olmadan bir örnek sayısı oranı ölçerek belirlenebilir. Bir doğrusal regresyon dedektörü ilişkili varyans yaparak <img alt="Equation 25" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq25.jpg"> karşı şiddeti (ben) Arsa, S ve <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> belirlenen19olabilir:
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq27.jpg">.   (14)
Son olarak, çapraz korelasyon parlaklık kümedeki her pikseli rasgele hesaplanır ve21 olarak genel olarak tanımlanır
<img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq28.jpg">, (15).
nerede <img alt="Equation 29" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq29.jpg"> çapraz değişkenidir <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq30.jpg"> </img>.
Uzun ömürlü dalgalanmaları filtre uygulamak için tüm ccN & B hesaplamalar filtreleme, bağımsız olarak her piksel22için bir yük vagonu takip gerçekleştirilir. Kısaca, ni, εben (ben g, r=) ve Bcc segmentlerinin Örneğin, 8-15 kare sürgülü hesaplanır. Böylece elde edilen değerler sonra son piksel sayısı ve parlaklık değerlerini elde etmek için Ortalama.
Stoichiometry Analizi Protein kompleksleri stoichiometry hücre-hücre kişiler tahmin etmek için moleküler parlaklık ayrı olarak sFCCS veya ccN & B veri için spektral Her kanaldaki analiz edilebilir. SFCCS içinde her ölçüm için her kanaldaki bir parlaklık değeri elde edilir. CcN & B, hücre-hücre iletişim için karşılık gelen tüm piksellerin parlaklık çubuk grafik elde edilir ve ortalama (veya medyan) değeri temsilcisi Parlaklık ölçüm için kullanılabilir. Aynı analiz üzerinde monomeric bir başvuru yaparak, tüm parlaklık değerlerini doğrudan saptanan protein kompleksleri ortalama oligomeric durumunu elde etmek için normalleştirilmiş. Bu noktada, oligomeric devlet bir küçümseme içinde sonuçlanabilir floresan FPs varlığı için düzeltmek önemlidir. Bu genellikle tek renk sFCS veya numarasını kullanarak bir homo dimerik referans protein23,24 parlaklık ve parlaklık (Y & B) ölçme tarafından gerçekleştirilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:596px;" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM growth medium</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-01548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS w: Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-35500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:95px;">PAN-Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P10-023100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TurboFect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:95px;">DSMZ</td>
			<td style="width:119px;">ACC 635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Alexa Fluor 488 NHS Ester</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Alderich</td>
			<td style="width:119px;">83689-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid DNA</td>
			<td style="width:95px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:95px;">Starlab</td>
			<td style="width:119px;">CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35-mm glass bottom dishes</td>
			<td style="width:95px;">CellVis</td>
			<td style="width:119px;">D35-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM780 confocal</td>
			<td style="width:95px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MATLAB software package</td>
			<td style="width:95px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">&#160;2015b&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Neubauer cell counting chamber</td>
			<td style="width:95px;">Marienfeld</td>
			<td align="right" style="width:119px;">640110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence fluctuation spectroscopy assay of protein-protein interactions at cell-cell contacts

Biyolojik süreçlerin çeşitli genellikle komşu hücreler arasında arayüz etkileşim proteinler tarafından aracılı hücre-hücre arasındaki etkileşimleri içerir. İlgi, sadece birkaç deneyleri özellikle bu tür etkileşimlerde doğrudan canlı hücreler sondalama yeteneğine sahiptirler. Burada, proteinlerin komşu hücreleri, hücre-hücre kişiler yüzeyleri, bağlama ölçmek için bir tahlil mevcut. Bu tahlil iki adımdan oluşur: hücre proteinleri farklı floresan proteinler için erimiş ilgi ifade karıştırma, floresans mikroskobu tarama confocal lazer kullanarak hücre-hücre kişiler dalgalanma spektroskopisi ölçülerde ardından. Biz bu testin bir biyolojik ilgili bağlamda fizibilite hücre-hücre kavşak amiloid habercisi gibi protein 1 (APLP1) etkileşimleri ölçerek göstermek. Detaylı iletişim kuralları (floresan çapraz korelasyon spektroskopisi, çapraz korelasyon numarası ve parlaklık analiz tarama) Floresan tabanlı teknikleri ve gerekli araç Kalibrasyonlar kullanarak veri toplama sağlar. Ayrıca, veri analizi ve nasıl tanımlamak ve photobleaching veya hücre hareketi nedeniyle gibi dış, sahte sinyal çeşitleri düzeltmek kritik adımları tartışmak.
Genel olarak, sunulan tahlil herhangi bir homo veya hücreler aynı veya farklı türleri arasında hücre-hücre kişiler, heterotypic protein-protein etkileşim için geçerlidir ve üzerinde bir ticari confocal lazer mikroskobu tarama uygulanabilir. Birkaç dakika faiz proteinlerin diffusive dynamics soruşturma yeterli olması gerekir sisteminin istikrarı önemli bir gereksinimdir.

İlk test protein-protein etkileşim tahlil için Yani, hücre sFCCS/ccN & B ölçümleri (Şekil 1) tarafından takip hayalice farklı floresan proteinler ifade karıştırma gerçekleştirilmesi beklenen değil protein üzerinde (Yani, bir negatif kontrol) hücre-hücre iletişim etkileşim. Bu nedenle, myristoylated-palmitoylated-mEYFP (en düşük myr-palm-mEYFP) veya - mCardinal ifade HEK 293T hücreleri karıştırıldı ve sFCCS hücr...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts at JoVE.com

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Bu yöntem, hücreden hücreye etkileşim alanında, hücreden hücreye temaslarda hangi reseptörlerin yapışma veya tanıma ya da tanıma aracı olduğu ve belirli ligandların etkileşimlerini tetikleyip tetiklemediği gibi anahtar soruların anlaşılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücre fiksasyonu veya bozulmaya gerek kalmadan canlı hücrelerde bu tür etkileşimleri doğrudan araştırmasına olanak sağlamasıdır. Bu yöntem kültürlü hücreler arasındaki etkileşimleri araştırmak için kullanılmasına rağmen, diğer sistemlere mono-membran veziküller ve hatta küçük model organizmalar uygulanabilir.Genellikle bu yönteme yeni yeni bireyler, hücre hareketini ve yavaş sinyal varyasyonlarını dikkatle inceleyerek numunelerinin birkaç dakika içinde edinimi sağlayacak kadar kararlı olup olmadığını kontrol etmelidir. İlk olarak, transfection bir gün önce altı kuyu plaka en az dört kuyularda hücrelerin uygun sayıda tohum. Kültür 37 santigrat santigrat% 5 karbondioksit DMEM orta% 10 FBS ve% 1 L-glutamin ile desteklenmektedir.Yeşil veya sarı floresan protein ve ayrı kuyularda kırmızı floresan protein erimiş ilgi proteiniçin temel bir deney transfect plazmidler gerçekleştirmek için. Dört saat sonra büyüme ortamını kaldırın ve yıkama sırasında hücrelerin ayrılmasını önlemek için iyi kenarında magnezyum ve kalsiyum bırakarak PBS ile desteklenen pbs bir mililitre ile her iyi iyi yıkayın. Sonra PBS kaldırın.Hücrelerin ayrılmasını kolaylaştırmak için her kuyuya yaklaşık 50 mikrolitre EDTA çözeltisi ekleyin. İki dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yattıktan sonra, hücreleri ayırmak için yavaşça altı kuyulu plakayı yavaşça sallayın. Daha sonra, her kuyuya 950 mikrolitre büyüme ortamı ekleyin ve hücreleri birkaç kez yukarı ve aşağı boruhaline vererek hücreleri yeniden askıya alın ve böylece tüm hücreleri alttan ayırın.Yeniden askıya alındıktan sonra büyük hücre agregalarının yokluğunu görsel olarak kontrol ederek hücrelerin düzgün bir şekilde yeniden askıya alınmasını ve birbirlerinden ayrıldığından emin olun. Bir kuyunun hücre çözeltisini ilgili kuyuya aktarın. Birkaç kez yukarı ve aşağı boru ile yavaşça karıştırın.Sonra 35 milimetrelik cam alt çanak ve kültür bir gün için% 5 karbondioksit 37 santigrat derece tohumlu hücreleri karışık hücreleri tohum. Lazer tarama confocal mikroskop yazılımı optik yolu kurmak. Spektral crosstalk önlemek için heyecanlandırmak ve mEGFP veya mEYFP ve mCherry veya mCardinal sırayla tespit etmek ve her Satırı parça anahtarı seçin iki ayrı parça seçin.Algılama için her iki kanal için de uygun filtreler kullanın. Karışık hücreleri içeren kabı numune tutucunun üzerine yerleştirin. Sıcaklık dengesini sağlamak ve odak kaymasıazaltmak için 10 dakika bekledikten sonra, Bul menüsündeki iletim ışığını kullanarak hücrelere odaklanın.Birbiriyle temas halinde olan bir çift kırmızı ve yeşil hücre arayın. Ardından, Kırpma düğmesini kullanarak hücreden hücreye birbağlantıya dik bir tarama yolu seçin. 50 ila 200 nanometre piksel boyutuna ulaşmak için yakınlaştırın ve Scan modunda Çizgi'yi seçin.Kare boyutunu bir piksele 128 olarak ayarlayın. Scan hızını izin verilen maksimum değere ayarlayın. Sonra döngüleri 100,000 ile 500, 000 olarak ayarlayın.Bunu takiben, uygun lazer güçlerini seçin. Dedektörleri Foton Sayma moduna ayarlayın. Satın almayı başlatmak için Başlat Deneyi'ne basın.Ham veri dosyalarını ham veri biçiminde bir RGB TIF görüntüsüne dışa aktarın. Bu dosya, görüntünün G ve R olarak adlandırdığı kanaldaki yeşil ve kırmızı kanal verilerinin bulunduğu bir kymograph içerir. Ardından, Uygun analiz yazılımı ile TIF dosyasını içe aktarın ve çözümlemesi gerçekleştirmeye devam edin.500 ile 1000 satırlık bloklarla segment açısından bir zaman ortalaması gerçekleştirerek satırları hizala. Her bloktaki membran pozisyonunu belirleyin. Sonra tüm blokları aynı yanal konuma kaydırın.Zaman ekseni boyunca hizalanmış tüm çizgileri özetleyin ve Gaussian işlevini kullanarak ortalama yoğunluk profiline sığdırın. Membrana karşılık gelen pikselleri, membran pozisyonunun artı veya eksi 2,5 sigma içindeki tüm pikseller olarak tanımlayın ve her bir zaman noktası için tek bir floresan sinyal değeri elde ederek her satırdaki bu piksellerin yoğunluğunu özetleyin. Fotoğraf beyazlatma gözlenirse, membran floresan zaman serisini çift üstel fonksiyona takarak ve uygun düzeltme formülü uygulayarak bir beyazlatma düzeltmesi uygulayın.Otomatik ve çapraz korelasyon fonksiyonlarını uygun denklemlere göre hesaplayın. Analizin güvenilirliğini artırmak ve yapıtlardan kaçınmak için toplam ölçümün 10 ila 20 eşit segmenti için hesaplamalar yapın. Her segmentteki floresan zaman serilerini ve korelasyon işlevlerini inceleyin ve açıkça bozulmuş segmentleri kaldırın.Son olarak, tüm bozuk olmayan kesimlerin ortalaması. Verilerinizi analiz ederken, örneğin membran çevresinde hücre içi veziküller nedeniyle bozulmaları önlemek için her segmentteki yoğunluk zaman serilerini ve korelasyon fonksiyonlarını dikkatle inceleyin. Myristolyated-palmitoylated-mEYFP veya mCardinal ifade HEK 293T hücrelerinin bir yoğunluk görüntüsü burada gösterilmiştir.Otokorelasyon fonksiyonları plazma zarında miristolyated-palmitoylated-mEYFP ve mKardinal difüzyonu için 10 ila 20 milisaniye karakteristik bozunma süreleri gösterirken sıfıra yakın göreceli bir çapraz korelasyon gözlendi. Membran bağlantılı heterodimer myristolyated-palmitoylated-mCardinal-mEYFP'yi ifade eden HEK 293T hücrelerinin sFCCS ölçümlerinin çapraz korelasyon fonksiyonları pozitif genliklere sahipti ve otokorelasyon fonksiyonu na benzer bozunma sürelerini gösterdi. APLP1-mEYFP ve APLP1-mKardinal ifade eden hücreler arasındaki hücreden hücreye temaslarda sFCCS ölçümleri 0,45 pozitif göreceli çapraz korelasyon ile sonuçlandı.Hücre-hücre temaslarında APLP1 kümeleri arasındaki ölçümlerden elde edilen sFCCS korelasyon fonksiyonları, büyük gecikme sürelerinde salınımlarda büyük bozunma sürelerinden belirgin olarak güçlü bir şekilde azaltılmış dinamikler göstermiştir. Çinko iyon ilavesi üzerine, bağıl çapraz korelasyon ortalama değeri 0.8'e yükselmiştir. Moleküler parlaklık küçük oligomerlerden her hücrede 10 ila 50 monomerden oluşan daha büyük multimerlere kadar önemli ölçüde artmıştır.Geçici kararsızlıklar, negatif değerlere veya yüksek yanlış pozitif çapraz korelasyona sahip çapraz korelasyon işlevine neden olabilir. Karşılık gelen korelasyon işlevleri genellikle segmentlerin çoğunluğundan güçlü bir şekilde saptamak. SFCCS çapraz korelasyon numarası ve parlaklık için tamamlayıcı bir yaklaşım olarak protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılabilir.Bu prosedürü denerken transfected hücrelerin karıştırılması kritik bir adım olduğunu hatırlamak önemlidir. Hücreleri yavaşça karıştırın ve temas halinde ki kırmızı ve yeşil hücreleri bulma şansını artırmak için transfeksiyon verimliliğini optimize edin. Gelişiminden sonra bu teknik immünoloji alanında araştırmacılar tarafından immünolojik sinapslarda sinyal moleküllerinin etkileşimlerini araştırmak için kullanılmıştır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Doğal Ürünlerin Biyomodülasyon Özelliklerini Ölçmek için Bir Planarian Motilite Tsay

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Canlı Hücrelerin Plazma Membranında Moleküler Difüzyonun Analizi için Spot Varyasyon Floresan Korelasyon Spektroskopisi

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...