Name: a micro-ct-based method for characterizing lesions and locating electrodes in small animal brains
Uploaded: 2018-11-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains at JoVE.com

Die Autoren danken Greg Lin und Arthur McClelland für ihr Fachwissen mit der Mikro-CT-Maschine, David Richmond und Hunter Elliott auf das Bild und Daten-Analyse-Kern (sein) an der Harvard Medical School für ihre Bildverarbeitungs-Beratung und William Liberti bei Boston Universität für die Bereitstellung von gnädig einer Zebrafinken-Gehirns. Diese Arbeit wurde teilweise in der Mitte für Nanoscale Systems (ZNS), ein Mitglied von der nationalen Nanotechnologie abgestimmte Infrastruktur Netzwerk (NNCI), durchgeführt, die von der National Science Foundation unter NSF Award Nr. 1541959 unterstützt wird. CNS ist ein Teil von der Harvard University. Diese Arbeit wurde von Richard und Susan Smith Family Foundation und IARPA (Vertrag #D16PC00002) unterstützt. S.B.E.W. wurde unterstützt durch Stipendien aus dem Human Frontier Science Program (HFSP; LT000514/2014) und der European Molecular Biology Organization (EMBO; ALTF1561-2013). G.g. wurde von der National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship Programm (GRFP) unterstützt.

Alle Pflege und experimentelle Manipulation von Tieren wurden überprüft und durch die Harvard institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt. Die hier beschriebenen Perfusion ist spezifisch für Ratten, aber das Verfahren ist anwendbar auf alle Tiere mit kleineren oder ähnlich große Gehirne.
(1) perfusion
<ol><li>Bereiten Sie 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Für eine Ratte (Alter: 0,5 – 1,5 Jahre alt, Gewicht: 250-600 g), 800-1.000 mL sollte ausreichend sein. Ve...

<ol>
	<li>Scoville, W., Milner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+recent+memory+after+bilateral+hippocampal+lesions.">Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions.</a> Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).</li><li>Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+integrated+silicon+probes+for+high-density+recording+of+neural+activity.">Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity.</a> Nature. 551, 232-236 (2017).</li><li>Mas&#237;s, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=micro-CT-based+method+for+quantitative+brain+lesion+characterization+and+electrode+localization.">micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization.</a> Scientific Reports. 8, 5184 (2018).</li><li>Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 65, 3564 (2012).</li><li>Helander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+studies+of+formaldehyde+binding+in+tissue.">Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. , (1994).</li><li>Palj&#228;rvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+aldehyde+fixation+for+electron+microscopy:+stabilization+of+rat+brain+tissue+to+withstand+osmotic+stress.">The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress.</a> Histochemical Journal. , (1979).</li><li>Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+of+glutaraldehyde+with+amino+and+thiol+compounds.">Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds.</a> Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).</li><li>Bahr, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmium+tetroxide+and+ruthenium+tetroxide+and+their+reactions+with+biologically+important+substances:+electron+stains+III.">Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III.</a> Experimental Cell Research. , (1954).</li><li>Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reactions+of+osmium+tetroxide+with+lipids+and+other+compounds.">The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).</li><li>Riemersma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmium+tetroxide+fixation+of+lipids+for+electron+microscopy+a+possible+reaction+mechanism.">Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).</li><li>Mikula, S., Binding, J., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+and+embedding+the+whole+mouse+brain+for+electron+microscopy.">Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy.</a> Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).</li><li>Mikula, S., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+whole-brain+staining+for+electron+microscopic+circuit+reconstruction.">High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction.</a> Nature Methods. 12, 541-546 (2015).</li><li>Crespigny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+micro-CT+imaging+of+the+postmortem+brain.">3D micro-CT imaging of the postmortem brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).</li><li>Anderson, R., Maga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+rapid+imaging+of+adult+mouse+brains+with+MicroCT+using+Iodine-Based+contrast.">A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast.</a> PLoS One. 10, 0142974 (2015).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+cavernous+malformations+arise+from+endothelial+gain+of+MEKK3-KLF2/4+signalling.">Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling.</a> Nature. 532, 122-126 (2016).</li><li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-CT+imaging+reveals+mekk3+heterozygosity+prevents+cerebral+cavernous+malformations+in+Ccm2-Deficient+mice.">Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice.</a> PloS One. 11, 0160833 (2016).</li><li>Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+Micro-CT+imaging+of+cerebral+cavernous+malformations+in+mouse+model.">Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+microscopy+of+the+C57BL+mouse+brain.">Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain.</a> Neuroimage. 11, 601-611 (2000).</li><li>Weninger, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+episcopic+microscopy:+a+rapid+technique+for+high+detailed+3D+analysis+of+gene+activity+in+the+context+of+tissue+architecture+and+morphology.">High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology.</a> Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).</li><li>Schneider, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+magnetic+paragraph+sign+resonance+imaging+of+mouse+embryonic+paragraph+sign+anatomy+using+a+fast+gradient-echo+sequence.">high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence.</a> MAGMA. 16, 43-51 (2003).</li><li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+projection+tomography.">Optical projection tomography.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).</li><li>Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Three-Dimensional+microelectrode+brain+mapping+using+stereo+microfocal+x-ray+imaging.">High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging.</a> Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).</li><li>Borg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+metal+electrodes+in+the+intact+rat+brain+using+registration+of+3D+microcomputed+tomography+images+to+a+magnetic+resonance+histology+atlas.">Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas.</a> eNeuro. 2, (2015).</li><li>Fu, T. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+long-term+chronic+brain+mapping+at+the+single-neuron+level.">Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level.</a> Nature Methods. 13, 875-882 (2016).</li></ol>

Folgende sind wichtige Schritte für das Protokoll: Erstens die Verwendung einer Kombination aus PFA und GA Durchspülen des Tieres und anschließend nach dem Beheben des Gehirns war ausschlaggebend für die konsequente voll Osmium Durchdringung des Gewebes zu erreichen. Obwohl wir dies nicht explizit testen, ist eine plausible Erklärung, dass PFA Fixierung reversible15, GA-Fixierung ist nicht reversibel16,17. Da eine zweiwöchige Inkubat...

Neurowissenschaftler haben auf Läsionen für eine lange Zeit verlassen, um die Beziehung zwischen Funktion und Position im Gehirn zu verstehen. Zum Beispiel wurden unser Verständnis des Hippocampus als unerlässlich für lernen und Gedächtnis und des präfrontalen Kortex als Schlüssel zur Impulskontrolle beide Produkte von glücklichen Zufälle Läsionen im Menschen1,2. Die Verwendung von Tiermodellen, jedoch konnten Neurowissenschaftler um die Macht der Läsionen durch hinauszugehen, Serendipity, und hat die Funktion der unzähligen Hirnareale durch systematische Untersuchungen der Struktur-Funktions-Beziehungen durch aufgeklärt Läsionen3,4.
Um richtig Funktion einer Struktur zuzuordnen, jedoch erfordern Läsion Studien präzise Quantifizierung Verfahren, die eine Fläche, die gefehlt hat. Der aktuelle Goldstandard zur Quantifizierung der Läsionen ist Abschnitt, Berg und Bild Gehirne mit einem Lichtmikroskop. Die abgebildeten Scheiben sind dann in den nächsten Abschnitten auf einer Atlas abgestimmt, und die ungefähren Koordinaten der Läsionen über Themen werden indirekt gemeldet, oft durch den Einsatz von Kamera Lucida Bilder oder Beispiel histologischen Scheiben3,4 ,5,6,7,8,9,10.
Über die Ungenauigkeit der derzeitigen Läsion Quantifizierung Verfahren sind diese Verfahren zeitaufwändig und fehleranfällig. Kleine Veränderungen im Gehirn Steifigkeit, Klinge Schärfe und Temperatur kann zu verpfuschten, verzogene oder zerrissene Abschnitte führen. Abschnitte können auch ungleichmäßig beflecken und unsachgemäß wegen Luftblasen in das Eindeckmittel abgebildet werden. Wichtig ist, ist beim Schneiden, dreidimensionalen Rahmen der Ort der Läsion im Gehirn verloren, präzise 3D-Rekonstruktion der Läsion im Gehirn schwierig machen.
Eine weitere häufige Anwendung für Läsionen wurde zur Bestimmung der Position von Einzel- und mehrere Aufnahmen der Elektrode im Gehirn. Am Ende der letzten Aufnahmesession Forscher induzieren kleine elektrolytische Läsionen an der Elektrodenspitze und verarbeitet das Gehirn histologisch wie in einem konventionellen Läsion Experiment11getan. Diese Technik leidet die gleichen Nachteile, die oben beschrieben, mit zusätzlichen Problemen ist, dass die elektrolytischen Läsionen meist größer als die Elektroden verwendet sind, um sie zu machen, aber sind in der Regel klein genug, die sie herausfordern, um histologisch zu finden. Wenn mehrere Elektroden, wie im Fall von einer Tuberkuloseinfektion Array eingesetzt werden ist eine Verifizierung durch elektrolytische Läsionen noch schwieriger. Eine Alternative zur elektrolytischen Läsionen ist die Verwendung eines Farbstoffes auf der Elektrode später histologisch12überprüfen, aber diese Technik leidet die gleichen Nachteile, die mit konventionellen Histologie kommen.
Hier beschreiben wir eingehende einer kürzlich beschriebenen Methode13 basierend auf Färbetechniken in Elektronenmikroskopie (EM) und Röntgen-Computertomographie (Mikro-CT), die quantifiziert Läsionen und sucht Elektroden in kleinen tierischen Gehirnen besser als Strom Methoden. Mikro-CT ist ein bildgebendes Verfahren, in dem Röntgenstrahlen an einer Probe geschossen werden, die 360 ° gedreht wird, während ein Szintillator die Röntgenstrahlen nicht abgelenkt durch die Probe sammelt. Das Ergebnis ist eine hochauflösende digitale 3D-Rekonstruktion der Probe, die visualisiert in beliebiger Orientierung und präzise quantifiziert werden kann. Viele Hochschulen haben Mikro-CT-Scannern, die auch im Handel erhältlich sind.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1016px;" width="1016">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:288px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:217px;">Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td align="right" style="width:344px;">15710</td>
			<td style="width:167px;">2% (w/v/) in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutaraldehyde (GA)</td>
			<td>EMS</td>
			<td align="right">16220</td>
			<td>2.5% (w/v) GA in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">OsO4</td>
			<td>EMS</td>
			<td align="right">19190</td>
			<td>Work in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>140, 190, 200 proof</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td align="right">10015</td>
			<td>Glass-distilled</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Durcupan ACM resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">44610</td>
			<td>A, B, C and D components, resin for embedding</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disposable molds</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td align="right">27114</td>
			<td>Suggested</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">milliQ water (ultrapure water)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>QGARD00R1 (or related purifier)</td>
			<td>Suggested</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Parafilm (paraffin film)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Suggested paraffin film</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Micro-CT scanner</td>
			<td>Nikon Metrology Ltd., Tring, UK</td>
			<td>X-Tek HMS ST 225</td>
			<td>Used by authors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Software for visualizing and analyzing micro-CT scans:</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;"></td>
			<td>Volume Graphics</td>
			<td>VG Studio Max</td>
			<td>Used by authors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;"></td>
			<td>FEI / Thermo Scientific</td>
			<td>Avizo</td>
			<td>Used by authors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;"></td>
			<td>FEI / Thermo Scientific</td>
			<td>Amira</td>
			<td>Similar to Avizo</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;"></td>
			<td>Mark Sutton &#38; Russell Garwood</td>
			<td>Spiers</td>
			<td>Free, http://spiers-software.org/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;"></td>
			<td>Pixmeo Sarl</td>
			<td>Osirix Lite</td>
			<td>Free, https://www.osirix-viewer.com/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;"></td>
			<td>Open Source</td>
			<td>FIJI</td>
			<td>Free, https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;"></td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Good for analyzing one slice at a time</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a micro-ct-based method for characterizing lesions and locating electrodes in small animal brains

Verifizierung der Läsion und Elektrode Lage erfolgt traditionell über histologische Untersuchung von gefärbten Gehirnscheiben ein zeitaufwändiges Verfahren, die manuelle Schätzung erfordert. Hier beschreiben wir eine einfache, unkomplizierte Methode zur Quantifizierung der Läsionen und Auffinden von Elektroden in das Gehirn, das ist weniger mühsam und liefert genauere Ergebnisse. Ganze Köpfe sind mit Osmium ausgefällt befleckt, in Harz eingebettet und abgebildet mit einem Mikro-CT-Scanner. Die Scans führen in 3D digital Bänden der Gehirne mit Auflösungen und virtuellen Bereich stärken abhängig von Größe der Stichprobe (12 – 15 und 5 – 6 µm pro Voxel für Ratte und Zebrafinken Gehirne, beziehungsweise). Oberflächlichen und tiefe Läsionen können charakterisiert werden und einzelne Tetroden, Tuberkuloseinfektion Arrays, elektrolytische Läsionen und Silizium-Sonden können auch lokalisiert werden. Freie und proprietäre Software kann Experimentatoren, das Probenvolumen von Flugzeug und Segment die Lautstärke manuell oder automatisch zu prüfen. Da diese Methode ganze Hirnvolumen generiert, können Läsionen und Elektroden in viel höherem Maße als in gängigen Methoden quantifiziert werden die helfen Vergleiche innerhalb und zwischen den Studien zu standardisieren.

Traditionell, Gehirne sind geschnitten und gefärbt um Läsionen zu quantifizieren und Elektroden zu finden, aber diese Methode ist fehleranfällig, arbeitsintensiv, und erfordert in der Regel eine Einschätzung der Ergebnisse. Durch die ganze Gehirne für die Mikro-CT-Bildgebung Vorbereitung, die Wahrscheinlichkeit einer Beschädigung der Proben ist stark reduziert, Sehenswürdigkeiten im Kontext des gesamten Gehirns analysiert werden können und die Methode eignet sich für parallele Ve...

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A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Ein Mikro-CT-basierte Verfahren zur Charakterisierung von Läsionen und Lokalisierung von Elektroden in kleinen tierischen Gehirnen

Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode zur Vorbereitung von kleinen tierischen Gehirne für Mikro-CT-Bildgebung, in welche Läsionen quantifiziert werden können und Elektroden mit hoher Präzision im Kontext des gesamten Gehirns gelegen.

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Neurowissenschaften zu beantworten, indem sie eine einfachere, weniger fehleranfällige und quantitativemethode zur Überprüfung von Läsionen und zum Lokalisieren von Elektrodenstandorten bereitstellt. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Überprüfung von Läsionen und Elektrodenstellen im gesamten Gehirn ermöglicht, ohne dass schnitter. Das Endprodukt ist ein digitales 3D-Volumen des Gehirns und mehrere Gehirne können parallel verarbeitet werden.Obwohl diese Methode bei der Ratte nachgewiesen wird, kann sie auch auf andere Organismen wie Mäuse und Zebrafinken angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da einige Schritte besondere Sorgfalt erfordern, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Um zu beginnen, legen Sie ein extrahiertes Gehirn in Profusion Lösung in einem 50 Milliliter konischen Rohr.Bewahren Sie die Probe zwei bis drei Tage lang mit sanftem Schütteln bei vier Grad Celsius auf. Stellen Sie sicher, dass das Osmium in Wasser und nicht in einem Puffer verdünnt ist. Dies liegt daran, dass das Wasser als mildes Reinigungsmittel wirkt, so dass das Osmium tief in das Gewebe eindringen kann.50 Milliliter 2%Osmiumtetroxid in doppelt destilliertem Wasser zubereiten. Dann legen Sie das Gehirn in eine neue 50 Milliliter konische Röhre und fügen Sie die Osmium-Tetroxid-Lösung. Schließen Sie das Rohr und versiegeln Sie es mit Paraffinfolie, um Leckagen zu vermeiden.Bewahren Sie das versiegelte Rohr bei vier Grad Celsius mit sanftem Schütteln für zwei Wochen auf. Stellen Sie sicher, dass das Rohr horizontal platziert ist. Das Gehirn ist sehr dick und ein langer Weg, um durch Diffusion zu reisen.Wenn Sie das Rohr horizontal platzieren, kann das Osmium tiefer in das Gewebe gelangen. Nachdem die Probe zwei Wochen lang inkubiert wurde, waschen Sie sie fünfmal mit doppelt destilliertem Wasser, um das gesamte ungebundene Osmiumtetroxid aus der Probe zu entfernen. Als nächstes die Probe mit doppelt destilliertem Wasser 30 Minuten bei vier Grad Celsius waschen.Ersetzen Sie das doppelt destillierte Wasser durch vier Verdünnungen von Ethanol, um die Probe zu dehydrieren. Um den Harzinfiltrationsprozess zu beginnen, bewegen Sie die Probe durch drei Aceton- und drei Acetonharzverdünnungen, und tauchen Sie die Probe dann in 100%Harz bei Raumtemperatur ein, um den Infiltrationsprozess fortzusetzen. Danach die Probe in eine Einwegform übertragen.Die Probe vier Stunden lang bei Raumtemperatur mit frischem 100%Harz einfangen. Die Probe im Vakuumofen für 15 Minuten bei 45 Grad Celsius entgasen. Dann die Probe im Ofen für 48 Stunden bei 60 Grad Celsius aushärten.Wenn die Probe ausgehärtet ist, schälen Sie die Einwegform ab und scannen Sie sie mit der Micro-CT-Maschine. Bei der traditionellen Schnitte muss die Orientierung des Gehirns vorbestimmt sein. Mit dieser Micro-CT-Methode kann das digitale Volumen des Probenhirns dreidimensional manipuliert und virtuell in jede Richtung geschnitten werden.Die Rasterelektronenmikroskopie des präparierten Rattenhirns bestätigt, dass das Gewebe für die Zwecke der Mikro-CT-Bildgebung nicht signifikant geschädigt wurde. Ein Zebrafinkenhirn wurde ebenfalls nach diesem Protokoll vorbereitet und gescannt, um den Nutzen dieser Methode an anderen kleinen Tierhirnen zu testen. Diese Technik kann verwendet werden, um Oberflächenläsionen im Gehirn zu finden, sowie Läsionen tief im Gehirn.Diese Technik kann auch auf die Position einzelner Tetrodes in situ, elektrolytische Läsionen, Elektrodenspuren, Tetro-Arrays in situ und Siliziumsonden in situ angewendet werden. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, das Gehirn zu erlauben, für lange genug und mit genügend Agitation zu brüten. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Optogenetik und Zwei-Photonen-Bildgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über die Rolle zu beantworten, die verschiedene Gehirnbereiche in verschiedenen Verhaltensweisen spielen.Diese Technik könnte es Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften ermöglichen, Struktur-Funktions-Beziehungen zwischen Gehirn und Verhalten bei Ratten, Mäusen, Singvögeln und anderen Kleintieren besser zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Osmium extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Handschuhen und das Arbeiten in einer Vakuumhaube, sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Automatisierte Interactive Video Playback für Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Forschung

Neurowissenschaften

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

Eine allgemeine Methode zur Bewertung der Inkubation von Saccharose Craving in Ratten

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

A Method for Systematic Electrochemical and Electrophysiological Evaluation of Neural Recording Electrodes

Eine Methode zur systematischen Elektrochemische und elektrophysiologische Bewertung der Neural Aufzeichnungselektroden

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Eine einfache und kostengünstige Methode zur Bestimmung der Überempfindlichkeit auf Kälte und Anpassung an der Maus

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Die Herstellung von High-Kontakt-Dichte, Flach-Interface Nerve Elektroden für die Aufnahme und Stimulation Anwendungen

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Rabies Necropsy Techniques in Large and Small Animals

Tollwut-Nekropsie-Techniken bei großen und kleinen Tieren

The New York State Department of Health (NYSDOH) Rabies Laboratory receives between 6,000 to 9,000 specimens annually and performs rabies testing for the ...

Abbiategrasso Brain Bank Protocol for Collecting, Processing and Characterizing Aging Brains

Abbiategrasso Brain Bank Protocol zum Sammeln, Verarbeiten und Charakterisieren alternder Gehirne

In a constantly aging population, the prevalence of neurodegenerative disorders is expected to rise. Understanding disease mechanisms is the key to find ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Vorbereitung von peripheren Nervenstimulationselektroden für die chronische Implantation bei Ratten

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Subretinale Transplantation von menschlichem embryonalem Stammzellgewebe in einem katzenartigen Großtiermodell

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...