Name: analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers
Uploaded: 2019-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

أصحاب البلاغ ممتنون جدا لميريام أوسترفيلد لتقاسم مشورتها على التصوير الحياة في المختبر من غرف البيض باستخدام نهج اعتمد من مختبر سيليست بيرغ4. كما نشكر سيباستيان تسي على الخط الفيجي الذي يمكّن من تجزئة الخلايا.

ملاحظة: يوفر البروتوكول التالي إرشادات حول كيفية تحليل الأتوموسين في الخلايا المحلية ومقياس الأنسجة في غرف البيض دروسوفيلا. يسمح النهج المحلي للمستخدمين بتحليل سلوك الكنتوموسين المفصل في ما يصل إلى 15 خلية لكل غرفة بيض ويتطلب الحصول على TLMs لفترة قصيرة من الزمن (5-10 دقيقة) باس?...

<ol>
	<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).</li><li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+oogenesis.">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68, 207-217 (2014).</li><li>Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Ovaries.">Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries.</a> Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).</li><li>Peters, N. C., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Culturing+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Egg+Chambers:+A+History+and+Adaptable+Method.">In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method.</a> Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).</li><li>Spradling, A. C., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Genetics+of+Oogenesis.">Developmental Genetics of Oogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. , 1-70 (1993).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331, 1071-1074 (2011).</li><li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila.">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development. 143, 1375-1387 (2016).</li><li>Pokrywka, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+GFP-labeled+proteins+in+Drosophila+oocytes.">Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50044 (2013).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bullwinkle+is+required+for+epithelial+morphogenesis+during+Drosophila+oogenesis.">bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).</li><li>Cetera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+rotation+promotes+the+global+alignment+of+contractile+actin+bundles+during+Drosophila+egg+chamber+elongation.">Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation.</a> Nature Communications. 5, 5511 (2014).</li><li>Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+rotation+is+preceded+by+planar+symmetry+breaking+of+actomyosin+and+protects+epithelial+tissue+from+cell+deformations.">Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations.</a> PLOS Genetics. 13, e1007107 (2017).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+polarized+actomyosin+contractile+flows+control+epithelial+junction+remodelling.">Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling.</a> Nature. 468, 1110-1114 (2010).</li><li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis.">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).</li><li>. Surface manager Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager">https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager</a> (2018)</li><li>. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins">https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins</a> (2018)</li><li>. BigDataViewer Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/BigDataViewer">https://imagej.net/BigDataViewer</a> (2017)</li><li>Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigDataViewer:+visualization+and+processing+for+large+image+data+sets.">BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets.</a> Nature Methods. 12, 481-483 (2015).</li><li>Turner, C. M., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons+in+the+morphogenesis+of+epidermal+hairs+during+wing+development+in+Drosophila.">Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila.</a> Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).</li><li>Heemskerk, I., Streichan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cartography:+compressing+bio-image+data+by+dimensional+reduction.">Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction.</a> Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).</li><li>Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+Breaking+in+an+Edgeless+Epithelium+by+Fat2-Regulated+Microtubule+Polarity.">Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity.</a> Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).</li><li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists.">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nature Methods. 12, 30-34 (2015).</li></ol>

الخطوات الحرجة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتشريح وزراعة غرف البيض
إذا تم وضع الكثير من الذباب في قارورة صغيرة، يمكن أن يتحول الطعام يطير الموحلة بعد 2-3 أيام بسبب كميات كبيرة من اليرقات تغذية والذباب الكبار الحصول على المحاصرين في الغذاء يطير. في مثل هذه الحالة، الو...

وقد أدى التطوير المستمر لتكنولوجيات التصوير والبرمجيات الجديدة ذات التطبيقات في علوم الحياة إلى تأثير هائل على فهم المبادئ الأساسية للحياة. أحد التحديات الرئيسية هو التصور الموثوق به للعمليات التنموية بالاقتران مع تصويرها الحي في أنسجة مختلفة. الأنسجة هي أجزاء من الأعضاء والهيئات، وعلى هذا النحو، فإن الغالبية لا يمكن الوصول إليها بسهولة للتصوير. ولذلك، تم وضع بروتوكولات تسمح بتشريحها والزراعة في المختبر من أجل تصور الأحداث البيولوجية التي تعكس بما فيه الكفاية حالة في الجسم الحي داخل الجسم الحي.
على مدى العقود الماضية، وقد ساهم زراعة والتصوير الحي لغرف البيض Drosophila، هياكل تشبه acinar تشبه الأجهزة البدائية، بشكل كبير في فهم المبادئ الأساسية لتطوير الأعضاء البدائية1 , 2 , 3.حاليا، هناك العديد من بروتوكولات الزراعة المتاحة، واستخدامها يعتمد على وقت اكتساب، ونوع الخلية ليتم تصويرها، وسهولة الوصول إليها (على سبيل المثال، الجرثومية الداخلية مقابل الخط الجسدي الخارجي)4.
ومن السمات الشائعة في جميع بروتوكولات الزراعة هذه الحاجة إلى تجميد غرف البيض التي تم تحليلها التي تعرض نشاط ًا منضدية عالية في الوسائط السائلة. ويتسبب النشاط العقدي من غرف البيض أساسا من ورقة العضلاتالتي تغطي سلسلة طويلة من غرف البيض المتصلة 5،6،7. لذلك، لتحقيق الجمود السليم من غرف البيض الشباب، وقد وضعت نهج مختلفة،والتي تنطوي على تغطية غرف البيض مع الأغطية 6،8،9 أو البطانيات المرنة4، 10 أو تضمينها في منخفضة ذوباننقطة agarose 3،11. هذه النهج تحظى بشعبية لأنها تسمح أيضا بتصوير طائرة بصرية أكبر بسبب تسطيح خفية من سطح محيطي من غرف البيض.
ومع ذلك، في الآونة الأخيرة، فقد تبين أن غرف البيض الشباب (المرحلة 1-8) تدور حول محورها الأمامي الخلفي6، وأن هذه الحركة الأنسجة مدعوم من شبكة actomyosin غرامة قريبة من السطح المحيطي من هذه الغرف البيض الشباب 12.ولذلك، فإن التغيير الاصطناعي للسطح الخلوي الناجم عن تسطيح خفية من هذا النسيج قد يكون لها تأثير سلبي على سلوك آلات actomyosin توليد القوة. والنقطة المضادة هي أنه إذا لم يتم تسطيح أنسجة غرفة البيض، فإن التصوير المجهري للبروتينات على السطح المحيطي لغرف البيض يصبح أكثر محدودية بسبب انخفاض حجم مستوى الاستحواذ.
لذلك، قمنا بالجمع بين بروتوكولات من Prasad وآخرون9 ومختبر سيليست بيرغ 4،10 وتعديلها مرة أخرى بحيث لا يتم استخدام غطاء / بطانية مرنة / أجاروز في الطريقة المتقدمة. يتم زراعة غرف البيض Drosophila بحرية في وسائل الإعلام والبروتوكول المعروض هنا ينطبق فقط المجهرية المقلوبة. هناك جزأين للبروتوكول. ويركز الجزء الأول على تحليل إشارات الأتوموسين على النطاق الخلوي المحلي (ما يصل إلى 15 خلية) داخل غرف البيض. في الجزء الثاني، نركز على التغلب على القيود المرتبطة بطائرة اقتناء صغيرة بسبب زراعة غرف البيض مجاناً. وفي هذا الصدد، قمنا بتطوير طريقة حسابية جديدة مقرها فيجي مع واجهة مستخدم رسومية شبه تفاعلية تستخرج وتتكشف بشكل انتقائي طبقات محددة من سطح الأنسجة المحيطية. ويلي ذلك بروتوكول يصف كيفية تحليل الكنتوموسين على مقياس الأنسجة (أي، >50 خلية). وبما أن الاستخراج الانتقائي لطبقة رقيقة محددة من الأنسجة الظهارية المنحنية لم يكن من الممكن بسهولة باستخدام إسقاط z-stack الكلاسيكي (الشكل1)، فإن هذه الطريقة السهلة الاستخدام بمثابة شرط مسبق هام لفهم الأنسجة الظهارية بشكل شامل سلوك شبكة أكميوسين رقيقة (<1 μm) على مقياس الأنسجة في غرف البيض دروسوفيلا.
بالإضافة إلى ذلك، لتسهيل البروتوكول، نقدم مثال أفلام الفاصل الزمني (TLMs) وملفات عينة من سلوك Myosin II التقليدي غير العضلي ذو العلامات الفلورية (انظر الملف التكميلي3). Myosin II هو بروتين محرك ويمثل الجزء التقلصي النشط من آلات actomyosin. من أجل صورة Myosin الثاني، ونحن نستخدم خطوط Drosophila المعدلة المعدلة التي تحتوي على سلسلة ضوء التنظيمية المعدلة من Myosin الثاني دعا MRLC::GFP (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل)12،13. من أجل تصور أغشية الخلايا، ويستند البروتوكول على الأصباغ التجارية (انظر جدولالمواد). هذا البروتوكول هو مناسبة ليس فقط لتحليل الصغيرة دون الخلوية MRLC::GFP إشارات12 ولكن أيضا لأي جزيئات شبه خلوية مماثلة الحجم حول ± 300 درجة مئوية، مثل تلك التي لوحظت مع Life-Act::GFP12,14.
على الرغم من أن كلا البروتوكولين يتم تقديمها باستخدام غرف البيض Drosophila المستزرعة في المختبر، يمكن أيضا أن يتم الحصول على إشارات الactomyosin باستخدام أنسجة أخرى على الاستفادة المثلى من وسائل الإعلام زراعة واعتمادا على توافر من البروتينات ذات العلامات الفلورية مع الأصباغ التجارية المقابلة أو، على سبيل المثال، الحقن المجهرية mRNA للحصول على ملامح التعبير الجيني العابر. وبالمثل، يمكن تطبيق البروتوكول القائم على فيجي لاستخراج طبقة رقيقة من سطح محيطي بشكل أعم على الأنسجة المثلة بالقطع الناقص والأعضاء.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schneider Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720-024</td>
			<td>[+]-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#160;[+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 &#181;g/ml Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;F135</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Solution Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033NS</td>
			<td>33 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td></td>
			<td>&#160;#55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Deep Red (cell membrane dye)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64 (cell membrane dye)</td>
			<td>ThermoFisher/Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression dissection slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-560B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steromicroscope</td>
			<td>e.g. Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi SV 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic glass/cover glass</td>
			<td>e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wironit needle holder</td>
			<td>Hammacher</td>
			<td>9160020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus spine</td>
			<td>Echinocactus grusonii/barrel cactus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila stocks used in the manuscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers

ويسمى البيض Drosophila غير ناضجة غرف البيض، وهيكلها يشبه الأجهزة البدائية التي تخضع للتغيرات المورفولوجية من جولة إلى شكل القطع الناقص أثناء التنمية. وتسمى هذه العملية التنموية oogenesis وحاسمة لتوليد البيض ناضجة وظيفية لتأمين الجيل القادم ذبابة. لهذه الأسباب، كانت غرف البيض بمثابة نموذج مثالي وذي صلة لفهم تطور الأعضاء الحيوانية.
وقد وضعت عدة بروتوكولات الزراعة في المختبر، ولكن هناك العديد من العيوب لهذه البروتوكولات. واحدة يتضمّن التطبيق من تغطيات مختلفة أنّ يمارس ضغطة اصطناعيّة على ال يصور بيضة غرف [إين وردر تو] عاقمتهم وأن يزيد ال يصور اكتساب مستوى من السطح محيطيّة من ال يحلّ بيضة غرف. مثل هذا النهج قد تؤثر سلبا على سلوك آلات actomyosin رقيقة التي تولد القدرة على تدوير غرف البيض حول محورها أطول.
وهكذا، للتغلب على هذا القيد، ونحن ثقافة غرف البيض Drosophila بحرية في وسائل الإعلام من أجل تحليل موثوق آلات actomyosin على طول محيط غرف البيض. في الجزء الأول من البروتوكول، نقدم دليل بالتفصيل كيفية تحليل آلات actomyosin في طائرة اقتناء محدودة على نطاق الخلوية المحلية (ما يصل إلى 15 خلية). في الجزء الثاني من البروتوكول، ونحن نقدم للمستخدمين مع البرنامج المساعد الجديد مقرها فيجي التي تسمح استخراج بسيطة من طبقة رقيقة محددة من سطح غرف البيض المحيطية. ثم يصف البروتوكول التالي كيفية تحليل إشارات الأتوموسين على مقياس الأنسجة (>50 خلية). وأخيرا، نحدد أوجه القصور في هذه النهج على كل من النطاقات الخلوية والأنسجة المحلية ونناقش تطورها المحتمل في المستقبل وتطبيقاتها الممكنة.

يمكّن هذا البروتوكول العلماء من التحقيق في سلوك شبكات الكتميوسين في الأنسجة الظهارية. هذا ممكن فقط عندما يتم الجمع بين تحليل مفصل لسلوك الأتوموسين على النطاق الخلوي المحلي (عدد قليل من الخلايا) مع تحليل مماثل على مقياس الأنسجة (العديد من الخلايا). ومع ذلك، غالبا ما تكون ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

يوفر هذا البروتوكول منهجية قائمة على فيجي وسهلة الاستخدام إلى جانب تعليمات مباشرة تشرح كيفية تحليل سلوك الكنتوموسين بشكل موثوق في الخلايا الفردية والأنسجة الظهارية المنحنية. لا توجد مهارات البرمجة المطلوبة لمتابعة البرنامج التعليمي. يتم تنفيذ جميع الخطوات بطريقة شبه تفاعلية باستخدام واجهة المستخدم الرسومية من فيجي والإضافات المرتبطة بها.

تحليل ديناميات Actomyosin في جداول الخلوية والأنسجة المحلية باستخدام أفلام الفاصل الزمني من غرف البيض Drosophila المستزرعة

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

يساعد بروتوكولنا العلماء على تحليل شبكة أكتوميوسين دون الخلايا في الخلايا الظهارية الفردية ويسمح لهم أيضًا بإجراء تحليل مماثل على نطاق متعدد الخلايا في الأنسجة الظهارية المنحنية. بروتوكولنا هو مثال لطيف على تطبيق فيجي. لديها واجهة مستخدم رسومية بديهية ، ولا تتطلب أي معرفة بالبرمجة النصية.ولذلك ، فهي مناسبة للغاية أيضا للمستخدمين المبتدئين في هذا المجال. على الرغم من أن طريقتنا وضعت لغرف البيض Drosophila، فإنه ينطبق أيضا خارج دروبيليا دروسفيلا. ونحن نشجع العلماء على اختبار بروتوكولنا في نظمهم النموذجية.استخدم ملفات الاختبار المصاحبة للتعرف على هذا البروتوكول. وسوف تساعدك على تحديد أي جزء من هذا البروتوكول هو مناسبة لسؤال البحوث الفردية الخاصة بك. يسمح هذا الجزء من البروتوكول للمستخدمين بتجزئة الخلايا الظهارية في أفلام الفاصل الزمني وتحليل نبضات أكتوميوسين في الخلايا الفردية بمرور الوقت باستخدام مدير Surface Manager.لبدء، افتح فيجي، واستيراد ماكرو الأنسجة الخلايا الخلاياالمفمول. ijm كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق. ثم افتح ملف TIFF مصححة، وقم بتقسيم قنوات الملف المصحح بالتبييض عن طريق الانتقال إلى شريط القوائم، وتحديد صورة، متبوعة بالألوان، وتحديد قنوات الانقسام.تشغيل البرنامج النصي الذي تم تحميله على قناة غشاء الخلية النشطة للفيلم الفاصل الزمني المحدد عن طريق الضغط على أيقونة تشغيل في البرنامج النصي المفتوح. من أجل الحصول على قناع خلية لطيفة، تعيين طمس Gaussian إلى 2.500 وحساسية الكشف عن الخلايا إلى ناقص واحد، وانقر فوق موافق. ثم تعيين التسامح الضوضاء المقدر بين 10 و 20 لأفلام الفاصل الزمني المكتسبة مع الهدف 63x، وانقر فوق موافق. يظهر قناع خلية تم إنشاؤه في فيلم الفاصل الزمني المحلل ، ويظهر إطار جديد يسمى ParticleStack ، ويظهر أيضًا إطار صغير يسمى Action Required. من قناع الخلية على الفيلم الفاصل الزمني، والتركيز فقط على الخلايا في الوسط، وحدد تلك التي يمكن أن توفر خطوط خارجية كاملة ومحددة جيدا في جميع أنحاء الفيلم الفاصل الزمني.عندما تتوافق الخلايا المحددة في المركز بشكل جيد مع أغشية الخلايا الحقيقية ، احفظ ParticleStack كملف TIFF. افتح ملف ParticleStack TIFF المطابق في فيجي. مع تثبيت البرنامج المساعد Surface Manager في فيجي، افتح البرنامج المساعد.في إدارة السطح، انقر فوق الزر قراءة صورة المخطط التفصيلي، وتعيين مؤشر جاككارد إلى 60٪ تحميل الخطوط العريضة قد يستغرق عدة دقائق اعتماداً على عدد الخلايا. بمجرد تحميل، سيتم تعيين رقم S لكل خلية وتظهر في الجزء الأيمن من نافذة Surface Manager. انقر فوق رقم S المحدد بحيث المخطط التفصيلي للخلية المستوردة من ParticleStack1.تظهر tiff على الفيلم الفاصل الزمني. تحقق من كل رقم S مستورد للحصول على جودة المخطط التفصيلي للخلية خلال الفيلم، وإزالة الخلايا غير المرغوب فيها التي تعرض حدوداً خارجية غير صحيحة للخلية. لإزالة خلية غير مرغوب فيها، قم بتمييز مخطط الخلية وانقر على الزر حذف.استخدم أداة فرشاة لتصحيح حدود الخلية. عند الانتهاء، احفظ الخلايا المصححة كـ RoiSet. ملف مضغوط.لتحديد ما إذا كانت البقول أكتوميوسين موجودة في الأنسجة التي تم تحليلها وفهم السلوك التفصيلي ، وكذلك اتجاه إشارات أكتوميوسين ، تبدأ بفتح فيجي. فتح فيلم الفاصل الزمني، تحميل الجسيمات المحفوظة1. قناع خلية tiff والفيلم الفاصل الزمني المصحح بالتبييض، ثم قم بتحميل المكون الإضافي Surface Manager والمنطقة المقابلة ذات الاهتمام من RoiSet.ملف مضغوط. بعد ذلك، في "مدير Surface"، قم بتنشيط قناة مع إشارات الاهتمام. انقر فوق الزر إحصائيات للحصول على إطار يسمى متوسط قيمة الرمادية شريحة حسب الشريحة.سيتم عرض الشدات المتوسطة والوسيلية لإشارات أكتوميوسين بمرور الوقت في وحدات تعسفية، وكذلك معلمات أخرى تتعلق بمساحة الخلية وشكلها. حفظ القيم كملف جدول بيانات عن طريق الانتقال إلى إطار الإحصائيات، والنقر على ملف، وتحديد حفظ As.similarly، إنشاء قناع خلية، وتحميله في مدير السطح من أجل تحليل نبضات أكتوميوسين في مقياس الأنسجة. يسمح هذا الجزء من البروتوكول للمستخدمين باستخراج طبقة رقيقة من أكتوميوسين في الأنسجة الظهارية المنحنية بمرور الوقت.هذه الخطوات سهلة الاستخدام وتستند إلى واجهة رسومية بديهية. افتح فيجي، وتأكد من تثبيت المكون الإضافي لإسقاط سطح الإهليلجي. ثم، فتح فيلم الفاصل الزمني، وتصديره كملف XML/HDF5 عن طريق النقر على الإضافات، والذهاب إلى BigDataViewer، وتحديد تصدير الصورة الحالية كملف XML/HDF5.بعد ذلك ، افتح الملف المصدر في إسقاط سطح الإهليلجي من خلال الانتقال إلى الإضافات ، والنقر على BigDataViewer ، متبوعًا بإسقاط سطح الإهليلجي ، وتحديد ملف XML. هذا سيفتح نافذة جديدة مع وجهات النظر القوس من غرفة البيض، وسوف تظهر مربع حوار لتوجيه المستخدم من خلال معالجة. إطار الحوار، يسمى إسقاط المبيضين، يحتوي على علامات تبويب متعددة.في علامة التبويب الحوار الأول، تسمى مربع المحيط، قم بتعريف حدود x و y لحجرة البيض في فيلم الفاصل الزمني مع عرض z للمربع المحيط، ثم اضغط على مجموعة. يتم تمييز الأجزاء المختارة من غرفة البيض باللون الوردي. بعد ذلك، حدد حجم النقط الإشارة في علامة التبويب الحوار تسمى البحث عن النقط في إطار الإسقاط المبيض.تعريف سيجما وقيمة الذروة الحد الأدنى. ثم، اضغط على حساب لتحديد إشارات أكتوميوسين، والتي سوف تظهر على أنها النقط الخضراء. أعد محاولة هذه الخطوة مع معلمات مختلفة حتى يتم العثور على حوالي 100 البقع.تحديد إشارات أكتوميوسين هو خطوة حاسمة. ذلك يعتمد على جودة الإشارة والحجم الصحيح من النقط المكتشفة. إذا لم تكن هناك بقع خضراء مرئية في الصورة، ثم الخطوة التالية لن تعمل.لتصميم الإهليلجي، تابع مع علامة التبويب التي تسمى الإهليلجي المناسب. تعيين عينات عشوائية إلى 10،000، خارج / داخل قطع المسافة إلى واحد إلى 10، ثم انقر فوق حساب. بعد ذلك، سيتم فتح علامة التبويب تسمى الإسقاط تلقائياً ويسمح بتعريف استخراج السطح.في علامة التبويب الإسقاط، قم بإعداد مسافة عرض الحد الأدنى والأقصى كعرض الإهليلجي المطلوب. يجب أن تتناسب مسافة الإسقاط الحد الأدنى والأقصى بحيث تتضمن منطقة الإهليلجية ذات التعريف الوردي الطبقة الخارجية بأكملها من غرفة البيض. ثم، حدد مسافة الشريحة كشريحة واحدة.تأكد من أن المنطقة الوردية من الإهليلجي مع تعريف مع على غرفة البيض مرئية قبل الضغط على حساب. يساعد على تقييم جودة تناسب جديد من الإهليلجي. بعد ذلك، تعيين عرض إخراج من الإهليلجي إلى أكبر من أو يساوي 800 وارتفاع أكبر من أو يساوي 400.ثم، تعيين مدة استخراج السطح، واختيار إما كروية أو إسقاط أسطواني. إذا لزم الأمر، قم بقلب Z ومحاذاة Y.Press لحساب للحصول على استخراج السطح لكلا القناتين في نوافذ جديدة تسمى الصورة. ضبط سطوع وعلى النقيض من النوافذ الصورة التي تم الحصول عليها لتكون قادرة على رؤية الإشارات actomyosin المتوقعة من خلال النقر على الصورة، والذهاب إلى ضبط، واختيار السطوع / التباين.إذا كان استخراج السطح يبدو جيدًا، احفظ كلا القناتين بشكل منفصل كملفات TIFF. بالإضافة إلى ذلك، حفظ ملف نافذة السجل للرجوع إليها في المستقبل كيفية استخراج سطح هذه الغرفة البيض معينة. ثم دمج القنوات مع رمز اللون المفضل في فيجي وحفظ النتائج كملفات TIFF.هذا البروتوكول يتيح للعلماء للتحقيق في سلوك شبكات أكتوميوسين في الأنسجة الظهارية. وهذا ممكن فقط عندما يتم الجمع بين تحليل مفصل للسلوك أكتوميوسين في النطاق الخلوي المحلي مع تحليل مماثل على نطاق الأنسجة. تظهر هنا أمثلة تمثيلية من السلوك الديناميكي myosin II على النطاق الخلوي المحلي وعلى مقياس الأنسجة للسيطرة و fat2 متحولة Drosophila البيض غرف.على المستوى الواحد القاعدي، تنتقل سلسلة الضوء التنظيمي المعدلة الخضراء لإشارات الميوسين الثاني عمودية على المحور الأمامي الأمامي لحجرات البيض الخاضعة للتحكم. يتم فقدان هذه القطبية في غرف البيض متحولة fat2 ويؤدي إلى نبضات myosin II anisotropic، والتذبذبات على مستوى الأنسجة، والأخضر تعديل سلسلة الضوء التنظيمي من الميوسين الثاني في عينة التحكم يولد القوة المتزامنة اللازمة لتعزيز التناوب الظهارية. في المقابل، ظهارة المسام من غرفة البيض متحولة الدهون2 نبض بقوة في الجانب القاعدي ويفشل في توليد القوة المتزامنة اللازمة لتعزيز التناوب الظهارية.في منطقة رقيقة من البيض Drosophila غرفة, متحولة الدهون2 كما يقدم مع السلوك الديناميكي المتغيرة من سلسلة الضوء التنظيمي المعدلة الخضراء من myosin II.After مشاهدة هذا الفيديو, يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن كيفية تحليل شبكة أكتوميوسين على نطاق المحلية والأنسجة في غرف البيض Drosophila باستخدام فيجي. للحصول على مزيد من التلميحات العملية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، الرجاء مراجعة جزء المناقشة بعد البروتوكول. إذا كان لديك أي أسئلة تتعلق فيجي أو الإضافات لدينا، راجع صفحات الويب المعنية أو الاتصال بنا.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

التصوير تستقيم من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; غرف البيض

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

التقاط إصلاح الأنسجة في الزرد اليرقات مع الوقت الفاصل بين Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

تحليل<em&gt; في فيفو</em&gt; الهجرة الخلية باستخدام الزرع خلية والتصوير الوقت الفاصل في الزرد الأجنة

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

تحليل التنمية الكلى الزرد مع الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام مجهر تشريح مجهزة لباجتزاء البصري

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

التصوير الكالسيوم في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; في تنشيط البيض

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; طريقة التصوير الوقت الفاصل بين الجرذ شبكات الاوعية الدموية الدقيقة مساريقي مثقف

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

تحليل الحركية فاسكولوجينيسيس يقد ديناميات فاسكولوجينيسيس والأوعية في المختبر

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

في فيفو تصوير Morphogenesis وتر العضلات في المورفولوجية الخوادر

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

التصوير والتحليل لاتجاهات الأنسجة وديناميات النمو في الظهارة الهوائية النامية Drosophila خلال مراحل البوبال

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

التتبع العكسي للخلايا العصبية للمحركات الجنينية باستخدام الاصباغ الفلورية الليبوهيلليك

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...