Name: analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers
Uploaded: 2019-06-03T12:30:00
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作者非常感谢米里亚姆·奥斯特菲尔德使用塞莱斯特·伯格实验室4采用的方法分享她对卵子室体外生命成像的建议。我们还感谢塞巴斯蒂安·托西的斐济脚本,使细胞分割。

注:以下协议提供了如何分析局部细胞和果蝇卵室组织规模的肌苷的说明。本地规模方法允许用户分析每个蛋室多达15个细胞中的详细肌苷行为,并要求使用高速成像和倒置共聚焦显微镜在短时间内(5-10分钟)采集TMS。相比之下,组织规模为用户提供50-100个细胞中的actomyosin信息,并且需要使用低速成像和倒旋转盘显微镜长期(±30分钟)采集TMS(参见图2和表 1</st...

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Surface manager Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager">https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager</a> (2018)</li><li>. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins">https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins</a> (2018)</li><li>. 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J., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+Breaking+in+an+Edgeless+Epithelium+by+Fat2-Regulated+Microtubule+Polarity.">Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity.</a> Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).</li><li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists.">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nature Methods. 12, 30-34 (2015).</li></ol>

蛋室解剖和培养的关键步骤和故障排除
如果太多的苍蝇被放入一个小瓶中,由于大量喂食幼虫和成年苍蝇被困在苍蝇食物中,苍蝇食物在2~3天后会变浑浊。在这种情况下,将这些苍蝇剩下的放入一个新的小瓶中,加入新鲜食物,并缩小它们的数量。特别是,排除被困在食物中的女性。
施耐德混合物(SM)应提前准备,可在4°C下储存14天。请注意,较旧的混?...

新型成像和软件技术在生命科学中的应用不断发展,对理解生命的基本原则产生了巨大影响。主要挑战之一是动态发育过程的可靠可视化,以及不同组织中的实时成像。组织是器官和身体的一部分,因此,大多数不容易获得成像。因此,已经制定了允许其解剖和体外培养的协议,以便可视化生物事件,充分反映活体内的体内状况。
在过去的几十年里,果蝇卵室的培养和活成像,类似原始器官的类似类似类似动物的结构,极大地促进了对原始器官发育基本原则的理解1。,2,3.目前,有几种培养协议可用,其使用取决于采集时间、要成像的细胞类型及其可访问性(例如,内生殖系与外体线)4 。
所有这些培养协议中的一个共同特征是需要固定分析的蛋室,这些卵室在液体介质中表现出高收缩活性。卵室的收缩活动主要是由覆盖着一长串连接的卵室5、6、7的肌肉表引起的。因此,为了适当固定幼蛋室,已开发出各种方法,包括用盖片覆盖蛋室6、8、9或柔性毛毯4, 10或嵌入低熔点甘蔗3,11。这些方法很受欢迎,因为它们还允许对更大的视觉平面进行成像,因为蛋室的圆周表面很细平。
然而,最近,已经表明,年轻的卵室(阶段1-8)围绕其前后轴6旋转,并且这种组织运动是由接近这些年轻卵室圆周表面的精细肌苷网络供电的12.因此,由这种组织细微扁平引起的细胞表面的人工改变可能对产生力的肌苷机械的行为产生负面影响。相反,如果卵室组织不扁平,卵室圆周表面的蛋白质显微成像将因采集平面尺寸减小而变得更加有限。
因此,我们结合Prasad等人9和Celeste Berg 4、10实验室的协议,进一步修改它们,以便在开发的方法中不使用盖玻片/柔性毯子/agarose。果蝇卵室在介质中自由培养,此处介绍的协议仅适用于倒置显微镜。该协议分为两个部分。第一部分侧重于分析在卵室内局部细胞规模(多达15个细胞)的actomyosin信号。在第二部分,我们专注于克服与卵子室自由培养引起的小采集平面相关的限制。在这方面,我们开发了一种基于斐济的新型计算方法,采用半交互式图形用户界面,选择性地提取和展开圆周组织表面的已定义层。之后是一个协议,描述如何在组织规模(即>50细胞)分析肌苷。由于使用经典 z 堆栈投影(图 1)选择性地提取已定义的曲面上皮组织的薄层(图1),这种易于使用的方法是全面了解在果蝇卵室的组织尺度上,一个薄(<1μm)的肌苷网络的行为。
此外,为了方便该协议,我们提供示例延时电影(TlMs)和荧光标记的非肌肉常规肌苷II行为的样本文件(见补充文件3)。肌苷II是一种运动蛋白,代表肌酸机械的活性收缩部分。为了成像肌辛II,我们使用果蝇转基因线,其中包含一个经过修饰的肌素II的调节光链,称为MRLC::GFP(详见材料表)12,13。为了可视化细胞膜,该协议基于商业染料(见材料表)。该协议不仅适用于分析小亚细胞MRLC::GFP信号12,也适用于±300μM周围的任何类似大小的亚细胞粒子,如使用生命行动::GFP 12、14观测到的亚细胞粒子。
虽然这两种协议都使用体外培养的果蝇卵室呈现,但在优化培养培养培养和取决于可用性时,也可以使用其他组织进行actomyosin信号的采集荧光标记的蛋白质与相应的商业染料,或,例如,mRNA显微注射,以获得瞬态基因表达配置文件。同样,从圆周表面提取薄层的斐济协议可以更普遍地应用于椭圆体和类似器官的组织中。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schneider Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720-024</td>
			<td>[+]-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#160;[+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 &#181;g/ml Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;F135</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Solution Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033NS</td>
			<td>33 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td></td>
			<td>&#160;#55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Deep Red (cell membrane dye)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64 (cell membrane dye)</td>
			<td>ThermoFisher/Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression dissection slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-560B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steromicroscope</td>
			<td>e.g. Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi SV 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic glass/cover glass</td>
			<td>e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wironit needle holder</td>
			<td>Hammacher</td>
			<td>9160020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus spine</td>
			<td>Echinocactus grusonii/barrel cactus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila stocks used in the manuscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers

果蝇未成熟卵被称为卵室,其结构类似于原始器官,在发育过程中从圆形到椭圆形形态发生形态变化。这种发育过程被称为"成因",对于生成功能成熟卵子以确保下一代苍蝇至关重要。由于这些原因,卵室已成为了解动物器官发育的理想和相关模型。
已经开发了几种体外培养方案,但这些协议有几个缺点。其一涉及应用各种盖,对图像蛋室施加人工压力,以固定它们,并增加被分析的蛋室圆周表面的图像采集平面。这种方法可能会对产生围绕其长轴旋转蛋室的功率的薄肌苷机械的行为产生负面影响。
因此,为了克服这一限制,我们在介质中自由培养果蝇卵室,以便可靠地分析沿着蛋室周长的actomyosin机械。在协议的第一部分,我们提供了一份手册,详细介绍了如何在局部细胞规模(最多15个细胞)的有限采集平面中分析actomyosin机械。在协议的第二部分,我们为用户提供了一个新的基于斐济的插件,允许简单地提取蛋室圆周表面的一个定义的薄层。然后,以下协议描述了如何在组织尺度(>50细胞)分析肌苷信号。最后,我们指出这些方法在局部细胞和组织尺度上的局限性,并讨论其潜在的未来发展和可能的应用。

该协议使科学家能够研究上皮组织中阿托米辛网络的行为。只有当对局部细胞规模(少数细胞)的肌肌苷行为进行详细分析与组织规模(许多细胞)的类似分析相结合时,才可能。然而,上皮组织往往是弯曲的,提取这些组织的薄层以前不容易,如果蝇卵室(图1所示)。此处提供的协议为用户提供了简单的说明,说明如何在这两个尺度下分析肌苷行为(<strong c...

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Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

该协议提供了一种基于斐济的、用户友好的方法,以及解释如何可靠地分析单个细胞和弯曲上皮组织中的actomyosin行为的直截了当的说明。无需编程技能即可遵循本教程;所有步骤均使用斐济的图形用户界面和相关插件以半交互式方式执行。

使用培养的果蝇卵室延时电影对局部细胞和组织尺度的actomyosin动力学的分析

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

我们的协议帮助科学家分析单个上皮细胞中的亚细胞现象素网络，并允许他们在弯曲的上皮组织中以多细胞尺度进行类似的分析。我们的协议是斐济应用程序的一个很好的例子。它有一个直观的图形用户界面，它不需要任何脚本知识。因此，它非常适合新手用户在外地。虽然我们的方法是为果蝇卵室开发的，但它也适用于果蝇表皮外。我们鼓励科学家在他们的模型系统中测试我们的协议。使用附带的测试文件来熟悉此协议。它将帮助你决定此协议的哪一部分适合您的个人研究问题。协议的这一部分允许用户在延时电影中分割上皮细胞，然后使用 Surface Manager 分析单个细胞中偶发素脉冲。首先，打开斐济，并导入宏组织细胞段电影。ijm，如随附的文本协议中所述。然后，打开漂白剂校正的 TIFF 文件，然后通过进入菜单栏、选择"图像"、后跟"颜色"和"拆分通道"来拆分漂白校正文件的通道。通过按打开脚本中的图标"运行"，在所选延时影片的活动单元膜通道上运行上传脚本。为了获得漂亮的单元格蒙版，请将高斯模糊设置为 2.500，将单元格检测灵敏度设置为负 1，然后单击"确定"。然后，为使用 63 倍目标获得的延时影片设置 10 到 20 之间的估计噪声容差，然后单击"确定"。生成的单元格蒙版将显示在分析的延时影片中，出现名为 ParticleStack 的新窗口，同时出现一个名为"需要操作"的小窗口。从延时影片上的单元格蒙版中，只关注中心中的单元格，并选择那些能够在整个延时影片中提供完整且定义良好的轮廓的单元格。当中心中的选定单元格与真实细胞膜很好地对应时，请将 ParticleStack 保存为 TIFF 文件。在斐济打开相应的粒子堆栈 TIFF 文件。在斐济安装了 Surface Manager 插件，打开该插件。在 Surface Manager 中，单击"读取大纲"图像按钮，将 Jaccard 索引设置为 60% 加载大纲可能需要几分钟时间，具体取决于单元格数。加载后，每个单元格将被分配一个 S 编号，并显示在 Surface Manager 窗口的左侧。单击选定的 S 编号，以便从 ParticleStack1 导入的单元格轮廓。蒂夫出现在延时电影中。检查整个影片的每个导入的 S 编号的单元格轮廓质量，并删除显示不正确的单元格轮廓的不需要的单元格。要删除不需要的单元格，请突出显示单元格轮廓，然后单击"删除"按钮。使用"画笔"工具校正单元格轮廓。完成后，将更正后的单元格另存为 RoiSet。zip 文件。要确定阿波米奥辛脉冲是否存在于分析组织中，并了解详细行为，以及阿波米奥辛信号的方向性，首先打开斐济。打开延时影片，加载保存的 ParticleStack1。tiff 单元格掩码和漂白校正的延时影片，然后从 RoiSet 加载 Surface Manager 插件和相应的感兴趣区域。zip 文件。接下来，在 Surface Manager 中，激活具有感兴趣信号的通道。单击"统计"按钮可获取名为"按切片显示的平均灰色值切片"的窗口。随着时间的推移，以任意单位以及与细胞的面积和形状相关的其他参数显示的公理和中值强度。通过进入"统计信息"窗口、单击"文件"并选择"另存为.类似"、生成单元格掩码并加载到 Surface Manager 中以分析组织规模上的公理脉冲来将值保存为电子表格文件。该协议的这一部分允许用户有选择地在弯曲的上皮组织中选择性地提取一层薄薄的幕于一切。这些步骤是用户友好的，基于直观的图形界面。打开斐济，并确保安装椭圆形表面投影插件。然后，打开延时影片，然后通过单击插件、访问 BigDataViewer 并选择导出当前图像作为 XML/HDF5 文件来将它导出为 XML/HDF5 文件。接下来，通过进入插件、单击 BigDataViewer、然后是椭圆体曲面投影并选择 XML 文件，打开 Ellipsoid 曲面投影中导出的文件。这将打开一个新窗口，显示蛋室的下垂视图，并会出现一个对话框，以指导用户完成处理。对话框窗口称为"卵巢投影"，具有多个选项卡。在第一个对话框选项卡（称为边界框）中，定义延时影片中蛋室的 x 和 y 边框以及边界框的 z 宽度，然后按 set。蛋室的选定部分以粉红色突出显示。接下来，在"Ovaries 投影"窗口中称为"查找 Blob"的对话框选项卡中定义信号 Blob 的大小。定义西格玛和最小峰值。然后，按计算以识别将显示为绿色斑点的 Actomyosin 信号。用不同的参数重试此步骤，直到找到大约 100 个点。识别行为yosin信号是关键步骤。这取决于信号质量和检测到的 Blob 的正确大小。如果图像中没有可见的绿色点，则下一步将不起作用。要设计椭圆体，请继续使用称为"拟合椭圆体"的选项卡。将随机样本设置为 10，000，将外部/内部截止距离设置为 1 到 10，然后单击计算。在此之后，称为投影的选项卡将自动打开并允许定义曲面提取。在投影选项卡中，将最小和最大投影距离设置为所需椭圆的宽度。最小和最大的投影距离必须适合，以便粉红色定义的椭圆形区域包括蛋室的整个外部层。然后，将切片距离定义为 1。在按下计算之前，请确保在蛋室上定义椭圆的粉红色区域是可见的。它有助于评估新的椭圆形拟合的质量。接下来，将椭圆的输出宽度设置为大于或等于 800，将高度设置为大于或等于 400。然后，设置曲面提取的持续时间，然后选择球形投影或圆柱投影。如果需要，翻转 Z 并对齐 Y.Press 计算，以获取称为图像的新窗口中两个通道的表面提取。调整获得的图像窗口的亮度和对比度，通过单击图像、进行"调整"和选择亮度/对比度来查看投影的幕度信号。如果曲面提取看起来不错，请将两个通道单独保存为 TIFF 文件。此外，保存日志窗口文件，供将来参考如何提取此特定蛋室的表面。然后，将通道与斐济中的首选颜色代码合并，并将结果另存为 TIFF 文件。该协议使科学家能够研究上皮组织中法霉素网络的行为。只有当对局部细胞尺度上的行为进行详细分析与组织尺度上的类似分析相结合时，才可能实现这一点。此处显示的动态 myosin II 行为在本地细胞规模和在控制组织和脂肪 2 突变果蝇卵室的组织量表的代表示例。在基底单平面上，明辛II信号的绿色改性调节光链垂直于控制蛋室的前部后轴。这种极性在脂肪2突变蛋室中丢失，并导致各向异性骨髓II脉冲，在组织水平上振荡，控制样品中米奥辛II的绿色修饰调节光链产生促进上皮旋转所需的同步力。相比之下，fat2突变蛋室的卵泡上皮在基底侧脉冲强烈，不能产生促进上皮旋转所需的同步力。在果蝇卵室的薄层区域，fat2突变体还呈现了霉素II的绿色改性调节光链的动态行为变化。 在观看此视频后，您应该有一个好主意，如何使用斐济的果蝇蛋室在局部和组织尺度上分析果蝇蛋白网络。有关进一步的实际提示和故障排除，请参阅协议后的讨论部分。如果您对斐济或我们的插件有任何疑问，请参阅相应的网页或联系我们。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

直立成像<em&gt;果蝇</em&gt;蛋钱伯斯

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科研

发育生物学

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Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

在成像钙<em&gt;果蝇</em&gt;在蛋激活

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

一个<em&gt;离体</em&gt;方法培养大鼠肠系膜微血管网络的时间推移成像

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

血管血管和血管生成的动力学分析体外

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

在体内果蝇蛹肌肌腱形态的影像学研究

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

普帕尔阶段发育性皮瘤中组织定向和生长动力学的成像与分析

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

使用亲脂荧光染料的果蝇胚胎运动神经元的逆行追踪

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...