Name: analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers
Uploaded: 2019-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

Forfatterne er meget taknemmelige for Miriam Osterfield for at dele hendes råd om in vitro Life Imaging af ægge kamre ved hjælp af en tilgang, der er vedtaget fra Celeste Berg laboratorium4. Vi takker også Sebastian Tosi for Fiji scriptet, der muliggør celle segmentering.

Bemærk: Følgende protokol indeholder instruktioner om, hvordan man analyserer actomyosin på det lokale cellulære og vævs skalaen i Drosophila ægge kamre. Den lokale skala tilgang giver brugerne mulighed for at analysere detaljerede actomyosin adfærd i op til 15 celler pr æg kammer og kræver erhvervelse af tlms for en kort periode (5 – 10 min) ved hjælp af High-Speed Imaging og en omvendt confokale mikroskop. I modsætning hertil giver vævs skalaen brugerne actomyosin information i 5...

<ol>
	<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).</li><li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+oogenesis.">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68, 207-217 (2014).</li><li>Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Ovaries.">Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries.</a> Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).</li><li>Peters, N. C., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Culturing+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Egg+Chambers:+A+History+and+Adaptable+Method.">In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method.</a> Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).</li><li>Spradling, A. C., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Genetics+of+Oogenesis.">Developmental Genetics of Oogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. , 1-70 (1993).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331, 1071-1074 (2011).</li><li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila.">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development. 143, 1375-1387 (2016).</li><li>Pokrywka, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+GFP-labeled+proteins+in+Drosophila+oocytes.">Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50044 (2013).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bullwinkle+is+required+for+epithelial+morphogenesis+during+Drosophila+oogenesis.">bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).</li><li>Cetera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+rotation+promotes+the+global+alignment+of+contractile+actin+bundles+during+Drosophila+egg+chamber+elongation.">Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation.</a> Nature Communications. 5, 5511 (2014).</li><li>Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+rotation+is+preceded+by+planar+symmetry+breaking+of+actomyosin+and+protects+epithelial+tissue+from+cell+deformations.">Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations.</a> PLOS Genetics. 13, e1007107 (2017).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+polarized+actomyosin+contractile+flows+control+epithelial+junction+remodelling.">Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling.</a> Nature. 468, 1110-1114 (2010).</li><li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis.">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).</li><li>. Surface manager Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager">https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager</a> (2018)</li><li>. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins">https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins</a> (2018)</li><li>. BigDataViewer Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/BigDataViewer">https://imagej.net/BigDataViewer</a> (2017)</li><li>Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigDataViewer:+visualization+and+processing+for+large+image+data+sets.">BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets.</a> Nature Methods. 12, 481-483 (2015).</li><li>Turner, C. M., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons+in+the+morphogenesis+of+epidermal+hairs+during+wing+development+in+Drosophila.">Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila.</a> Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).</li><li>Heemskerk, I., Streichan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cartography:+compressing+bio-image+data+by+dimensional+reduction.">Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction.</a> Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).</li><li>Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+Breaking+in+an+Edgeless+Epithelium+by+Fat2-Regulated+Microtubule+Polarity.">Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity.</a> Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).</li><li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists.">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nature Methods. 12, 30-34 (2015).</li></ol>

Kritiske trin og fejlfinding for dissektion og dyrkning af ægkamre
Hvis alt for mange fluer er placeret i et lille hætteglas, kan flue maden blive mudret efter 2 – 3 dage på grund af omfattende mængder af fodring larver og voksne fluer at blive fanget i flue mad. I et sådant tilfælde, flip resten af disse fluer i et nyt hætteglas med frisk mad og downsize deres antal. Især udelukke kvinder, der sad fast i maden.
Schneider mix (SM) skal til...

Den stadige udvikling af nye billeddannelses-og softwareteknologier med anvendelser i biovidenskaben har givet en enorm indflydelse på forståelsen af livets grundlæggende principper. En af de største udfordringer er den pålidelige visualisering af udviklingsmæssige processer i kombination med deres levende billeddannelse i forskellige væv. Væv er dele af organer og organer, og som sådan er flertallet ikke let tilgængelige for billeddannelse. Derfor er protokoller, der tillader deres dissektion og in vitro-dyrkning blevet udviklet med henblik på at visualisere biologiske hændelser, der i tilstrækkelig grad afspejler in vivo-situationen i en levende krop.
I løbet af de seneste årtier, dyrkning og levende billeddannelse af Drosophila ægge kamre, acinar-lignende strukturer, der ligner primitive organer, har bidraget enormt til forståelsen af de grundlæggende principper for primitiv orgel udvikling1 , 2 , 3. i øjeblikket er der flere dyrkning protokoller til rådighed, og deres anvendelse afhænger af erhvervelse tid, celletype, der skal imaged, og deres tilgængelighed (f. eks indre kimcelle vs. ydre somatiske linje)4.
Et fælles træk i alle disse dyrkning protokoller er behovet for immobilisering af analyserede æg kamre, der viser en høj kontraktile aktivitet i flydende medier. Den kontraktile aktivitet af ægge kamre er forårsaget hovedsageligt af musklen ark, der dækker en lang række tilsluttede ægkamre5,6,7. For at opnå en korrekt immobilisering af unge ægkamre er der derfor udviklet forskellige tilgange, som omfatter ægkamre med dæksedler6,8,9 eller fleksible tæpper4, 10 eller indlejring dem i lav-smeltepunkt agopstået3,11. Disse tilgange er populære, da de også giver mulighed for billeddannelse af en større visuel plan på grund af den subtile fladning af den circumferentielle overflade af ægge kamre.
Men for nylig har det vist sig, at unge ægkamre (etape 1-8) roterer omkring deres forreste-posterior akse6 , og at denne vævs bevægelse drives af et fint actomyosin-netværk tæt på den omskiftelige overflade af disse unge ægkamre 12. derfor kan kunstig ændring af cellulær overflade forårsaget af en subtil udfladning af dette væv have en negativ indvirkning på adfærden af den kraft skabende actomyosin maskiner. Kontra pointet er, at hvis ægkammer vævet ikke er fladtrykt, bliver mikroskopisk billeddannelse af proteiner på ægkammerets circumferentielle overflade endnu mere begrænset af den nedsatte størrelse af anskaffelses planet.
Derfor har vi kombinerede protokoller fra Prasad et al.9 og laboratoriet i Celeste Berg4,10 og yderligere modificeret dem, så der ikke er nogen coverslip/fleksibel tæppe/agantet anvendes i den udviklede metode. Drosophila ægge kamre er frit kultiveret i medierne og protokollen præsenteres her gælder kun inverteret mikroskopi. Der er to dele af protokollen. Den første del er fokuseret på analysen af actomyosin signaler på den lokale cellulære skala (op til 15 celler) i ægge kamre. I den anden del, vi fokuserer på at overvinde de begrænsninger, der er forbundet med en lille erhvervelse fly forårsaget af den frie dyrkning af ægge kamre. I denne forbindelse har vi udviklet en roman Fiji-baseret Computational metode med en semi-interaktiv grafisk brugergrænseflade, der selektivt ekstrakter og udfolder definerede lag af en circumferentiel vævs overflade. Dette efterfølges af en protokol, der beskriver, hvordan man analyserer actomyosin på vævs skalaen (dvs. > 50 celler). Da den selektive ekstraktion af et afgrænset tyndt lag af buet epitelial væv ikke har været let mulig ved hjælp af en klassisk z-stak projektion (figur 1), er denne brugervenlige metode en vigtig forudsætning for en grundig forståelse af opførsel af en tynd (< 1 μm) actomyosin netværk på vævs skalaen i Drosophila ægge kamre.
Hertil kommer, at lette protokollen, vi giver eksempel time-lapse film (TLMs) og prøve filer af fluorescently Tagged nonmuscle konventionel myosin II adfærd (Se supplerende fil 3). Myosin II er et motor protein og repræsenterer den aktive kontraktile del af actomyosin-maskinerne. For at billedet myosin II, vi bruger Drosophila transgene linjer, der indeholder en modificeret lovgivningsmæssig lyskæde af myosin II kaldet mrlc:: gfp (Se tabel over materialer for detaljer)12,13. For at visualisere cellemembraner er protokollen baseret på kommercielle farvestoffer (Se tabel over materialer). Denne protokol er egnet ikke kun til analyse af små subcellulære mrlc:: gfp signaler12 men også for enhver lignende størrelse subcellulære partikler omkring ± 300 μM, såsom dem observeret med Life-Act:: gfp12,14.
Selv om begge disse protokoller er præsenteret ved hjælp in vitro kulturperler Drosophila æg kamre, erhvervelse af actomyosin signaler kan også udføres ved hjælp af andre væv på optimering af de dyrkning medier og afhængigt af tilgængeligheden af enten fluorescently mærkede proteiner med tilsvarende kommercielle farvestoffer eller, for eksempel, mRNA mikroinjektioner for at opnå transitorisk genekspression profiler. På samme måde kan den Fiji-baserede protokol til udvinding af et tyndt lag fra en circumferentiel overflade anvendes mere generelt til ellipsoide og orgel lignende væv.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schneider Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720-024</td>
			<td>[+]-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#160;[+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 &#181;g/ml Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;F135</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Solution Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033NS</td>
			<td>33 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td></td>
			<td>&#160;#55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Deep Red (cell membrane dye)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64 (cell membrane dye)</td>
			<td>ThermoFisher/Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression dissection slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-560B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steromicroscope</td>
			<td>e.g. Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi SV 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic glass/cover glass</td>
			<td>e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wironit needle holder</td>
			<td>Hammacher</td>
			<td>9160020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus spine</td>
			<td>Echinocactus grusonii/barrel cactus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila stocks used in the manuscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers

Drosophila umodne æg kaldes ægge kamre, og deres struktur ligner primitive organer, der gennemgår morfologiske ændringer fra en runde til en ellipsoide form under udvikling. Denne udviklingsmæssige proces kaldes oogenesen og er afgørende for at generere funktionelle modne æg til at sikre den næste flue generation. Af disse grunde har ægkamre tjent som en ideel og relevant model til at forstå dyrs orgel udvikling.
Flere in vitro-dyrknings protokoller er blevet udviklet, men der er flere ulemper ved disse protokoller. Den ene indebærer anvendelse af forskellige dækker, der udøver et kunstigt pres på de afbildet æg kamre for at imurre dem og at øge den afbildet erhvervelse flyet af den circumferentielle overflade af de analyserede æg kamre. En sådan fremgangsmåde kan have en negativ indflydelse på adfærden af de tynde actomyosin maskiner, der genererer kraften til at rotere ægkamre omkring deres længere akse.
Således, at overvinde denne begrænsning, vi kultur Drosophila æg kamre frit i medierne for at pålideligt analysere actomyosin maskiner langs omkredsen af ægge kamre. I den første del af protokollen, giver vi en manual beskriver, hvordan man analyserer actomyosin maskiner i en begrænset erhvervelse flyet på den lokale cellulære skala (op til 15 celler). I den anden del af protokollen, giver vi brugerne en ny Fiji-baseret plugin, der giver mulighed for simpel udvinding af et defineret tyndt lag af ægget kamre ' circumferential overflade. Følgende protokol beskriver derefter, hvordan actomyosin-signaler analyseres i vævs skalaen (> 50 celler). Endelig, vi udpege begrænsningerne af disse tilgange på både den lokale cellulære og vævs skalaer og diskutere dens potentielle fremtidige udvikling og mulige applikationer.

Denne protokol giver forskerne mulighed for at undersøge adfærden af actomyosin netværk i epitelial væv. Dette er kun muligt, når en detaljeret analyse af actomyosin adfærd på den lokale cellulære skala (et par celler) kombineres med en lignende analyse på vævs skalaen (mange celler). Men, epitel væv er ofte buede og udvinding af et tyndt lag af disse væv var tidligere ikke let muligt, som vist i Drosophila ægge kamre (figur 1). Protokol...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Denne protokol giver en Fiji-baseret, brugervenlig metode sammen med ligetil instruktioner, der forklarer, hvordan man pålideligt analysere actomyosin adfærd i individuelle celler og buede epiteliale væv. Ingen programmering færdigheder er forpligtet til at følge tutorial; alle trin udføres på en semi-interaktiv måde ved hjælp af den grafiske brugergrænseflade af Fiji og tilhørende plugins.

Analyse af Actomyosin dynamik på lokale cellulære og vævs skalaer ved hjælp af time-lapse film af dyrkede Drosophila ægge kamre

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Vores protokol hjælper forskere til at analysere subcellulære actomyosin netværk i de enkelte epitelceller og giver dem også mulighed for at udføre lignende analyse på multicellulær skala i buede epitelvæv. Vores protokol er et godt eksempel på en Fiji ansøgning. Det har en intuitiv grafisk brugergrænseflade, og det kræver ikke nogen viden om scripting.Derfor er det meget velegnet også til nybegyndere i marken. Selv om vores metode blev udviklet til Drosophila æg kamre, det gælder også uden Drosophila epithelia. Vi opfordrer forskere til at teste vores protokol i deres modelsystemer.Brug de ledsagede testfiler til at blive fortrolig med denne protokol. Det vil hjælpe dig med at beslutte, hvilken del af denne protokol der er egnet til dit individuelle forskningsspørgsmål. Denne del af protokollen giver brugerne mulighed for at segmentere epitelceller i time-lapse-film og efterfølgende analysere actomyosinimpulser i individuelle celler over tid ved hjælp af Surface Manager.Til at begynde, åbne Fiji og importere makroen TissueCellSegmentMovie. som beskrevet i den medfølgende tekstprotokol. Åbn derefter en blegemiddelkorrigeret TIFF-fil, og opdel kanalerne i den blegemiddelkorrigerede fil ved at gå til menulinjen, vælge Billede efterfulgt af Farve og vælge Split Channels.Kør det overførte script på den aktive cellemembrankanal i den valgte time-lapse-film ved at trykke på ikonet Kør i det åbne script. For at få en flot cellemaske skal du indstille gaussisk sløring til 2.500 og celledetektionsfølsomhed til minus en, og klik på OK. Derefter skal du indstille den anslåede støjtolerance mellem 10 og 20 for time-lapse-film, der er anskaffet med 63x-målet, og klik på OK. Der vises en genereret cellemaske i den analyserede time-lapse-film, et nyt vindue med titlen ParticleStack vises, og der vises også et lille vindue med titlen Handling, der kaldes Handling påkrævet. Fra cellemasken på time-lapse-filmen skal du kun fokusere på celler i midten og vælge dem, der kan give komplette og veldefinerede konturer i hele time-lapse-filmen.Når de markerede celler i midten svarer pænt til de rigtige cellemembraner, skal du gemme ParticleStack som en TIFF-fil. Åbn den tilsvarende ParticleStack TIFF-fil i Fiji. Når Surface Manager-plugin'et er installeret i Fiji, skal du åbne plugin'et.Klik på knappen Læs dispositionsbillede i Surface Manager, og angiv Jaccard-indekset til 60 %Indlæsning af konturerne kan tage flere minutter afhængigt af antallet af celler. Når hver celle er indlæst, tildeles den et S-nummer og vises i venstre del af Surface Manager-vinduet. Klik på det valgte S-nummer, så den importerede cellekontur fra ParticleStack1.tiff vises på time-lapse-filmen. Kontroller hvert importeret S-nummer for celledispositionskvalitet i hele filmen, og fjern uønskede celler, der viser forkerte cellekonturer. Hvis du vil fjerne en uønsket celle, skal du markere cellekonturen og klikke på knappen Slet.Brug penselværktøjet til at korrigere cellekonturer. Når du er færdig, skal du gemme de korrigerede celler som et RoiSet. zip-fil.At identificere, om actomyosin pulser er til stede i det analyserede væv og til at forstå den detaljerede adfærd, samt directionalitet af actomyosin signaler, begynde med at åbne Fiji. Åbn en time-lapse film, indlæse de gemte ParticleStack1. tiff-cellemaske og den blegemiddelkorrigerede time-lapse-film, og indlæs derefter Surface Manager-plugin'et og det tilsvarende interesseområde fra RoiSet.zip-fil. Derefter skal du aktivere en kanal med interessesignaler i Surface Manager. Klik på knappen Statistik for at hente vinduet Med den gennemsnitlige grå værdi Udsnit efter udsnit.Middelintensiteten og medianintensiteten af actomyosinsignalerne vises over tid i vilkårlige enheder samt andre parametre relateret til cellens område og form. Gem værdierne som en regnearksfil ved at gå til vinduet Statistik, klikke på Filer og vælge Gem som.lignende, oprette en cellemaske og indlæse den i Surface Manager for at analysere actomyosinimpulser på vævsskalaen. Denne del af protokollen giver brugerne mulighed for selektivt at udtrække et tyndt lag af actomyosin i det buede epitelvæv over tid.Disse trin er brugervenlige og baseret på en intuitiv grafisk brugerflade. Åbn Fiji, og sørg for, at Ellipsoid Surface Projection plugin er installeret. Åbn derefter en time-lapse-film, og eksportér den som en XML/HDF5-fil ved at klikke på Plugins, gå til BigDataViewer og vælge Export Current Image as XML/HDF5-fil.Åbn derefter den eksporterede fil i Ellipsoid Surface Projection ved at gå til Plugins, klikke på BigDataViewer efterfulgt af Ellipsoid Surface Projection og vælge XML-fil. Dette vil åbne et nyt vindue med sagittal visninger af æggekammeret, og en dialog til at guide brugeren gennem forarbejdning vises. Dialogvinduet, kaldet Æggestokkene Projection, har flere faner.I den første dialogfane, kaldet afgrænsningsboks, skal du definere x- og y-kanterne for et ægkammer i time-lapse-filmen sammen med z-bredden på afgrænsningsboksen, og tryk på sæt. De udvalgte dele af æggekammeret er fremhævet med pink. Derefter skal du definere størrelsen på signalblytter i dialogfanen kaldet finde klatter i vinduet Ovarieprojektion.Definer sigma og den minimale spidsværdi. Tryk derefter på beregne for at identificere actomyosin-signalerne, der vises som grønne klatter. Prøv dette trin igen med forskellige parametre, indtil der findes omkring 100 pladser.Identifikation af actomyosin signaler er et afgørende skridt. Det afhænger af signalkvaliteten og den korrekte størrelse af de registrerede klatter. Hvis der ikke er synlige grønne pletter i billedet, vil det næste trin ikke fungere.For at designe ellipseformet, fortsætte med fanen kaldet fit ellipsoid. Indstil tilfældige stikprøver til 10.000, den udvendige/indvendige afskæringsafstand til en til 10, og klik derefter på beregn. Derefter åbnes fanen kaldet projektion automatisk og giver mulighed for definition af overfladeudsugning.Under projektionsfanen skal du oprette en minimums- og maksimumprojektionsafstand som bredden på den ønskede ellipseform. Den minimale og maksimale projektionsafstand skal passe, så det lyserøde definerede ellipseformede område omfatter hele æggekammerets udvendige lag. Definer derefter udsnitsafstanden som én.Sørg for, at den lyserøde region af ellipseformet med den definerede med på æggekammeret er synlig, før du trykker på beregning. Det hjælper til at vurdere kvaliteten af en ny ellipseformet pasform. Derefter skal du indstille en udgangsbredde på ellipseformen til større end eller lig med 800 og en højde, der er større end eller lig med 400.Derefter indstille varigheden af overfladen ekstraktion, og vælg enten en sfærisk eller en cylindrisk projektion. Hvis det er nødvendigt, skal du spejlvende Z og justere Y.Press-beregning for at opnå en overfladeudtrækning for begge kanaler i nye vinduer kaldet billede. Juster lysstyrken og kontrasten i de opnåede billedvinduer for at kunne se de projicerede actomyosin-signaler ved at klikke på Billede, justere og vælge Lysstyrke/kontrast.Hvis overfladeudsugningen ser godt ud, skal du gemme begge kanaler separat som TIFF-filer. Derudover skal du gemme logvinduesfilen til senere brug af, hvordan overfladen af dette ægkammer blev ekstraheret. Derefter flette kanalerne med en foretrukken farvekode i Fiji, og gemme resultaterne som TIFF-filer.Denne protokol gør det muligt for forskere at undersøge adfærd actomyosin netværk i epitelvæv. Dette er kun muligt, når en detaljeret analyse af actomyosin adfærd på den lokale cellulære skala er kombineret med en lignende analyse på vævsskalaen. Vist her er repræsentative eksempler på dynamisk myosin II adfærd på den lokale cellulære skala og på væv skala for kontrol og fat2 mutant Drosophila æg kamre.På det basale enkelt plan bevæger den grønne modificerede regulerende lyskæde af myosin II-signaler vinkelret på den forreste bageste akse af kontrolægkamre. Denne polaritet går tabt i fat2 mutant æg kamre og fører til anisotropiske myosin II pulser, svingninger På vævsniveau, den grønne modificerede regulerende lyskæde af myosin II i kontrolprøven genererer synkroniseret kraft, der kræves for at fremme epitelrotation. I modsætning hertil follikel epitel af en fat2 mutant æg kammer puls kraftigt på basal side og undlader at generere den synkroniserede kraft, der kræves for at fremme epitelrotation.I en tynd apikale region i Drosophila æg kammer, fat2 mutant præsenterer også med ændret dynamisk adfærd af den grønne modificerede regulerende lyskæde af myosin II.After at have set denne video, bør du have en god idé om, hvordan man analyserer en actomyosin netværk på lokalt og væv skala i Drosophila æg kamre ved hjælp af Fiji. Yderligere praktiske tip og fejlfinding finder du i diskussionsdelen efter protokollen. Hvis du har spørgsmål relateret til Fiji eller vores plugins, se de respektive websider eller kontakt os.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging af<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Optagelse Tissue Repair i zebrafisk Larver med Time-lapse Lysfelt stereomikroskopi

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyserer<em&gt; In vivo</em&gt; Cell Migration hjælp Cell transplantationer og Time-lapse Imaging i zebrafisk embryoner

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse af zebrafisk Kidney Udvikling med Time-lapse Imaging Ved hjælp af en dissektionsmikroskop Udstyret til Optical Sektionsinddeling

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium i<em&gt; Drosophila</em&gt; På Egg Aktivering

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metode til Time-Lapse Imaging af dyrkede Rat Mesenteriske Mikrovaskulære Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetic analyse af Vasculogenesis kvantificerer dynamikken i Vasculogenesis og angiogenese In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Billeddannelse af muskel-sene morfogenese i Drosophila pupper

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Billeddannelse og analyse af vævsorientering og vækstdynamik i udvikling af Drosophila Epithelia under pupalfaser

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Retrograde sporing af Drosophila embryonale motoriske neuroner ved hjælp af lipofile fluorescerende farvestoffer

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...