Name: analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers
Uploaded: 2019-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

De auteurs zijn Miriam Osterfield zeer erkentelijk voor het delen van haar advies over de in vitro Life beeldvorming van eier kamers met behulp van een aanpak die is overgenomen uit het Celeste berg Laboratory4. We danken ook Sebastian Tosi voor het Fiji-script dat celsegmentatie mogelijk maakt.

Opmerking: Het volgende protocol bevat instructies voor het analyseren van actomyosine op de lokale cellulaire en de weefsel schaal in Drosophila Eier kamers. De lokale aanpak stelt gebruikers in staat om gedetailleerd actomyosine gedrag te analyseren in maximaal 15 cellen per Eier kamer en vereist de overname van TLMs voor een korte periode (5 – 10 min) met behulp van high-speed imaging en een omgekeerde confocale Microscoop. Daarentegen, de weefsel schaal biedt gebruikers actomyosine informa...

<ol>
	<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).</li><li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+oogenesis.">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68, 207-217 (2014).</li><li>Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Ovaries.">Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries.</a> Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).</li><li>Peters, N. C., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Culturing+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Egg+Chambers:+A+History+and+Adaptable+Method.">In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method.</a> Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).</li><li>Spradling, A. C., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Genetics+of+Oogenesis.">Developmental Genetics of Oogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. , 1-70 (1993).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331, 1071-1074 (2011).</li><li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila.">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development. 143, 1375-1387 (2016).</li><li>Pokrywka, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+GFP-labeled+proteins+in+Drosophila+oocytes.">Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50044 (2013).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bullwinkle+is+required+for+epithelial+morphogenesis+during+Drosophila+oogenesis.">bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).</li><li>Cetera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+rotation+promotes+the+global+alignment+of+contractile+actin+bundles+during+Drosophila+egg+chamber+elongation.">Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation.</a> Nature Communications. 5, 5511 (2014).</li><li>Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+rotation+is+preceded+by+planar+symmetry+breaking+of+actomyosin+and+protects+epithelial+tissue+from+cell+deformations.">Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations.</a> PLOS Genetics. 13, e1007107 (2017).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+polarized+actomyosin+contractile+flows+control+epithelial+junction+remodelling.">Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling.</a> Nature. 468, 1110-1114 (2010).</li><li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis.">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).</li><li>. Surface manager Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager">https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager</a> (2018)</li><li>. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins">https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins</a> (2018)</li><li>. BigDataViewer Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/BigDataViewer">https://imagej.net/BigDataViewer</a> (2017)</li><li>Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigDataViewer:+visualization+and+processing+for+large+image+data+sets.">BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets.</a> Nature Methods. 12, 481-483 (2015).</li><li>Turner, C. M., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons+in+the+morphogenesis+of+epidermal+hairs+during+wing+development+in+Drosophila.">Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila.</a> Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).</li><li>Heemskerk, I., Streichan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cartography:+compressing+bio-image+data+by+dimensional+reduction.">Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction.</a> Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).</li><li>Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+Breaking+in+an+Edgeless+Epithelium+by+Fat2-Regulated+Microtubule+Polarity.">Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity.</a> Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).</li><li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists.">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nature Methods. 12, 30-34 (2015).</li></ol>

Kritieke stappen en probleemoplossing voor de dissectie en het kweken van eier kamers
Als er te veel vliegen in een kleine injectieflacon worden geplaatst, kan het vlieg voedsel modderig worden na 2 – 3 dagen als gevolg van grote hoeveelheden voeden larven en volwassen vliegen gevangen in het vlieg voedsel. In een dergelijk geval, Flip de rest van deze vliegt in een nieuwe flacon met vers voedsel en krimpen hun aantal. In het bijzonder, uitsluiten vrouwtjes die vastzaten in ...

De voortdurende ontwikkeling van nieuwe beeldvormings-en software technologieën met toepassingen in de biowetenschappen heeft een enorme impact op het begrijpen van de basisprincipes van het leven gegeven. Een van de grootste uitdagingen is de betrouwbare visualisatie van ontwikkelingsprocessen in combinatie met hun Live beeldvorming in verschillende weefsels. Weefsels zijn delen van organen en lichamen en als zodanig zijn de meeste niet gemakkelijk toegankelijk voorbeeld vorming. Daarom zijn protocollen die hun dissectie en in-vitro kweek mogelijk maken, ontwikkeld om biologische gebeurtenissen te visualiseren die de in vivo situatie in een levend lichaam voldoende weerspiegelen.
In de afgelopen decennia heeft de kweek en live beeldvorming van Drosophila Eier kamers, acinar achtige structuren die lijken op primitieve organen, enorm bijgedragen aan het begrijpen van de basisprincipes van primitieve orgaan ontwikkeling1 , 2 , 3. op dit moment zijn er verschillende kweek protocollen beschikbaar, en het gebruik ervan is afhankelijk van de acquisitie tijd, het celtype dat moet worden afgebeeld en hun toegankelijkheid (bijv. binnenste kiembaan versus buitenste somatische lijn)4.
Een gemeenschappelijk kenmerk in al deze kweek protocollen is de noodzaak voor de immobilisatie van geanalyseerde Eier kamers die een hoge contractiele activiteit in vloeibare media weergeven. De contractiele activiteit van de Eier kamers wordt voornamelijk veroorzaakt door het spier blad dat een lange reeks verbonden Eier kamers5,6,7bedekt. Om een goede immobilisatie van jonge Eier kamers te bewerkstelligen, zijn er daarom verschillende benaderingen ontwikkeld, waarbij de Eier kamers met dekstroken6,8,9 of flexibele dekens4worden bedekt, 10 of inbedden in een laag smeltpunt, agarose3,11. Deze benaderingen zijn populair omdat ze ook de beeldvorming van een groter visueel vlak mogelijk maken door de subtiele afvlakking van het omtrek oppervlak van de Eier kamers.
Onlangs is echter aangetoond dat jonge Eier kamers (fase 1-8) rond hun anterieure-posterieure as6 draaien en dat deze weefsel beweging wordt aangedreven door een fijn actomyosine-netwerk dicht bij het omtrek oppervlak van deze jonge Eier kamers 12. Daarom kan kunstmatige verandering van het cellulaire oppervlak veroorzaakt door een subtiele afvlakking van dit weefsel een negatieve invloed hebben op het gedrag van de kracht-genererende actomyosine machines. Het contrapunt is dat als het weefsel van de Eier kamer niet afgevlakt is, microscopische beeldvorming van eiwitten op het omtrek oppervlak van de Eier kamers nog beperkter wordt door de verminderde omvang van het acquisitie vlak.
Daarom hebben we protocollen van Prasad et al.9 en het lab van Celeste berg4,10 gecombineerd en verder aangepast zodat er geen afdekraam/flexibele deken/agarose wordt gebruikt in de ontwikkelde methode. Drosophila Eier kamers zijn vrij gekweekt in media en het protocol hier gepresenteerd geldt alleen omgekeerde microscopie. Het protocol bestaat uit twee delen. Het eerste deel is gericht op de analyse van actomyosine signalen op de lokale cellulaire schaal (tot 15 cellen) binnen de Eier kamers. In het tweede deel richten we ons op het overwinnen van de beperkingen in verband met een klein acquisitie vliegtuig veroorzaakt door het gratis kweken van eier kamers. In dit verband hebben we een nieuwe, op Fiji gebaseerde computationele methode ontwikkeld met een semi-interactieve grafische gebruikersinterface die selectief gedefinieerde lagen van een omtrek weefseloppervlak extraheert en ontvouwt. Dit wordt gevolgd door een protocol dat beschrijft hoe te analyseren actomyosine op de weefsel schaal (dat wil zeggen, > 50 cellen). Aangezien de selectieve extractie van een gedefinieerde dunne laag gebogen epitheelweefsel niet gemakkelijk mogelijk was met behulp van een klassieke z-stack projectie (Figuur 1), dient deze gebruiksvriendelijke methode als een belangrijke voorwaarde om de gedrag van een dun (< 1 μm) actomyosine-netwerk op de weefsel schaal in Drosophila Eier kamers.
Om het protocol te faciliteren, bieden we ook voorbeeld time-lapse movies (Tlm's) en voorbeeldbestanden van fluorescently gelabeld nonmuscle conventioneel myosin II-gedrag (Zie aanvullend bestand 3). Myosin II is een motor proteïne en vertegenwoordigt het actieve contractisch deel van de actomyosine machines. Om myosin II te kunnen afbeelden, gebruiken we Drosophila transgene lijnen die een gemodificeerde regelgevende licht keten van myosin II bevatten, genaamd mrlc:: GFP (Zie tabel met materialen voor details)12,13. Om celmembranen te visualiseren, is het protocol gebaseerd op commerciële kleurstoffen (Zie tabel met materialen). Dit protocol is niet alleen geschikt voor de analyse van kleine subcellulaire mrlc:: GFP signalen12 maar ook voor elke vergelijkbare grootte subcellulaire deeltjes rond ± 300 μM, zoals die waargenomen met Life-Act:: GFP12,14.
Hoewel beide protocollen worden gepresenteerd met behulp van in vitro gekweekte Drosophila Eier kamers, de overname van actomyosine signalen kan ook worden uitgevoerd met behulp van andere weefsels op de optimalisatie van de kweekmedia en afhankelijk van de beschikbaarheid van ofwel fluorescently gelabelde eiwitten met overeenkomstige commerciële kleurstoffen of, bijvoorbeeld, mRNA-micro injecties om voorbijgaande genexpressie profielen te verkrijgen. Evenzo kan het op Fiji gebaseerde protocol voor de extractie van een dunne laag van een omtrek oppervlak meer in het algemeen worden toegepast op ellipsoïde en orgel achtige weefsels.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schneider Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720-024</td>
			<td>[+]-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#160;[+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 &#181;g/ml Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;F135</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Solution Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033NS</td>
			<td>33 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td></td>
			<td>&#160;#55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Deep Red (cell membrane dye)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64 (cell membrane dye)</td>
			<td>ThermoFisher/Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression dissection slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-560B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steromicroscope</td>
			<td>e.g. Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi SV 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic glass/cover glass</td>
			<td>e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wironit needle holder</td>
			<td>Hammacher</td>
			<td>9160020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus spine</td>
			<td>Echinocactus grusonii/barrel cactus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila stocks used in the manuscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers

Drosophila onrijpe eieren heten Eier kamers, en hun structuur lijkt op primitieve organen die morfologische veranderingen ondergaan van een ronde tot een ellipsoïde vorm tijdens de ontwikkeling. Dit ontwikkelingsproces wordt oögenese genoemd en is cruciaal voor het genereren van functionele volwassen eieren om de volgende vlieggeneratie te beveiligen. Om deze redenen hebben Eier kamers gediend als een ideaal en relevant model om de ontwikkeling van dierlijke organen te begrijpen.
Verschillende in vitro kweek protocollen zijn ontwikkeld, maar er zijn verschillende nadelen aan deze protocollen. De ene omvat de toepassing van verschillende covers die een kunstmatige druk uitoefenen op de afbeelding gemaakt Eier kamers om ze te immobiliseren en om het beeldoppervlak van de omtrek van de geanalyseerde Eier kamers te vergroten. Een dergelijke benadering kan een negatieve invloed hebben op het gedrag van de dunne actomyosine-machine die de kracht genereert om Eier kamers rond hun langere as te draaien.
Dus om deze beperking te overwinnen, cultuur we Drosophila Eier kamers vrij in de media om betrouwbaar actomyosine machines te analyseren langs de omtrek van de Eier kamers. In het eerste deel van het Protocol, bieden we een handmatige Details over het analyseren van de actomyosine machines in een beperkte acquisitie vliegtuig op de lokale cellulaire schaal (maximaal 15 cellen). In het tweede deel van het Protocol bieden we gebruikers een nieuwe plug-in op basis van Fiji waarmee de eenvoudige extractie van een gedefinieerde dunne laag van het omtrek oppervlak van de Eier kamers mogelijk is. Het volgende protocol beschrijft vervolgens hoe te analyseren actomyosine signalen op de weefsel schaal (> 50 cellen). Tot slot, we lokaliseren de beperkingen van deze benaderingen op zowel de lokale cellulaire en weefsel schalen en bespreken van de mogelijke toekomstige ontwikkeling en mogelijke toepassingen.

Dit protocol stelt wetenschappers in staat om het gedrag van actomyosine netwerken in epitheliale weefsels te onderzoeken. Dit is alleen mogelijk wanneer een gedetailleerde analyse van actomyosine gedrag op de lokale cellulaire schaal (een paar cellen) wordt gecombineerd met een soortgelijke analyse op de weefsel schaal (veel cellen). Epitheliale weefsels zijn echter vaak gebogen en de extractie van een dun laagje van deze weefsels was voorheen niet gemakkelijk mogelijk, zoals weergegeven...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Dit protocol biedt een op Fiji gebaseerde, gebruiksvriendelijke methodologie, samen met eenvoudige instructies waarin wordt uitgelegd hoe u het gedrag van actomyosine in afzonderlijke cellen en gebogen epitheel weefsels betrouwbaar analyseren. Er zijn geen programmeervaardigheden vereist om de tutorial te volgen; alle stappen worden uitgevoerd op een semi-interactieve manier met behulp van de grafische gebruikersinterface van Fiji en bijbehorende plugins.

Analyse van Actomyosin dynamiek op lokale cellulaire en weefsel schalen met behulp van timelapse-films van gekweekte Drosophila Eier kamers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Ons protocol helpt wetenschappers om subcellulaire actomyosine netwerk in individuele epitheelcellen te analyseren en hen ook in staat stelt om soortgelijke analyse uit te voeren op meercellige schaal in gebogen epitheelweefsels. Ons protocol is een mooi voorbeeld van een Fiji-toepassing. Het heeft een intuïtieve grafische gebruikersinterface, en het vereist geen kennis van scripting.Daarom is het zeer geschikt ook voor beginnende gebruikers in het veld. Hoewel onze methode is ontwikkeld voor Drosophila eierkamers, is het ook van toepassing buiten Drosophila epithelia. We moedigen wetenschappers aan om ons protocol te testen in hun modelsystemen.Gebruik de begeleide testbestanden om vertrouwd te raken met dit protocol. Het zal u helpen om te beslissen welk deel van dit protocol geschikt is voor uw individuele onderzoeksvraag. Dit deel van het protocol stelt gebruikers in staat om epitheelcellen te segmenteren in time-lapse films en vervolgens actomyosinepulsen in individuele cellen te analyseren met behulp van de Surface Manager.Open Fiji en importeer de macro TissueCellSegmentMovie. ijm zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Open vervolgens een tiff-bestand met bleekmiddel gecorrigeerd en splits de kanalen van het voor bleekmiddel gecorrigeerde bestand door naar de menubalk te gaan, Afbeelding te selecteren, gevolgd door Kleur en Gesplitste kanalen te selecteren.Voer het geüploade script uit op het actieve celmembraankanaal van de geselecteerde time-lapse-film door op het pictogram Uitvoeren in het geopende script te drukken. Om een mooi celmasker te krijgen, stelt u de Gaussische onscherpte in op 2.500 en de gevoeligheid voor celdetectie op min één en klikt u op OK. Stel vervolgens de geschatte ruistolerantie in tussen 10 en 20 voor time-lapse-films die zijn aangeschaft met de doelstelling 63x en klik op OK. Een gegenereerd celmasker verschijnt in de geanalyseerde time-lapse film, een nieuw venster genaamd ParticleStack verschijnt en een klein venster genaamd Actie vereist verschijnt ook. Richt u zich in het celmasker op de timelapse-film alleen op cellen in het midden en selecteer cellen die volledige en goed gedefinieerde contouren kunnen bieden in de time-lapse-film.Wanneer de geselecteerde cellen in het midden mooi overeenkomen met de echte celmembranen, sla Dan ParticleStack op als een TIFF-bestand. Open het overeenkomstige ParticleStack TIFF-bestand in Fiji. Open de plug-in met de Surface Manager-plug-in die in Fiji is geïnstalleerd.Klik in Surface Manager op de knop Afbeelding lezen en stel de Jaccard-index in op 60%Het laden van de contouren kan enkele minuten duren, afhankelijk van het aantal cellen. Zodra deze cel is geladen, krijgt ze een S-nummer toegewezen en wordt deze weergegeven in het linkerdeel van het Surface Manager-venster. Klik op het geselecteerde S-nummer, zodat de geïmporteerde celcontour van ParticleStack1.tiff verschijnt op de time-lapse film. Controleer elk geïmporteerd S-getal op celcontourkwaliteit in de film en verwijder ongewenste cellen die onjuiste celcontouren weergeven. Als u een ongewenste cel wilt verwijderen, markeert u de celomtrek en klikt u op de knop Verwijderen.Gebruik het gereedschap Penseel om celcontouren te corrigeren. Sla de gecorrigeerde cellen op als RoiSet als u klaar bent. zip-bestand.Om te bepalen of actomyosine pulsen aanwezig zijn in het geanalyseerde weefsel en om het gedetailleerde gedrag te begrijpen, evenals de directionaliteit van actomyosine signalen, beginnen met het openen van Fiji. Open een time-lapse film en laad de opgeslagen ParticleStack1. tiff-celmasker en de niet-gebleekgestuurde time-lapse-film en laad vervolgens de Surface Manager-plug-in en het bijbehorende interessegebied van de RoiSet.zip-bestand. Activeer vervolgens in Surface Manager een kanaal met signalen van interesse. Klik op de knop Statistieken om het venster met de naam Gemiddelde grijze waarde Slice by Slice te verkrijgen.De gemiddelde en mediane intensiteiten van de actomyosine signalen zullen worden weergegeven in de tijd in willekeurige eenheden, evenals andere parameters met betrekking tot het gebied en de vorm van de cel. Sla de waarden op als een spreadsheetbestand door naar het venster Statistieken te gaan, op Bestand te klikken en Opslaan als.Op dezelfde manier genereert u een celmasker en laadt u het in Surface Manager om actomyosinepulsen op de weefselschaal te analyseren. Dit deel van het protocol stelt gebruikers in staat om selectief een dunne laag actomyosine in het gebogen epitheelweefsel in de loop van de tijd te extraheren.Deze stappen zijn gebruiksvriendelijk en gebaseerd op een intuïtieve grafische interface. Open Fiji en zorg ervoor dat de Ellipsoid Surface Projection-plug-in is geïnstalleerd. Open vervolgens een time-lapse-film en exporteer deze als een XML/HDF5-bestand door op Plug-ins te klikken, naar BigDataViewer te gaan en Huidige afbeelding exporteren als XML/HDF5-bestand te selecteren.Open vervolgens het geëxporteerde bestand in Ellipsoid Surface Projection door naar Plug-ins te gaan, op BigDataViewer te klikken, gevolgd door Ellipsoid Surface Projection, en XML-bestand te selecteren. Hiermee wordt een nieuw venster geopend met sagittale weergaven van de eierkamer en verschijnt er een dialoogvenster om de gebruiker door verwerking te leiden. Het dialoogvenster, Ovariaprojectie genaamd, heeft verschillende tabbladen.Definieer in het eerste dialoogvenster, het selectiekader genoemd, de x- en y-randen van een eierkamer in de time-lapse-film samen met de z-breedte van het selectiekader en druk op de set. De geselecteerde delen van de eierkamer zijn roze gemarkeerd. Definieer vervolgens de grootte van signaalklodders op het dialoogvenster met de naam zoekklodders in het venster Projectie van eierstokken.Definieer de sigma en de minimale piekwaarde. Druk vervolgens op compute om de actomyosinesignalen te identificeren, die worden weergegeven als groene blobs. Probeer deze stap opnieuw met verschillende parameters totdat er ongeveer 100 plekken zijn gevonden.Het identificeren van de actomyosine signalen is een cruciale stap. Het hangt af van de signaalkwaliteit en de juiste grootte van de gedetecteerde blobs. Als er geen zichtbare groene vlekken in de afbeelding zijn, werkt de volgende stap niet.Ga verder met het tabblad fit ellipsoïde om de ellipsoïde te ontwerpen. Stel willekeurige monsters in op 10,000, de buiten/binnen cutoff-afstand op één tot 10 en klik vervolgens op berekenen. Hierna wordt het tabblad projectie automatisch geopend en wordt de definitie van de oppervlakteextractie mogelijk.Stel in het projectietabblad een minimale en maximale projectieafstand in als de breedte van de gewenste ellipsoïde. De minimale en maximale projectieafstand moet passen, zodat het roze gedefinieerde ellipsoïdegebied de gehele buitenlaag van de eierkamer omvat. Definieer vervolgens de segmentafstand als één.Zorg ervoor dat het roze gebied van de ellipsoïde met de gedefinieerde op de eierkamer zichtbaar is voordat u op compute drukt. Het helpt om de kwaliteit van een nieuwe ellipsoïde pasvorm te evalueren. Stel vervolgens een uitvoerbreedte van de ellipsoïde in op meer dan of gelijk aan 800 en een hoogte die groter is dan of gelijk is aan 400.Stel vervolgens de duur van de oppervlakte-extractie in en kies een bolvormige of een cilindrische projectie. Tik indien nodig Z om en lijn Y.Press compute uit om een oppervlakteextractie voor beide kanalen in nieuwe vensters met de naam image te verkrijgen. Pas de helderheid en het contrast van de verkregen afbeeldingsvensters aan om de geprojecteerde actomyosinesignalen te kunnen zien door op Image te klikken, naar Aanpassen te gaan en Helderheid/contrast te selecteren.Als de oppervlakteextractie er goed uitziet, slaat u beide kanalen afzonderlijk op als TIFF-bestanden. Bewaar bovendien het logboekvensterbestand voor toekomstige verwijzing naar de manier waarop het oppervlak van deze specifieke eierkamer is geëxtraheerd. Voeg vervolgens de kanalen samen met een voorkeurskleurcode in Fiji en sla de resultaten op als TIFF-bestanden.Dit protocol stelt wetenschappers in staat om het gedrag van actomyosinenetwerken in epitheliale weefsels te onderzoeken. Dit is alleen mogelijk wanneer een gedetailleerde analyse van actomyosine gedrag op lokale cellulaire schaal wordt gecombineerd met een vergelijkbare analyse op de weefselschaal. Hier worden representatieve voorbeelden gegeven van dynamisch myosine II-gedrag op lokale cellulaire schaal en op de weefselschaal voor controle en fat2 mutant Drosophila eierkamers.Op het basale enkel vlak beweegt de groene gemodificeerde regelgevende lichtketen van myosine II-signalen loodrecht op de voorste achterste as van controle-eikamers. Deze polariteit gaat verloren in fat2 mutant eikamers en leidt tot anisotropische myosine II pulsen, oscillaties Op weefselniveau genereert de groene gemodificeerde regulerende lichtketen van myosine II in het controlemonster de gesynchroniseerde kracht die nodig is om epitheliale rotatie te bevorderen. In tegenstelling, de follikel epitheel van een fat2 mutant ei kamer puls sterk aan de basale kant en niet aan de gesynchroniseerde kracht die nodig is om epitheliale rotatie te bevorderen genereren.In een dun apicale gebied van de Drosophila eikamer, de fat2 mutant presenteert ook met veranderd dynamisch gedrag van de groene gewijzigde regelgevende lichtketen van myosine II.After watching this video, moet u een goed idee van hoe een actomyosine netwerk te analyseren op lokale en weefselschaal in Drosophila eikamers met behulp van Fiji. Zie het discussiegedeelte na het protocol voor verdere praktische tips en probleemoplossing. Als u vragen heeft met betrekking tot Fiji of onze plug-ins, raadpleeg dan de betreffende webpagina's of neem contact met ons op.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Rechtop Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Vastleggen van Tissue Repair in zebravis Larven met Time-lapse Helderveld stereomicroscopie

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analyseren<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migratie behulp Cell Transplantaties en Time-lapse Imaging in zebravis embryo&#39;s

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse van de zebravis Kidney Development met Time-lapse Imaging Met behulp van een dissectie microscoop Uitgerust voor Optische-Sectie

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Beeldvorming Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bij Egg Activering

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Een<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Methode voor Time-lapse imaging van gekweekte Rat Mesenteriale microvasculaire Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetische analyse van vasculogenese kwantificeert dynamiek van Vasculogenese en angiogenese In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Beeldvorming van de spier-pees morfogenese in Drosophila poppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Beeldvorming en analyse van weefseloriëntatie en groeidynamiek in de ontwikkeling van Drosophila Epithelia tijdens pupale stadia

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Retrograde tracing van Drosophila embryonale motor neuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...