Name: analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers
Uploaded: 2019-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

Die Autoren sind Miriam Osterfield sehr dankbar, dass sie ihre Ratschläge zur In-vitro-Lebensbildgebung von Eierkammern nach einem Ansatz des Celeste Berg Labors4gegeben hat. Wir danken auch Sebastian Tosi für das Fidschi-Skript, das die Zellsegmentierung ermöglicht.

HINWEIS: Das folgende Protokoll enthält Anweisungen zur Analyse von Actomyosin an der lokalen Zellzelle und der Gewebeskala in Drosophila-Eikammern. Der ansatzauf lokaler Ebene ermöglicht es Benutzern, detailliertes Actomyosinverhalten in bis zu 15 Zellen pro Eikammer zu analysieren und erfordert die Erfassung von TLMs für einen kurzen Zeitraum (5–10 min) mithilfe von Hochgeschwindigkeits-Bildgebung und einem invertierten konfokalen Mikroskop. Im Gegensatz dazu liefert die Gewebeskala den A...

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	<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).</li><li>Hudson, A. 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BigDataViewer Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/BigDataViewer">https://imagej.net/BigDataViewer</a> (2017)</li><li>Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigDataViewer:+visualization+and+processing+for+large+image+data+sets.">BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets.</a> Nature Methods. 12, 481-483 (2015).</li><li>Turner, C. M., Adler, P. 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J., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+Breaking+in+an+Edgeless+Epithelium+by+Fat2-Regulated+Microtubule+Polarity.">Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity.</a> Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).</li><li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists.">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nature Methods. 12, 30-34 (2015).</li></ol>

Kritische Schritte und Fehlerbehebung bei der Zerlegung und Kultivierung von Eierkammern
Wenn zu viele Fliegen in eine kleine Durchstechflasche gelegt werden, kann das Fliegenfutter nach 2–3 Tagen schlammig werden, da große Mengen an Fütterungslarven und erwachsenen Fliegen im Fliegenfutter gefangen werden. In einem solchen Fall, kippen Sie den Rest dieser Fliegen in eine neue Durchstechflasche mit frischem Essen und verkleinern ihre Anzahl. Insbesondere schließen Sie Fra...

Die kontinuierliche Entwicklung neuartiger Bildgebungs- und Softwaretechnologien mit Anwendungen in den Biowissenschaften hat einen enormen Einfluss auf das Verständnis der Grundprinzipien des Lebens gehabt. Eine der größten Herausforderungen ist die zuverlässige Visualisierung von Entwicklungsprozessen in Kombination mit deren Live-Bildgebung in verschiedenen Geweben. Gewebe sind Teile von Organen und Körpern, und als solche sind die meisten für die Bildgebung nicht leicht zugänglich. Daher wurden Protokolle entwickelt, die ihre Zerlegung und In-vitro-Kultivierung erlauben, um biologische Ereignisse zu visualisieren, die die In-vivo-Situation innerhalb eines lebenden Körpers ausreichend widerspiegeln.
In den letzten Jahrzehnten hat die Kultivierung und Live-Bildgebung von Drosophila-Eikammern, acinarartigen Strukturen, die primitiven Organen ähneln, immens zum Verständnis der Grundprinzipien der primitiven Organentwicklung beigetragen1 , 2 , 3. Derzeit stehen mehrere Kultivierungsprotokolle zur Verfügung, deren Verwendung von der Erfassungszeit, dem zu bildendem Zelltyp und ihrer Zugänglichkeit (z. B. innere Keimbahn vs. äußere somatische Linie)abhängt 4.
Ein gemeinsames Merkmal in all diesen Kultivierungsprotokollen ist die Notwendigkeit der Immobilisierung analysierter Eierkammern, die eine hohe kontraktile Aktivität in flüssigen Medien aufweisen. Die kontraktile Aktivität der Eierkammern wird hauptsächlich durch das Muskelblatt verursacht, das eine lange Schnur von verbundenen Eierkammern5,6,7bedeckt. Daher wurden verschiedene Ansätze entwickelt, um eine ordnungsgemäße Immobilisierung junger Eierkammern zu erreichen, wobei Eikammern mit Abdeckungen6,8,9 oder flexible Decken4, 10 oder einbetten sie in Niedrigschmelzpunkt-Agarose3,11. Diese Ansätze sind beliebt, da sie aufgrund der subtilen Abflachung der Umfangsfläche der Eikammern auch die Bildgebung einer größeren visuellen Ebene ermöglichen.
In jüngster Zeit hat sich jedoch gezeigt, dass sich junge Eikammern (Stufe 1-8) um ihre vordere-hintere Achse6 drehen und dass diese Gewebebewegung von einem feinen Actomyosin-Netzwerk in der Nähe der Umfangsfläche dieser jungen Eikammern angetrieben wird. 12. Daher kann eine künstliche Veränderung der zellulären Oberfläche, die durch eine subtile Abflachung dieses Gewebes verursacht wird, einen negativen Einfluss auf das Verhalten der krafterzeugenden Actomyosin-Maschinerie haben. Der Kontrapunkt ist, dass, wenn das Eikammergewebe nicht abgeflacht wird, die mikroskopische Bildgebung von Proteinen an der Umfangsfläche von Eikammern durch die verminderte Größe der Erfassungsebene noch eingeschränkter wird.
Daher haben wir Protokolle von Prasad et al.9 und dem Labor von Celeste Berg4,10 kombiniert und weiter modifiziert, so dass bei der entwickelten Methode kein Decksch-/flexible Decke/Agarose verwendet wird. Drosophila-Eikammern sind in den Medien frei kultiviert und das hier vorgestellte Protokoll gilt nur invertiert. Das Protokoll besteht aus zwei Teilen. Der erste Teil konzentriert sich auf die Analyse von Actomyosin-Signalen auf der lokalen Zellskala (bis zu 15 Zellen) in Eikammern. Im zweiten Teil konzentrieren wir uns auf die Überwindung der Einschränkungen, die mit einer kleinen Ankaufsebene verbunden sind, die durch die freie Kultivierung von Eierkammern verursacht wird. In dieser Hinsicht haben wir eine neuartige Fidschi-basierte Berechnungsmethode mit einer semi-interaktiven grafischen Benutzeroberfläche entwickelt, die selektiv definierte Schichten einer umlaufenden Gewebeoberfläche extrahiert und entfaltet. Es folgt ein Protokoll, das beschreibt, wie Actomyosin auf der Gewebeskala analysiert wird (d. h. >50 Zellen). Da die selektive Extraktion einer definierten dünnen Schicht gekrümmter Epithelgewebe mit einer klassischen Z-Stack-Projektion (Abbildung 1) nicht einfach möglich war, dient diese einfach zu bedienende Methode als wichtige Voraussetzung, um die Verhalten eines dünnen Actomyosin-Netzwerks auf der Gewebeskala in Drosophila-Eikammern.
Darüber hinaus bieten wir zur Erleichterung des Protokolls Beispiel-Zeitrafferfilme (TLMs) und Beispieldateien mit fluoreszierend markiertem konventionellem Myosin-II-Verhalten (siehe Ergänzende Datei 3). Myosin II ist ein motorisch eskoproteinist und stellt den aktiven kontraktilen Teil der Actomyosin-Maschinerie dar. Um myosin II abzubilden, verwenden wir transgene Drosophila-Linien, die eine modifizierte regulatorische Lichtkette von Myosin II namens MRLC::GFP (siehe Tabelle der Materialien für Details)12,13enthalten. Um Zellmembranen zu visualisieren, basiert das Protokoll auf kommerziellen Farbstoffen (siehe Tabelle der Materialien). Dieses Protokoll eignet sich nicht nur für die Analyse kleiner subzellulärer MRLC::GFP-Signale12, sondern auch für alle subzellulären Partikel ähnlicher Größe um 300 M, wie sie mit Life-Act::GFP12,14beobachtet wurden.
Obwohl beide Protokolle mit in vitro kultivierten Drosophila-Eikammern präsentiert werden, kann die Erfassung von Actomyosin-Signalen auch mit anderen Geweben bei der Optimierung der Kultivierungsmedien und je nach Verfügbarkeit durchgeführt werden. von fluoreszierend markierten Proteinen mit entsprechenden kommerziellen Farbstoffen oder beispielsweise mRNA-Mikroinjektionen, um transiente Genexpressionsprofile zu erhalten. In ähnlicher Weise kann das Fidschi-basierte Protokoll zur Extraktion einer dünnen Schicht von einer Umfangsoberfläche allgemeiner auf ellipsoide und organähnliche Gewebe angewendet werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schneider Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720-024</td>
			<td>[+]-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#160;[+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 &#181;g/ml Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;F135</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Solution Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033NS</td>
			<td>33 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td></td>
			<td>&#160;#55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Deep Red (cell membrane dye)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64 (cell membrane dye)</td>
			<td>ThermoFisher/Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression dissection slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-560B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steromicroscope</td>
			<td>e.g. Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi SV 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic glass/cover glass</td>
			<td>e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wironit needle holder</td>
			<td>Hammacher</td>
			<td>9160020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus spine</td>
			<td>Echinocactus grusonii/barrel cactus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila stocks used in the manuscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers

Drosophila unreife Eier werden Eierkammern genannt, und ihre Struktur ähnelt primitiven Organen, die morphologische Veränderungen von einer runden zu einer ellipsoiden Form während der Entwicklung erfahren. Dieser Entwicklungsprozess wird Oogenese genannt und ist entscheidend für die Erzeugung funktioneller reifer Eier, um die nächste Fliegengeneration zu sichern. Aus diesen Gründen dienten Eierkammern als ideales und relevantes Modell, um die Entwicklung von Tierorganen zu verstehen.
Es wurden mehrere In-vitro-Culturing-Protokolle entwickelt, aber es gibt mehrere Nachteile dieser Protokolle. Zum einen werden verschiedene Abdeckungen aufgebracht, die einen künstlichen Druck auf die abgebildeten Eikammern ausüben, um sie zu immobilisieren und die abgebildete Erfassungsebene der Umfangsfläche der analysierten Eikammern zu erhöhen. Ein solcher Ansatz kann das Verhalten der dünnen Actomyosin-Maschinerie negativ beeinflussen, die die Kraft erzeugt, Eierkammern um ihre längere Achse zu drehen.
Um diese Einschränkung zu überwinden, kultiieren wir daher Drosophila-Eikammern frei in den Medien, um Actomyosin-Maschinen entlang des Umfangs von Eikammern zuverlässig zu analysieren. Im ersten Teil des Protokolls bieten wir eine manuelle Detaillierung, wie die Actomyosin-Maschinerie in einer begrenzten Erfassungsebene auf lokaler Zellskala (bis zu 15 Zellen) analysiert wird. Im zweiten Teil des Protokolls stellen wir den Benutzern ein neues Fidschi-basiertes Plugin zur Verfügung, das die einfache Extraktion einer definierten dünnen Schicht der Umfangsfläche der Eierkammern ermöglicht. Das folgende Protokoll beschreibt dann, wie Actomyosin-Signale auf der Gewebeskala (>50 Zellen) analysiert werden. Schließlich ermitteln wir die Grenzen dieser Ansätze sowohl auf der lokalen Zell- als auch auf Gewebewaage und diskutieren deren mögliche zukünftige Entwicklung und mögliche Anwendungen.

Dieses Protokoll ermöglicht es Wissenschaftlern, das Verhalten von Actomyosin-Netzwerken in Epithelgeweben zu untersuchen. Dies ist nur möglich, wenn eine detaillierte Analyse des Actomyosin-Verhaltens auf der lokalen Zellskala (einige Zellen) mit einer ähnlichen Analyse auf der Gewebeskala (viele Zellen) kombiniert wird. Epithelgewebe sind jedoch oft gekrümmt und die Extraktion einer dünnen Schicht dieser Gewebe war bisher nicht leicht möglich, wie in Drosophila-Eikammern ...

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Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Dieses Protokoll bietet eine Fidschi-basierte, benutzerfreundliche Methodik zusammen mit einfachen Anweisungen, die erklären, wie das Verhalten von Actomyosin in einzelnen Zellen und gekrümmten Epithelgeweben zuverlässig analysiert werden kann. Es sind keine Programmierkenntnisse erforderlich, um dem Tutorial zu folgen; Alle Schritte werden halbinteraktiv über die grafische Benutzeroberfläche von Fidschi und die zugehörigen Plugins durchgeführt.

Analyse der Actomyosin-Dynamik bei lokalen Zellstoff- und Gewebeskalen mit Zeitraffer-Filmen von kultivierten Drosophila-Eierkammern

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Unser Protokoll hilft Wissenschaftlern, subzelluläre stomyosin-Netzwerke in einzelnen Epithelzellen zu analysieren und ermöglicht es ihnen auch, ähnliche Analysen im mehrzelligen Maßstab in gekrümmten Epithelgeweben durchzuführen. Unser Protokoll ist ein schönes Beispiel für eine Fidschi-Anwendung. Es verfügt über eine intuitive grafische Benutzeroberfläche und erfordert keine Kenntnisse der Skripterstellung.Daher ist es auch für Anfänger im Feld sehr gut geeignet. Obwohl unsere Methode für Drosophila-Eikammern entwickelt wurde, ist sie auch außerhalb der Drosophila-Epithelie anwendbar. Wir ermutigen Wissenschaftler, unser Protokoll in ihren Modellsystemen zu testen.Verwenden Sie die mitihm versehenen Testdateien, um sich mit diesem Protokoll vertraut zu machen. Es hilft Ihnen zu entscheiden, welcher Teil dieses Protokolls für Ihre individuelle Forschungsfrage geeignet ist. Dieser Teil des Protokolls ermöglicht es Benutzern, Epithelzellen in Zeitrafferfilmen zu segmentieren und anschließend actomyosin-Pulse in einzelnen Zellen im Laufe der Zeit mit dem Surface Manager zu analysieren.Öffnen Sie zunächst Fidschi, und importieren Sie das Makro TissueCellSegmentMovie. ijm, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Öffnen Sie dann eine bleichkorrigierte TIFF-Datei, und teilen Sie die Kanäle der bleichkorrigierten Datei auf, indem Sie zur Menüleiste wechseln, Bild auswählen, gefolgt von Farbe, und Spalten Sie Kanäle austeilen.Führen Sie das hochgeladene Skript auf dem aktiven Zellmembrankanal des ausgewählten Zeitrafferfilms aus, indem Sie das Symbol Ausführen im geöffneten Skript drücken. Um eine schöne Zellmaske zu erhalten, stellen Sie die Gaußsche Unschärfe auf 2.500 und die Zellerkennungsempfindlichkeit auf minus eins ein, und klicken Sie auf OK. Legen Sie dann die geschätzte Rauschtoleranz zwischen 10 und 20 für Zeitrafferfilme fest, die mit dem 63-fachen Ziel erfasst wurden, und klicken Sie auf OK. Im analysierten Zeitrafferfilm wird eine generierte Zellenmaske angezeigt, ein neues Fenster namens ParticleStack und ein kleines Fenster namens Aktion erforderlich wird ebenfalls angezeigt. Konzentrieren Sie sich in der Zellenmaske des Zeitrafferfilms nur auf Zellen in der Mitte, und wählen Sie diejenigen aus, die vollständige und klar definierte Umrisse während des Zeitrafferfilms bereitstellen können.Wenn die ausgewählten Zellen in der Mitte gut den echten Zellmembranen entsprechen, speichern Sie ParticleStack als TIFF-Datei. Öffnen Sie die entsprechende ParticleStack TIFF-Datei in Fidschi. Mit dem Surface Manager Plugin in Fidschi installiert, öffnen Sie das Plugin.Klicken Sie in Surface Manager auf die Schaltfläche Umrissbild lesen, und legen Sie den Jaccard-Index auf 60% Festaufnahme der Umrisse kann je nach Anzahl der Zellen einige Minuten dauern. Nach dem Laden wird jeder Zelle eine S-Nummer zugewiesen und im linken Teil des Surface-Manager-Fensters angezeigt. Klicken Sie auf die ausgewählte S-Nummer, damit die importierte Zellumriss aus ParticleStack1.tiff erscheint im Zeitrafferfilm. Überprüfen Sie jede importierte S-Nummer auf die Zellenumrissqualität im gesamten Film, und entfernen Sie unerwünschte Zellen, die falsche Zellumrisse anzeigen. Um eine unerwünschte Zelle zu entfernen, markieren Sie die Zellumrisslinie, und klicken Sie auf die Schaltfläche Löschen.Verwenden Sie das Pinselwerkzeug, um Zellumrisse zu korrigieren. Speichern Sie nach Abschluss der korrigierten Zellen als RoiSet. ZIP-Datei.Um zu identifizieren, ob Actomyosin-Pulse im analysierten Gewebe vorhanden sind und um das detaillierte Verhalten sowie die Richtung von Actomyosin-Signalen zu verstehen, beginnen Sie mit der Öffnung fidschi. Öffnen Sie einen Zeitrafferfilm, laden Sie den gespeicherten ParticleStack1. tiff-Zellmaske und den bleichkorrigierten Zeitrafferfilm, dann laden Sie das Surface Manager-Plugin und den entsprechenden Bereich von Interesse aus dem RoiSet.ZIP-Datei. Aktivieren Sie in Surface Manager einen Kanal mit Interessenssignalen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Statistik, um das Fenster mit dem Namen Durchschnitt grauer Wert Slice by Slice zu erhalten.Die mittleren und medianen Intensitäten der Actomyosin-Signale werden im Laufe der Zeit in beliebigen Einheiten angezeigt, sowie andere Parameter, die sich auf den Bereich und die Form der Zelle beziehen. Speichern Sie die Werte als Tabellenkalkulationsdatei, indem Sie in das Statistikfenster gehen, auf Datei klicken und Speichern Sie Als .Ähnlich eine Zellenmaske generieren und in Surface Manager laden, um Actomyosinimpulse auf der Gewebeskala zu analysieren. Dieser Teil des Protokolls ermöglicht es Benutzern, selektiv eine dünne Schicht von Actomyosin im gekrümmten Epithelgewebe im Laufe der Zeit zu extrahieren.Diese Schritte sind benutzerfreundlich und basieren auf einer intuitiven grafischen Oberfläche. Öffnen Sie Fidschi, und stellen Sie sicher, dass das Ellipsoid Surface Projection Plugin installiert ist. Öffnen Sie dann einen Zeitrafferfilm, und exportieren Sie ihn als XML/HDF5-Datei, indem Sie auf Plugins klicken, zu BigDataViewer gehen und aktuelles Bild als XML/HDF5-Datei exportieren auswählen.Öffnen Sie anschließend die exportierte Datei in Ellipsoid Surface Projection, indem Sie zu Plugins gehen, auf BigDataViewer klicken, gefolgt von Ellipsoid-Oberflächenprojektion, und xml-Datei auswählen. Dadurch wird ein neues Fenster mit sagittalen Ansichten der Eierkammer geöffnet, und es wird ein Dialogfeld angezeigt, das den Benutzer durch die Verarbeitung führt. Das Dialogfenster, das als Ovarprojektion bezeichnet wird, hat mehrere Registerkarten.Definieren Sie in der ersten Dialog-Registerkarte, die als Begrenzungsrahmen bezeichnet wird, die x- und y-Ränder einer Eikammer im Zeitrafferfilm zusammen mit der z-Breite des Begrenzungsrahmens, und drücken Sie den Satz. Die ausgewählten Teile der Eierkammer sind rosa hervorgehoben. Definieren Sie als Nächstes die Größe von Signalblobs in der Dialogregisterkarte, die als Find-Blobs im Fenster Ovarprojektion bezeichnet wird.Definieren Sie das Sigma und den minimalen Spitzenwert. Drücken Sie dann die Berechnung, um die Actomyosin-Signale zu identifizieren, die als grüne Blobs angezeigt werden. Wiederholen Sie diesen Schritt mit verschiedenen Parametern, bis etwa 100 Punkte gefunden werden.Die Identifizierung der Actomyosin-Signale ist ein entscheidender Schritt. Es hängt von der Signalqualität und der richtigen Größe der erkannten Blobs ab. Wenn keine sichtbaren grünen Flecken im Bild vorhanden sind, funktioniert der nächste Schritt nicht.Um das Ellipsoid zu entwerfen, fahren Sie mit der Registerkarte fit ellipsoid fort. Legen Sie Zufallsstichproben auf 10 000 fest, den Außen-/Innen-Grenzabstand auf eins bis zehn, und klicken Sie dann auf Berechnen. Danach wird die Registerkarte projektion automatisch geöffnet und ermöglicht die Definition der Oberflächenextraktion.Richten Sie auf der Projektionsregisterkarte einen minimalen und maximalen Projektionsabstand als Breite des gewünschten Ellipsoids ein. Der minimale und maximale Projektionsabstand muss passen, damit der rosa definierte Ellipsoidbereich die gesamte Außenschicht der Eikammer umfasst. Definieren Sie dann den Slice-Abstand als eins.Stellen Sie sicher, dass der rosa Bereich des Ellipsoids mit dem auf der Eikammer definierten sichtbar ist, bevor Sie die Berechnung drücken. Es hilft, die Qualität einer neuen Ellipsoidpassung zu bewerten. Legen Sie als Nächstes eine Ausgabebreite des Ellipsoids auf größer oder gleich 800 und eine Höhe fest, die größer oder gleich 400 ist.Legen Sie dann die Dauer der Oberflächenextraktion fest, und wählen Sie entweder eine kugelförmige oder eine zylindrische Projektion aus. Wenn erforderlich, kippen Sie Z und richten Sie Y.Press Compute aus, um eine Oberflächenextraktion für beide Kanäle in neuen Fenstern namens Image zu erhalten. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast der erhaltenen Bildfenster an, um die projizierten Actomyosin-Signale sehen zu können, indem Sie auf Bild klicken, anpassen und Helligkeit/Kontrast auswählen.Wenn die Oberflächenextraktion gut aussieht, speichern Sie beide Kanäle separat als TIFF-Dateien. Speichern Sie außerdem die Log-Fensterdatei, um zu künftig darauf hinzuweisen, wie die Oberfläche dieser bestimmten Eikammer extrahiert wurde. Führen Sie dann die Kanäle mit einem bevorzugten Farbcode in Fidschi zusammen, und speichern Sie die Ergebnisse als TIFF-Dateien.Dieses Protokoll ermöglicht es Wissenschaftlern, das Verhalten von Actomyosin-Netzwerken in Epithelgeweben zu untersuchen. Dies ist nur möglich, wenn eine detaillierte Analyse des Actomyosin-Verhaltens auf der lokalen Zellskala mit einer ähnlichen Analyse auf der Gewebeskala kombiniert wird. Hier sind repräsentative Beispiele für dynamisches Myosin-II-Verhalten auf der lokalen Zellskala und auf der Gewebeskala für Diekontrolle und fett2 mutierte Drosophila-Eikammern.Auf der Basalebene bewegt sich die grün modifizierte regulatorische Lichtkette von Myosin-II-Signalen senkrecht zur vorderen-hinteren Achse der Kontrolleierkammern. Diese Polarität geht in fett2 mutierten Eizellen verloren und führt zu anisotropen Myosin-II-Impulsen, Schwingungen Auf Gewebeebene erzeugt die grün modifizierte regulatorische Lichtkette von Myosin II in der Kontrollprobe die synchronisierte Kraft, die erforderlich ist, um die Epithelrotation zu fördern. Im Gegensatz dazu pulsiert das Follikelepithel einer fat2 mutierten Eikammer stark an der Basalseite und erzeugt nicht die synchronisierte Kraft, die erforderlich ist, um die Epithelrotation zu fördern.In einer dünnen apikalen Region der Drosophila-Eikammer präsentiert sich der fat2-Mutant auch mit verändertem dynamischen Verhalten der grün modifizierten regulatorischen Lichtkette von Myosin II. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine gute Idee haben, wie Sie ein Actomyosin-Netzwerk auf lokaler und Gewebeskala in Drosophila-Eikammern mit Fidschi analysieren können. Weitere praktische Tipps und Fehlerbehebung finden Sie im Diskussionsteil nach dem Protokoll. Wenn Sie Fragen zu Fidschi oder unseren Plugins haben, besuchen Sie die entsprechenden Webseiten oder kontaktieren Sie uns.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bei Eiaktivierung

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Ein<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Methode für Time-Lapse-Imaging von kultivierten Ratten Mesenteriale mikrovaskuläre Netzwerke

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetische Analyse der Vaskulogenese quantifiziert Dynamik der Vaskulogenese und Angiogenese In-vitro-

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Bildgebung und Analyse der Gewebeorientierung und Wachstumsdynamik in der Entwicklung drosophila Epithelia während der Pupal-Stadien

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Retrograde Tracing von Drosophila Embryonal Motor Neuronen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...