Name: analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers
Uploaded: 2019-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

המחברים מודים מאוד למרים אוסטררפילד על שיתוף עצתה ביצירת הדמיה של תאי ביצה באמצעות גישה שאומצה מהמעבדה של סלסט ברג4. אנחנו גם מודים לסבסטיאן טוסי על התסריט של פיג'י המאפשר פילוח של תאים.

הערה: הפרוטוקול הבא מספק הוראות כיצד לנתח actomyosin ב הסלולר המקומי ובקנה מידה הרקמה בבית הביצה Drosophila ילה . הגישה בקנה מידה מקומי מאפשרת למשתמשים לנתח התנהגות actomyosin מפורטת של עד 15 תאים לכל תא ביצה ודורש רכישה של tlms לתקופה קצרה של זמן (5-10 דקות) באמצעות דימות במהירות גבוהה ומיקרוסקו...

<ol>
	<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).</li><li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+oogenesis.">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68, 207-217 (2014).</li><li>Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Ovaries.">Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries.</a> Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).</li><li>Peters, N. C., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Culturing+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Egg+Chambers:+A+History+and+Adaptable+Method.">In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method.</a> Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).</li><li>Spradling, A. C., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Genetics+of+Oogenesis.">Developmental Genetics of Oogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. , 1-70 (1993).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331, 1071-1074 (2011).</li><li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila.">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development. 143, 1375-1387 (2016).</li><li>Pokrywka, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+GFP-labeled+proteins+in+Drosophila+oocytes.">Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50044 (2013).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bullwinkle+is+required+for+epithelial+morphogenesis+during+Drosophila+oogenesis.">bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).</li><li>Cetera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+rotation+promotes+the+global+alignment+of+contractile+actin+bundles+during+Drosophila+egg+chamber+elongation.">Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation.</a> Nature Communications. 5, 5511 (2014).</li><li>Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+rotation+is+preceded+by+planar+symmetry+breaking+of+actomyosin+and+protects+epithelial+tissue+from+cell+deformations.">Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations.</a> PLOS Genetics. 13, e1007107 (2017).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+polarized+actomyosin+contractile+flows+control+epithelial+junction+remodelling.">Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling.</a> Nature. 468, 1110-1114 (2010).</li><li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis.">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).</li><li>. Surface manager Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager">https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager</a> (2018)</li><li>. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins">https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins</a> (2018)</li><li>. BigDataViewer Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/BigDataViewer">https://imagej.net/BigDataViewer</a> (2017)</li><li>Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigDataViewer:+visualization+and+processing+for+large+image+data+sets.">BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets.</a> Nature Methods. 12, 481-483 (2015).</li><li>Turner, C. M., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons+in+the+morphogenesis+of+epidermal+hairs+during+wing+development+in+Drosophila.">Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila.</a> Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).</li><li>Heemskerk, I., Streichan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cartography:+compressing+bio-image+data+by+dimensional+reduction.">Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction.</a> Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).</li><li>Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+Breaking+in+an+Edgeless+Epithelium+by+Fat2-Regulated+Microtubule+Polarity.">Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity.</a> Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).</li><li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists.">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nature Methods. 12, 30-34 (2015).</li></ol>

שלבים קריטיים ופתרון בעיות לחיתוך ולניתוח של תאי ביצה
אם זבובים רבים מדי ממוקמים לתוך בקבוקון קטן, האוכל לעוף יכול להפוך מלוכלך אחרי 2 – 3 ימים בשל כמויות נרחבות של הזחלים האכלה וזבובים מבוגרים לכודים במזון לעוף. במקרה כזה, להפוך את שאר הזבובים האלה לתוך בקבוקון חדש...

פיתוח מתמשך של הדמיה הרומן וטכנולוגיות תוכנה עם יישומים במדעי החיים סיפקה השפעה עצומה על הבנת עקרונות היסוד של החיים. אחד האתגרים העיקריים הוא ההדמיה המהימנה של תהליכים התפתחותיים בשילוב עם הדמיה חיה ברקמות שונות. רקמות הן חלקים של איברים וגופים, וככאלה, הרוב אינו נגיש בקלות להדמיה. לכן, הפרוטוקולים המאפשרים את הניתוח שלהם ובדיקת החוץ הגופית פותחו על מנת להמחיש אירועים ביולוגיים המשקפים בצורה מספקת את המצב הvivo בתוך גוף חי.
במהלך העשורים האחרונים, ההדמיה החיה של מתקני ביצים של דרוזוהילה , מבנים דמוי-שכבתית הדומים לאברים פרימיטיביים, תרמה רבות להבנת העקרונות הבסיסיים של פיתוח איברים פרימיטיביים1 , מיכל השני , 3. כיום, יש כמה פרוטוקולים culturing זמין, השימוש שלהם תלוי בזמן הרכישה, סוג התא כדי להיות בתמונה, ואת הנגישות שלהם (למשל, הפנימי germline מול קו הסומאטיק החיצוני)4.
תכונה נפוצה בכל הפרוטוקולים הללו culturing הוא הצורך השתק של תאי ביצה מנותח המציגים פעילות הקונקטילה גבוהה במדיה נוזלית. הפעילות הקונאקטעית של תאי ביצה נגרמת בעיקר על ידי גיליון השריר המכסה מחרוזת ארוכה של תאי ביצה מחוברים5,6,7. לכן, כדי להשיג השתק מתאים של תאי ביצים צעירים, התפתחו גישות שונות, מעורבים כיסוי תאי ביצה עם מכסים6,8,9 או שמיכות גמיש4, 10 או להטביע אותם בנקודת התכה נמוכה-ההיתוך3,11. גישות אלה הן פופולריות כפי שהם גם מאפשרים הדמיה של מטוס חזותי גדול יותר בשל שיטוח עדין של המשטח ההיקפי של תאי הביצה.
עם זאת, לאחרונה, זה הוכח כי חדרי ביצה צעירים (שלב 1-8) לסובב סביב הציר האחורי שלהם6 וכי תנועה זו רקמה מופעל על ידי רשת actomyosin קנס קרוב למשטח ההיקפי של אלה ביצה צעירים 12. לכן, שינוי מלאכותי של משטח הסלולר הנגרם על ידי שיטוח עדין של רקמה זו עשויה להיות השפעה שלילית על התנהגות של מכונות הפקת כוח actomyosin. קונטרפונקט הוא כי אם הרקמה הקאמרית ביצה אינו משוטח, הדמיה מיקרוסקופית של חלבונים על פני השטח הcircumשל תאי ביצה הופך להיות מוגבל עוד יותר על ידי גודל ירידה של מטוס הרכישה.
לכן, יש לנו פרוטוקולים משולבים מ פראסאד ואח '9 ואת המעבדה של סלסט ברג4,10 ועוד שונה אותם כך לא coverslip/שמיכה גמישה/agarose משמש בשיטה מפותחת. מרבית תאי הביצה מתורבתים באופן חופשי בתקשורת והפרוטוקול המוצג כאן חל רק מיקרוסקופ הפוך. . יש שני חלקים לפרוטוקול החלק הראשון מתמקד בניתוח של אותות actomyosin בקנה מידה הסלולר המקומי (עד 15 תאים) בתוך תאי ביצה. בחלק השני אנו מתמקדים בהתגברות על המגבלות הקשורות למישור הרכישה הקטן שנגרם כתוצאה מהתפירה החופשית של תאי הביצה. בהקשר זה, פיתחנו הרומן מבוססי פיג'י שיטה חישובית עם ממשק משתמש גרפי למחצה אינטראקטיבי באופן סלקטיבי ומתגלה שכבות מוגדרות של משטח רקמות. הדבר מלווה בפרוטוקול המתאר כיצד לנתח actomyosin בסולם הרקמה (כלומר, > 50 תאים). כמו החילוץ סלקטיבי של שכבה דקה מוגדרת של רקמות אפיתל מעוקל לא ניתן בקלות באמצעות הקרנת z-מחסנית קלאסית (איור 1), זו שיטה קלה לשימוש משמש כתנאי מוקדם חשוב להבין באופן מקיף את ה אופן הפעולה של רשת actomyosin דקה (< 1 μm) בסולם הרקמה בתאי ביצת דרוסופילה .
בנוסף, כדי להקל על הפרוטוקול, אנו מספקים למשל סרטים לפקיעה זמן (TLMs) וקבצים לדוגמה של מתויג בלתי שרירים רירן II התנהגות קונבנציונאלי (ראה קובץ משלים 3). רירן II הוא חלבון מוטורי ומייצג את החלק האקטיבי של המכונות actomyosin. כדי לדמות רירן II, אנו משתמשים הקווים הטרנסגניים הכוללים שרשרת אור שונה הרגולציה של רירן II בשם mrlc:: gfp (ראה טבלת חומרים לפרטים)12,13. כדי להמחיש את קרום התאים, הפרוטוקול מבוסס על צבעים מסחריים (ראה טבלת חומרים). פרוטוקול זה מתאים לא רק לניתוח של mrlc קטן מסוג subcellular:: אותות gfp12 אבל גם עבור כל החלקיקים בגודל זהה subcellular סביב ± 300 μm, כגון אלה שנצפו עם חיים-Act:: gfp12,14.
למרות ששני הפרוטוקולים הללו מוצגים באמצעות מבחנה בתאי ביצה מחוץ לגופית, רכישת אותות actomyosin יכול גם להתבצע באמצעות רקמות אחרות על אופטימיזציה של מדיה culturing ובהתאם לזמינות של או פלואור מתויג חלבונים עם צבעים מסחריים מתאימים או, למשל, מיקרוזריקות mRNA כדי להשיג פרופילים של ביטוי גנים ארעי. באופן דומה, הפרוטוקול המבוסס על פיג'י להפקת שכבה דקה ממשטח משטח, ניתן ליישם באופן כללי יותר אליפסואיד ורקמות כמו איברים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schneider Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720-024</td>
			<td>[+]-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#160;[+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 &#181;g/ml Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;F135</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Solution Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033NS</td>
			<td>33 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td></td>
			<td>&#160;#55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Deep Red (cell membrane dye)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64 (cell membrane dye)</td>
			<td>ThermoFisher/Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression dissection slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-560B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steromicroscope</td>
			<td>e.g. Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi SV 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic glass/cover glass</td>
			<td>e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wironit needle holder</td>
			<td>Hammacher</td>
			<td>9160020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus spine</td>
			<td>Echinocactus grusonii/barrel cactus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila stocks used in the manuscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers

דרוזופילה ביצים לא בוגרות נקראות תאי ביצה, והמבנה שלהם דומה לאברים פרימיטיביים העוברים שינויים מורפולוגיים מסיבוב לצורת אליפסואיד במהלך הפיתוח. תהליך התפתחותי זה נקרא oogenesis והוא חיוני כדי לייצר ביצים בוגרות תפקודית כדי לאבטח את דור הזבוב הבא. מסיבות אלו שימשו תאי ביצה כמודל אידיאלי ורלבנטי להבנת התפתחות אברי החיות.
כמה מהפרוטוקולים בפרוטוקולים מחוץ למבחנה פותחו, אך קיימים מספר חסרונות לפרוטוקולים אלה. אחד כולל את היישום של כיסויים שונים, כי להפעיל לחץ מלאכותי על תאי ביצה התמונה כדי לשתק אותם ולהגדיל את מטוס רכישת התמונה של המשטח ההיקפי של תאי ביצה מנותח. גישה כזו עלולה להשפיע לרעה על ההתנהגות של מכונות actomyosin דק היוצר את הכוח לסובב תאי ביצה סביב הציר הארוך שלהם.
לפיכך, כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו התרבות דרוזולה תאי ביצה באופן חופשי בתקשורת כדי לנתח בצורה אמינה מכונות actomyosin לאורך ההיקף של תאי ביצה. בחלק הראשון של הפרוטוקול, אנו מספקים מדריך המפרט כיצד לנתח את מכונות actomyosin במישור רכישה מוגבלת בקנה מידה הסלולר המקומי (עד 15 תאים). בחלק השני של הפרוטוקול, אנו מספקים למשתמשים תוסף חדש מבוסס פיג'י המאפשר החילוץ הפשוט של שכבה דקה מוגדרת של משטח הביצה ' היקפי. לאחר מכן, הפרוטוקול הבא מתאר כיצד לנתח אותות actomyosin בסולם הרקמה (> 50 תאים). לבסוף, אנו מאתרים את המגבלות של גישות אלה הן בסולמות הסלולר והן הרקמה המקומית ודנים בפיתוח עתידי הפוטנציאלי וביישומים אפשריים.

פרוטוקול זה מאפשר למדענים לחקור את ההתנהגות של רשתות actomyosin ברקמות אפיתל. זה אפשרי רק כאשר ניתוח מפורט של התנהגות actomyosin בקנה מידה הסלולר המקומי (כמה תאים) משולב עם ניתוח דומה בסולם הרקמה (תאים רבים). עם זאת, רקמות אפיתל הן לעתים קרובות מעוקל והפקת שכבה דקה של רקמות אלה בעבר ל...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה ידידותית למשתמש המבוססת על פיג'י, יחד עם הוראות ברורות המסבירות כיצד לנתח באופן אמין את התנהגות actomyosin בתאים בודדים ורקמות אפיתל מעוקל. כישורי תיכנות אינם נדרשים לבצע את הלימוד; כל השלבים מתבצעים באופן חצי אינטראקטיבי באמצעות ממשק המשתמש הגרפי של פיג'י ותוספים משויכים.

ניתוח של Actomyosin בסולמות הסלולר והרקמה המקומית באמצעות הזמן- סרטים פקיעה של מתורבת ביצת ביצה צ'יימברס

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

הפרוטוקול שלנו מסייע למדענים לנתח רשת אקטומיוסין תת-תאית בתאי אפיתל בודדים וגם מאפשר להם לבצע ניתוח דומה בקנה מידה רב-תאי ברקמות אפיתל מעוגלים. הפרוטוקול שלנו הוא דוגמה נחמדה ליישום פיג'י. יש לו ממשק משתמש גרפי אינטואיטיבי, והוא אינו דורש כל ידע של סקריפטים.לכן, הוא מתאים מאוד גם למשתמשים מתחילים בתחום. למרות השיטה שלנו פותחה עבור תאי ביצה Drosophila, זה ישים גם מחוץ Drosophila אפיתליה. אנו מעודדים מדענים לבחון את הפרוטוקול שלנו במערכות המודל שלהם.השתמש בקבצי הבדיקה הנלווים כדי להכיר פרוטוקול זה. זה יעזור לך להחליט איזה חלק של פרוטוקול זה מתאים לשאלת המחקר האישית שלך. חלק זה של הפרוטוקול מאפשר למשתמשים למקטע תאי אפיתל בסרטים לשגות בזמן ולאחר מכן לנתח פולסים actomyosin בתאים בודדים לאורך זמן באמצעות מנהל פני השטח.כדי להתחיל, לפתוח את פיג'י ולייבא את המאקרו TissueCellSegmentMovie. ijm כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, פתחו קובץ TIFF מתוקן באמצעות אקונומיקה, ופצלו את ערוצי הקובץ שתקן את האקונומיקה על-ידי צפייה שורת התפריטים, בחירה בתמונה, ואחריו צבע, ובחירה ב'ערוצים מפוצלים'.הפעל את קובץ ה- Script שהועלה בערוץ קרום התא הפעיל של הסרט הנבחר לשגות בזמן על-ידי לחיצה על הסמל הפעל בקובץ ה- Script הפתוח. כדי לקבל מסכת תא נחמדה, הגדר את הטשטוש הגאוסיאני ל- 2.500 ואת רגישות זיהוי התא למינוס אחד, ולחץ על אישור. לאחר מכן, הגדר את עמידות הרעש המשוערת בין 10 ל- 20 עבור סרטים לשגות בזמן שנרכשו עם המטרה 63x ולחץ על אישור. מסיכת תא שנוצרה מופיעה בסרט לשגות בזמן שנותח, מופיע חלון חדש בשם ParticleStack וחלון קטן בשם פעולה נדרשת מופיע גם כן. מתוך מסיכת התא בסרט לשגות בזמן, התמקד רק בתאים במרכז ובחר את אלה שיכולים לספק קווי מתאר שלמים ומוגדרים היטב לאורך הסרט לשגות בזמן.כאשר התאים שנבחרו במרכז מתאימים יפה למברנות התא האמיתיות, שמור את ParticleStack כקובץ TIFF. פתח את קובץ TIFF של ParticleStack המתאים בפיג'י. עם תוסף Surface Manager מותקן בפיג'י, פתח את התוסף.במנהל פני השטח, לחץ על לחצן קרא תמונת חלוקה לרמות והגדר את אינדקס Jaccard ל- 60%טעינת קווי המתאר עשויה להימשך מספר דקות בהתאם למספר התאים. לאחר הטעינה, לכל תא יוקצה מספר S והוא יופיע בחלק השמאלי של חלון מנהל פני השטח. לחץ על מספר S שנבחר כך חלוקה לרמות תא מיובא מ ParticleStack1.tiff מופיע בסרט לשגות בזמן. בדוק אם קיימים בכל מספר S מיובא איכות חלוקה לרמות של תאים לאורך הסרט והסר תאים לא רצויים המציגים קווי מתאר שגויים של תאים. כדי להסיר תא לא רצוי, סמן את קו המיתאר של התא ולחץ על לחצן מחק.השתמש בכלי מברשת לתיקון קווי מתאר של תאים. לאחר שתסיים, שמור את התאים מתוקנים כ- RoiSet. קובץ zip.כדי לזהות אם פולסים actomyosin נמצאים ברקמה מנותחת כדי להבין את ההתנהגות המפורטת, כמו גם את הכיווניות של אותות actomyosin, להתחיל על ידי פתיחת פיג'י. פתח סרט לשגות בזמן, לטעון את ParticleStack שנשמר1. מסיכת תא טיפ וסרט לשגות זמן מתוקן אקונומיקה, ולאחר מכן לטעון את תוסף מנהל פני השטח ואת האזור המתאים של עניין מן RoiSet.קובץ zip. לאחר מכן, ב- Surface Manager, הפעל ערוץ עם אותות של עניין. לחצו על הלחצן 'סטטיסטיקה' כדי לקבל את החלון שנקרא 'ערך אפור ממוצע פרוסה לפי פרוסה'.התעצמות הממוצעת והחציון של אותות האקטומיוסין תוצג לאורך זמן ביחידות שרירותיות, כמו גם בפרמטרים אחרים הקשורים לאזור ולצורת התא. שמור את הערכים כקובץ גיליון אלקטרוני על ידי הולך לחלון סטטיסטיקה, לחיצה על קובץ, ובחירה שמירה As.Similarly, ליצור מסיכת תא, טען אותו לתוך Surface Manager על מנת לנתח פולסים actomyosin בסולם הרקמות. חלק זה של הפרוטוקול מאפשר למשתמשים לחלץ באופן סלקטיבי שכבה דקה של אקטומיוסין ברקמת האפיתל המעוקלת לאורך זמן.שלבים אלה ידידותיים למשתמש ומבוססים על ממשק גרפי אינטואיטיבי. פתח את פיג'י וודא שהתוסף להקרנת משטח אליפסואיד מותקן. לאחר מכן, פתח סרט לשגות בזמן וייצא אותו כקובץ XML/HDF5 על-ידי לחיצה על תוספים, לחיצה על BigDataViewer ובחירה באפשרות יצא תמונה נוכחית כקובץ XML/HDF5.לאחר מכן, פתח את הקובץ המיוצא בהקרנת משטח אליפסואיד על ידי הולך תוספים, לחיצה על BigDataViewer, ואחריו הקרנה משטח אליפסואיד, ובחירת קובץ XML. זה יפתח חלון חדש עם נוף קשתי של תא הביצים, ודיאלוג שינחה את המשתמש בעיבוד יופיע. חלון הדו-שיח, הנקרא הקרנה של השחלות, כולל מספר כרטיסיות.בכרטיסית הדו-שיח הראשונה, הנקראת תיבה תוחמת, הגדר את גבולות ה- x וה- y של תא ביצה בסרט לשגות בזמן יחד עם רוחב z של התיבה התוחמת ולחץ על set. החלקים הנבחרים של תא הביצים מודגשים בוורוד. לאחר מכן, הגדר את הגודל של כתמי אות בכרטיסית הדו-שיח הנקראת חיפוש כתמים בחלון הקרנה של השחלות.הגדר את הסיגמא ואת ערך השיא המינימלי. לאחר מכן, לחץ על מ לחשב כדי לזהות את אותות actomyosin, אשר יופיעו כתמים ירוקים. נסה שוב לבצע שלב זה עם פרמטרים שונים עד שיימצאו כ- 100 נקודות.זיהוי אותות האקטומיוסין הוא צעד מכריע. זה תלוי באיכות האות ובגודל הנכון של הכתמים שזוהו. אם אין כתמים ירוקים גלויים בתמונה, השלב הבא לא יעבוד.כדי לעצב את האליפסואיד, המשך עם הכרטיסייה הנקראת התאם אליפסואיד. הגדר דגימות אקראיות ל- 10, 000, את מרחק החיתוך החיצוני/פנימי למרחק ניתוק אחד עד 10 ולאחר מכן לחץ על מ לחשב. לאחר מכן, הכרטיסיה הנקראת הקרנה תיפתח באופן אוטומטי ותתיר את ההגדרה של מיצוי פני השטח.בכרטיסיה הקרנה, הגדר מרחק הקרנה מינימלי ומקסימום ברוחב האליפסואיד הרצוי. מרחק ההקרנה המינימלי והמקסימלי חייב להתאים כך שהאזור האליפסואידי המוגדר בוורוד כולל את כל השכבה החיצונית של תא הביצים. לאחר מכן, הגדר את מרחק הפרוסה כאחד.ודא כי האזור הוורוד של אליפסואיד עם מוגדר עם על תא הביצה גלוי לפני לחיצה על מ לחשב. זה עוזר להעריך את האיכות של התאמה אליפסואידית חדשה. לאחר מכן, הגדר רוחב פלט של האליפסואיד כגדול או שווה ל- 800 וגובה הגדול או שווה ל- 400.לאחר מכן, קבעו את משך החילוץ של פני השטח ובחרו הקרנה כדורית או גלילית. במידת הצורך, הפוך Z ויישר מדף Y.Press כדי להשיג חילוץ משטח עבור שני הערוצים בחלונות חדשים הנקראים תמונה. כוונן את הבהירות והניגודיות של חלונות התמונה שהושגו כדי שתוכל לראות את אותות האקטומיוסין המוקרנים על-ידי לחיצה על תמונה, ג'יינג' כוונון ובחירת בהירות/ניגודיות.אם חילוץ פני השטח נראה טוב, שמור את שני הערוצים בנפרד כקבצי TIFF. בנוסף, שמור את קובץ חלון יומן הרישום לעיון בעתיד לגבי האופן שבו המשטח של תא הביצים המסוים הזה חולץ. לאחר מכן, מזג את הערוצים עם קוד צבע מועדף בפיג'י ושמור את התוצאות כקבצי TIFF.פרוטוקול זה מאפשר למדענים לחקור את ההתנהגות של רשתות actomyosin ברקמות אפיתל. זה אפשרי רק כאשר ניתוח מפורט של התנהגות actomyosin בקנה המידה התאי המקומי משולב עם ניתוח דומה בסולם הרקמות. מוצגות להלן דוגמאות מייצגות להתנהגות דינמית של מיוסין II בסולם התאים המקומי ובקנה המידה של הרקמות לשליטה ותאי ביצים דרוסופילה מוטציה fat2.במישור היחיד הבסיסי, שרשרת האור הרגולטורית הירוקה של אותות מיוסין II נעים בניצב לציר האחורי-אחורי של תאי הביצה הבקרה. קוטביות זו אובדת בתאי הביצים המוטנטיים fat2 ומובילה לפולסים אניסוטרופיים מיוסין II, תנודות ברמת הרקמה, שרשרת האור הרגולטורית הירוקה של myosin II בדגימה הבקרה מייצרת את הכוח המסונכרן הנדרש כדי לקדם סיבוב אפיתל. לעומת זאת, אפיתל הזקיק של דופק תא ביצה מוטציה fat2 בחוזקה בצד הבסיסי ולא מצליח ליצור את הכוח המסונכרן הנדרש כדי לקדם סיבוב אפיתל.באזור אפיקל דק של תא הביצים Drosophila, מוטציה fat2 גם מציג עם התנהגות דינמית שונה של שרשרת אור רגולטורי שונה ירוק של myosin II.After צפייה בסרטון זה, אתה צריך מושג טוב כיצד לנתח רשת actomyosin בקנה מידה מקומי ורקמות בתאי ביצה Drosophila באמצעות פיג'י. לקבלת עצות מעשיות נוספות ופתרון בעיות, עיין בחלק הדיון לאחר הפרוטוקול. אם יש לך שאלות הקשורות לפיג'י או לתוספים שלנו, עיין בדפי האינטרנט המתאימים או פנה אלינו.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

הדמיה זקופה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; לשכות ביצה

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

סידן הדמיה ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; ב ביצת הפעלה

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; שיטת הדמיה זמן לשגות של רשתות כלי הדם Mesenteric עכברוש מתורבתות

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

ניתוח קינטי של Vasculogenesis מכמתת את הדינמיקה של Vasculogenesis ואנגיוגנזה במבחנה

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

אין ויוו הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב דרוזופילה הגלמים

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...