Name: analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers
Uploaded: 2019-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

Gli autori sono molto grati a Miriam Osterfield per aver condiviso i suoi consigli sull'imaging in vitro delle camere d'uovo utilizzando un approccio adottato dal laboratorio Celeste Berg4 . Ringraziamo anche Sebastian Tosi per lo script Fiji che consente la segmentazione cellulare.

NOT:</</c0> Il seguente protocollo fornisce istruzioni su come analizzare l'actomiosina al cellulare locale e la scala del tessuto nelle camere d'uovo della Drosophila. L'approccio su scala locale consente agli utenti di analizzare il comportamento dettagliato della actomiosina in un massimo di 15 celle per camera d'uovo e richiede l'acquisizione di TLM per un breve periodo di tempo (5-10 min) utilizzando immagini ad alta velocità e un microscopio confocale invertito. Al contrario, la scala tissutale f...

<ol>
	<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).</li><li>Hudson, A. 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Surface manager Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager">https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager</a> (2018)</li><li>. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins">https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins</a> (2018)</li><li>. 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J., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+Breaking+in+an+Edgeless+Epithelium+by+Fat2-Regulated+Microtubule+Polarity.">Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity.</a> Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).</li><li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists.">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nature Methods. 12, 30-34 (2015).</li></ol>

Passaggi critici e risoluzione dei problemi per la dissezione e la coltura delle camere d'uovo
Se troppe mosche vengono poste in una piccola fiala, il cibo a mosca può diventare fangoso dopo 2-3 giorni a causa di ampie quantità di larve di alimentazione e mosche adulte intrappolate nel cibo a mosca. In tal caso, capovolgere il resto di queste mosche in una nuova fiala con cibo fresco e ridimensionare il loro numero. In particolare, escludere le femmine che erano bloccate nel...

Il continuo sviluppo di nuove tecnologie di imaging e software con applicazioni nelle scienze della vita ha fornito un enorme impatto sulla comprensione dei principi di base della vita. Una delle sfide principali è la visualizzazione affidabile dei processi di sviluppo in combinazione con la loro imaging dal vivo in vari tessuti. I tessuti sono parti di organi e corpi e, in quanto tali, la maggior parte non sono facilmente accessibili per l'imaging. Pertanto, sono stati sviluppati protocolli che consentono la loro dissezione e la loro coltura in vitro al fine di visualizzare eventi biologici che riflettono sufficientemente la situazione in vivo all'interno di un corpo vivente.
Negli ultimi decenni, la coltura e l'imaging dal vivo delle camere d'uovo della Drosophila, strutture simili acinari e simili a organi primitivi, ha contribuito immensamente alla comprensione dei principi di base dello sviluppo primitivo degli organi1 , 2 Il nome del sistema , 3. Attualmente, ci sono diversi protocolli di coltura disponibili, e il loro utilizzo dipende dal tempo di acquisizione, tipo di cella da imageizzare, e la loro accessibilità (ad esempio, germinainterna e linea somatica esterna)4.
Una caratteristica comune in tutti questi protocolli di coltura è la necessità di immobilizzare le camere d'uovo analizzate che mostrano un'elevata attività contrattile nei supporti liquidi. L'attività contrattile delle camere d'uovo è causata principalmente dal foglio muscolare che copre una lunga serie di camere d'uovo collegate5,6,7. Pertanto, per ottenere una corretta immobilizzazione delle camere d'uovo giovani, sono stati sviluppati vari approcci, che prevedono la copertura delle camere d'uovo con coperchi rivolti6,8,9 o coperte flessibili4, 10 o incorporandoli in agarose a basso punto di fusione3,11. Questi approcci sono popolari in quanto consentono anche l'imaging di un piano visivo più grande a causa del sottile appiattimento della superficie circonferenziale delle camere d'uovo.
Tuttavia, recentemente, è stato dimostrato che le camere delle uova giovani (stadio 1-8) ruotano intorno al loro asse anteriore-posteriore6 e che questo movimento del tessuto è alimentato da una rete di actomiosina fine vicino alla superficie circonferenziale di queste giovani camere d'uovo 12. Pertanto, l'alterazione artificiale della superficie cellulare causata da un sottile appiattimento di questo tessuto può avere un impatto negativo sul comportamento del meccanismo di actomiosina che genera forza. Il contrappunto è che se il tessuto della camera dell'uovo non è appiattito, l'imaging microscopico delle proteine sulla superficie circonferenziale delle camere d'uovo diventa ancora più limitato dalla diminuzione delle dimensioni del piano di acquisizione.
Pertanto, abbiamo combinato protocolli da Prasad et al.9 e il laboratorio di Berg Celeste4,10 e ulteriormente modificato in modo che nessun coverslip / coperta flessibile / agarose viene utilizzato nel metodo sviluppato. Le camere delle uova di Drosophila sono liberamente coltivate nei media e il protocollo qui presentato si applica solo microscopia invertita. Ci sono due parti del protocollo. La prima parte è focalizzata sull'analisi dei segnali di actomiosina su scala cellulare locale (fino a 15 celle) all'interno delle camere d'uovo. Nella seconda parte, ci concentriamo sul superamento dei limiti associati a un piccolo piano di acquisizione causato dalla libera coltura delle camere d'uovo. A questo proposito, abbiamo sviluppato un nuovo metodo computazionale basato sulle Fiji con un'interfaccia utente grafica semi-interattiva che estrae e dispiega selettivamente strati definiti di una superficie del tessuto circonferenzale. Questo è seguito da un protocollo che descrive come analizzare l'actomiosina su scala tissutale (cioè, >50 cellule). Poiché l'estrazione selettiva di un sottile strato definito di tessuti epiteliali curvi non è stata facilmente possibile utilizzando una proiezione classica dello z-stack (Figura 1), questo metodo facile da usare funge da prerequisito importante per comprendere in modo completo il comportamento di una sottile rete di actomyosina (<1 m) su scala tissutale nelle camere d'uovo della Drosophila.
Inoltre, per facilitare il protocollo, forniamo esempi di filmati time-lapse (TLM) e file di esempio del comportamento di Myosin aI convenzionale con tag fluorescenti (vedere File supplementare 3). Myosin II è una proteina motoria e rappresenta la parte contrattile attiva del meccanismo di actomyosin. Per immaginare Myosin II, utilizziamo linee transgeniche della Drosophila che contengono una catena di luce regolatoria modificata di Myosin II chiamata MRLC::GFP (vedi Tabella dei Materiali per i dettagli)12,13. Per visualizzare le membrane cellulari, il protocollo si basa su coloranti commerciali (cfr. Tabella deimateriali). Questo protocollo è adatto non solo per l'analisi dei piccoli segnali mrLC subcellulari::GFP12, ma anche per particelle subcellulari di dimensioni simili intorno a 300 m, come quelle osservate con Life-Act::GFP12,14.
Anche se entrambi questi protocolli sono presentati utilizzando camere d'uovo di Drosophila coltivate in vitro, l'acquisizione di segnali di actomiosina può essere eseguita anche utilizzando altri tessuti sull'ottimizzazione dei supporti di coltura e a seconda della disponibilità di proteine con etichettaflue fluorescenti con coloranti commerciali corrispondenti o, ad esempio, microiniezioni di mRNA per ottenere profili di espressione genica transitoria. Allo stesso modo, il protocollo basato su Fiji per l'estrazione di uno strato sottile da una superficie circonferenziale può essere applicato più in generale ai tessuti ellissoidi e simili ad organi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schneider Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720-024</td>
			<td>[+]-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#160;[+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 &#181;g/ml Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;F135</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Solution Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033NS</td>
			<td>33 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td></td>
			<td>&#160;#55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Deep Red (cell membrane dye)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64 (cell membrane dye)</td>
			<td>ThermoFisher/Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression dissection slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-560B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steromicroscope</td>
			<td>e.g. Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi SV 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic glass/cover glass</td>
			<td>e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wironit needle holder</td>
			<td>Hammacher</td>
			<td>9160020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus spine</td>
			<td>Echinocactus grusonii/barrel cactus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila stocks used in the manuscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers

Le uova immature della Drosophila sono chiamate camere d'uovo, e la loro struttura assomiglia agli organi primitivi che subiscono cambiamenti morfologici da una forma rotonda a una ellissoide durante lo sviluppo. Questo processo di sviluppo è chiamato oogenesi ed è fondamentale per generare uova mature funzionali per garantire la prossima generazione di mosche. Per questi motivi, le camere d'uovo sono servite come modello ideale e pertinente per comprendere lo sviluppo di organi animali.
Sono stati sviluppati diversi protocolli di coltura in vitro, ma questi protocolli presentano diversi svantaggi. Uno comporta l'applicazione di varie coperture che esercitano una pressione artificiale sulle camere d'uovo foto al fine di immobilizzarle e per aumentare il piano di acquisizione immaginato della superficie circonferenziale delle camere d'uovo analizzate. Tale approccio può influenzare negativamente il comportamento del sottile macchinario di actomiosina che genera il potere di ruotare le camere d'uovo intorno al loro asse più lungo.
Così, per superare questa limitazione, noi cultura Camere d'uovo Drosophila liberamente nei media al fine di analizzare in modo affidabile macchinari di actomyosina lungo la circonferenza delle camere d'uovo. Nella prima parte del protocollo, forniamo un dettaglio manuale su come analizzare il macchinario actomyosina in un piano di acquisizione limitato su scala cellulare locale (fino a 15 celle). Nella seconda parte del protocollo, forniamo agli utenti un nuovo plugin basato sulle Fiji che consente la semplice estrazione di uno strato sottile definito della superficie circonferenzale delle camere d'uovo. Il seguente protocollo descrive quindi come analizzare i segnali di actomiosina su scala tissutale (>50 cellule). Infine, abbiamo individuato i limiti di questi approcci sia per la rete cellulare locale che per i tessuti e discutiamo del suo potenziale sviluppo futuro e delle possibili applicazioni.

Questo protocollo consente agli scienziati di studiare il comportamento delle reti di actomyosina nei tessuti epiteliali. Ciò è possibile solo quando un'analisi dettagliata del comportamento dell'actomiosina su scala cellulare locale (alcune cellule) è combinata con un'analisi simile su scala tissutale (molte cellule). Tuttavia, i tessuti epiteliali sono spesso curvi e l'estrazione di uno strato sottile di questi tessuti in precedenza non era facilmente possibile, come mostrato nelle c...

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Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Questo protocollo fornisce una metodologia fiji-friendly insieme a semplici istruzioni che spiegano come analizzare in modo affidabile il comportamento dell'actomyosina nelle singole cellule e nei tessuti epiteliali curvi. Non sono richieste competenze di programmazione per seguire il tutorial; tutti i passaggi vengono eseguiti in modo semi-interattivo utilizzando l'interfaccia utente grafica delle Fiji e dei plugin associati.

Analisi delle dinamiche di Actomyosin su scale cellulari e tissutali locali utilizzando film time-lapse di camere d'uovo di Drosophila coltivate

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Il nostro protocollo aiuta gli scienziati ad analizzare la rete di actomiosina subcellulare nelle singole cellule epiteliali e consente loro anche di eseguire analisi simili su scala multicellulare nei tessuti epiteliali curvi. Il nostro protocollo è un bell'esempio di applicazione Fiji. Ha un'interfaccia utente grafica intuitiva e non richiede alcuna conoscenza dello scripting.Pertanto, è altamente adatto anche agli utenti alle prime armi sul campo. Sebbene il nostro metodo sia stato sviluppato per le camere delle uova Drosophila, è applicabile anche al di fuori della Drosophila epithelia. Incoraggiamo gli scienziati a testare il nostro protocollo nei loro sistemi modello.Utilizzare i file di test accompagnati per familiarizzare con questo protocollo. Ti aiuterà a decidere quale parte di questo protocollo è adatta alla tua domanda di ricerca individuale. Questa parte del protocollo consente agli utenti di segmentare le cellule epiteliali nei filmati time-lapse e successivamente analizzare gli impulsi di actomiosina nelle singole cellule nel tempo utilizzando Surface Manager.Per iniziare, aprire Fiji e importare la macro TissueCellSegmentMovie. ijm come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Quindi, aprite un file TIFF corretto per la candeggina e dividete i canali del file corretto per la candeggina andando alla barra dei menu, selezionando Immagine, seguita da Colore e dividi canali.Eseguire lo script caricato sul canale della membrana cellulare attiva del filmato time-lapse selezionato premendo l'icona Esegui nello script aperto. Per ottenere una bella maschera cella, impostare la sfocatura gaussiana su 2.500 e la sensibilità di rilevamento delle celle su meno uno e fare clic su OK. Quindi, impostare la tolleranza al rumore stimata tra 10 e 20 per i filmati time-lapse acquisiti con l'obiettivo 63x e fare clic su OK. Una maschera di cella generata viene visualizzata nel filmato time-lapse analizzato, viene visualizzata una nuova finestra chiamata ParticleStack e viene visualizzata anche una piccola finestra chiamata Action Required. Dalla maschera di cella del filmato time-lapse, concentrati solo sulle celle al centro e seleziona quelle in grado di fornire contorni completi e ben definiti durante il filmato time-lapse.Quando le celle selezionate al centro corrispondono bene alle membrane cellulari reali, salvare ParticleStack come file TIFF. Aprire il file TIFF ParticleStack corrispondente nelle Figi. Con il plug-in Surface Manager installato nelle Fiji, apri il plug-in.In Surface Manager fare clic sul pulsante Leggi immagine struttura e impostare l'indice Jaccard su 60%Il caricamento dei contorni può richiedere diversi minuti a seconda del numero di celle. Una volta caricata, a ciascuna cella verrà assegnato un numero S e verrà visualizzata nella parte sinistra della finestra di Surface Manager. Fare clic sul numero S selezionato in modo che il contorno della cella importato da ParticleStack1.tiff appare nel film time-lapse. Controllare ogni numero S importato per la qualità del contorno delle celle durante il filmato e rimuovere le celle indesiderate che visualizzano contorni di cella errati. Per rimuovere una cella indesiderata, evidenziare il contorno della cella e fare clic sul pulsante Elimina.Usare lo strumento Pennello per correggere i contorni delle celle. Al termine, salvare le celle corrette come RoiSet. zip.Per identificare se gli impulsi di actomiosina sono presenti nel tessuto analizzato e per comprendere il comportamento dettagliato, così come la direzionalità dei segnali di actomiosina, iniziare aprendo fiji. Aprire un filmato time-lapse, caricare particlestack1 salvato. tiff cell mask e il filmato time-lapse corretto per la candeggina, quindi caricare il plug-in Surface Manager e la corrispondente area di interesse dal RoiSet.zip. Successivamente, in Surface Manager, attivare un canale con segnali di interesse. Fare clic sul pulsante Statistiche per ottenere la finestra denominata Valore grigio medio Sezione per sezione.Le intensità media e mediane dei segnali di actomiosina saranno visualizzate nel tempo in unità arbitrarie, così come altri parametri relativi all'area e alla forma della cellula. Salvare i valori come file di foglio di calcolo andando alla finestra Statistiche, facendo clic su File e selezionando Salva con nome. Questa parte del protocollo consente agli utenti di estrarre selettivamente un sottile strato di actomiosina nel tessuto epiteliale curvo nel tempo.Questi passaggi sono intuitivi e basati su un'interfaccia grafica intuitiva. Aprire Fiji e assicurarsi che sia installato il plug-in Proiezione superficie ellissoide. Quindi, aprire un filmato time-lapse ed esportarlo come file XML/HDF5 facendo clic su Plugins, scegliendo BigDataViewer e esporta immagine corrente come file XML/HDF5.Aprire quindi il file esportato in Proiezione superficie ellissoide andando a Plugins, facendo clic su BigDataViewer, seguito da Proiezione superficie ellissoide e selezionando file XML. Questo aprirà una nuova finestra con viste sagittali della camera delle uova e apparirà una finestra di dialogo per guidare l'utente attraverso l'elaborazione. La finestra di dialogo, denominata Proiezione ovaie, ha diverse schede.Nella prima scheda della finestra di dialogo, denominata riquadro delimitazione, definite i bordi x e y di una camera uovo nel filmato time-lapse insieme alla larghezza z del rettangolo di selezione e premete impostate. Le parti selezionate della camera delle uova sono evidenziate in rosa. Definire quindi le dimensioni dei BLOB di segnale nella scheda della finestra di dialogo denominata trova BLOB nella finestra Proiezione ovaie.Definire il sigma e il valore minimo di picco. Quindi, premere calcola per identificare i segnali di actomiosina, che appariranno come blob verdi. Riprovare questo passaggio con parametri diversi fino a trovare circa 100 punti.Identificare i segnali di actomiosina è un passo cruciale. Dipende dalla qualità del segnale e dalle dimensioni corrette dei BLOB rilevati. Se non ci sono macchie verdi visibili nell'immagine, il passaggio successivo non funzionerà.Per progettare l'ellissoide, continuare con la scheda denominata ellissoide fit. Impostare campioni casuali su 10.000, la distanza di taglio esterna/interna su uno a 10 e quindi fare clic su calcola. Successivamente, la scheda chiamata proiezione si aprirà automaticamente e consentirà la definizione dell'estrazione della superficie.Nella scheda proiezione impostare una distanza di proiezione minima e massima come larghezza dell'ellissoide desiderato. La distanza di proiezione minima e massima deve adattarsi in modo che la regione ellissoide definita rosa includa l'intero strato esterno della camera delle uova. Quindi, definire la distanza della fetta come una sola.Assicurarsi che la regione rosa dell'ellissoide con il con definito sulla camera delle uova sia visibile prima di premere il calcolo. Aiuta a valutare la qualità di una nuova vestibilità ellissoide. Impostare quindi una larghezza di output dell'ellissoide maggiore o uguale a 800 e un'altezza maggiore o uguale a 400.Quindi, impostate la durata dell'estrazione della superficie e scegliete una proiezione sferica o cilindrica. Se necessario, capovolgere Z e allineare il calcolo Y.Press per ottenere un'estrazione di superficie per entrambi i canali in nuove finestre denominate immagine. Regolare la luminosità e il contrasto delle finestre dell'immagine ottenute per poter vedere i segnali di actomiosina proiettati facendo clic su Immagine, andando a Regola e selezionando Luminosità/Contrasto.Se l'estrazione della superficie ha un bell'aspetto, salvare entrambi i canali separatamente come file TIFF. Inoltre, salvare il file della finestra Log per riferimento futuro su come è stata estratta la superficie di questa particolare camera a uovo. Quindi, unisci i canali con un codice colore preferito nelle Fiji e salva i risultati come file TIFF.Questo protocollo consente agli scienziati di indagare il comportamento delle reti di actomiosina nei tessuti epiteliali. Questo è possibile solo quando un'analisi dettagliata del comportamento dell'actomiosina su scala cellulare locale è combinata con un'analisi simile su scala tissutale. Qui sono mostrati esempi rappresentativi del comportamento dinamico della miosina II su scala cellulare locale e su scala tissutale per il controllo e le camere delle uova drosophila mutanti grass2.Sul singolo piano basale, la catena di luce regolatoria modificata verde dei segnali di miosina II si sposta perpendicolarmente all'asse anteriore-posteriore delle camere di controllo delle uova. Questa polarità si perde nelle camere delle uova mutanti fat2 e porta a impulsi di miosina II anisotropica, oscillazioni A livello di tessuto, la catena di luce regolatoria modificata verde della miosina II nel campione di controllo genera la forza sincronizzata necessaria per promuovere la rotazione epiteliale. Al contrario, l'epitelio follicolo di una camera uovo mutante grasso2 pulsa fortemente sul lato basale e non riesce a generare la forza sincronizzata necessaria per promuovere la rotazione epiteliale.In una sottile regione apicale della camera delle uova Drosophila, il mutante fat2 presenta anche un comportamento dinamico alterato della catena di luce regolatoria modificata verde della miosina II.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come analizzare una rete di actomiosina su scala locale e tissutale nelle camere delle uova drosophila usando fiji. Per ulteriori suggerimenti pratici e la risoluzione dei problemi, vedere la parte di discussione dopo il protocollo. Se hai domande relative alle Fiji o ai nostri plugin, consulta le rispettive pagine web o contattaci.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Ricerca

Biologia dello sviluppo

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