Name: analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers
Uploaded: 2019-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

저자는 셀레스트 버그 실험실에서 채택 된 접근 방식을 사용하여 계란 챔버의 체외 생활 이미징에 대한 그녀의 조언을 공유 미리암 오스터 필드에 매우 감사드립니다4. 우리는 또한 세포 세분화를 가능하게 피지 스크립트에 대한 세바스찬 토시에 감사드립니다.

참고: 다음 프로토콜은 국소 세포및 Drosophila 계란 챔버에서 조직 규모에서 actomyosin을 분석하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 로컬 스케일 접근법을 통해 사용자는 달걀 챔버 당 최대 15 개의 세포에서 상세한 actomyosin 거동을 분석할 수 있으며 고속 이미징과 반전 된 공초점 현미경을 사용하여 짧은 기간 (5-10 분) 동안 TLM을 수집해야합니다. 대조적으로, 조직 규모는 50-100 세포?...

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	<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).</li><li>Hudson, A. 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Surface manager Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager">https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager</a> (2018)</li><li>. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins">https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins</a> (2018)</li><li>. 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J., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+Breaking+in+an+Edgeless+Epithelium+by+Fat2-Regulated+Microtubule+Polarity.">Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity.</a> Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).</li><li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists.">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nature Methods. 12, 30-34 (2015).</li></ol>

계란 챔버의 해부 및 배양에 대한 중요한 단계 및 문제 해결
너무 많은 파리가 작은 유리병에 배치되는 경우, 플라이 푸드는 먹이 애벌레와 성인 파리가 플라이 푸드에 갇혀 점점 먹이 애벌레의 광범위한 양으로 인해 2-3 일 후 진흙 투성이를 설정할 수 있습니다. 이러한 경우, 이들의 나머지 는 신선한 음식과 새로운 유리병으로 파리를 뒤집고 자신의 수를 축소. ?...

생명 과학 분야의 응용 분야와 함께 새로운 이미징 및 소프트웨어 기술의 지속적인 발전은 삶의 기본 원리를 이해하는 데 엄청난 영향을 미쳤습니다. 주요 과제 중 하나는 다양한 조직에서 의 한 번의 생생한 이미징과 함께 개발 과정의 신뢰할 수 있는 시각화입니다. 조직은 기관 및 바디의 부분이고, 이와 같이, 대다수는 화상 진찰을 위해 쉽게 접근할 수 없습니다. 따라서, 그들의 해부 및 시험관 내 배양을 허용하는 프로토콜은 생체 내의 생체 내 상황을 충분히 반영하는 생물학적 사건을 시각화하기 위해 개발되었다.
지난 수십 년 동안, 초원성 기관 을 닮은 acinar 같은 구조, Drosophila 계란 챔버의 배양 및 라이브 이미징, 원시 장기 개발의 기본 원칙의 이해에 대단히 기여하고있다1 , 2개 , 3. 현재, 사용할 수있는 몇 가지 배양 프로토콜이 있으며, 그 사용은 수집 시간, 이미지 할 세포 유형 및 접근성 (예를 들어, 내부 생식선 대 외부 체세포 선)에 따라 달라집니다4.
이러한 모든 배양 프로토콜의 일반적인 특징은 액체 매체에서 높은 수축 활성을 나타내는 분석 된 계란 챔버의 고정에 대한 필요성입니다. 계란 챔버의 수축 활성은 주로 연결된 계란 챔버 5,6,7의긴 문자열을 덮는 근육 시트에 의해 발생합니다. 따라서, 젊은 계란 챔버의 적절한 고정을 달성하기 위해, 다양한 접근 방식은 커버립 6,8,9 또는 유연한 담요4,커버 립과 계란 챔버를 덮고 포함, 개발되었다. 도 10 또는 저융점 아가로즈3,11에포함. 이 접근은 또한 계란 약실의 원주 표면의 미묘한 평평하게 때문에 더 큰 시각적 인 비행기의 화상 진찰을 허용하기 때문에 대중적입니다.
그러나 최근에는 어린 난자 챔버(1-8단계)가 전방 후방 축 6을 중심으로 회전하고 이 조직 운동이 이 젊은 달걀 챔버의 원주 표면에 가까운 미세한 actomyosin 네트워크에 의해 구동되는 것으로 나타났습니다. 12. 따라서,이 조직의 미묘한 평탄화로 인한 세포 표면의 인공 적인 변화는 힘 생성 actomyosin 기계의 행동에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 카운터포인트는 난자 챔버 조직이 평평해지지 않으면, 계란 챔버의 원주 표면에 있는 단백질의 현미경 이미징이 획득 평면의 감소된 크기에 의해 더욱 제한된다는 것입니다.
따라서, 우리는 Prasad 등 에서 프로토콜을 결합9 셀레스트 버그의 실험실4,10 그리고 더 커버 슬립 / 유연한 담요 / 아가로즈가 개발 된 방법에 사용되지 않도록 그들을 수정. 초파리 난자 챔버는 자유롭게 배지에서 배양되며 여기에 제시된 프로토콜은 거꾸로 된 현미경 검사법만 적용합니다. 프로토콜에는 두 부분으로 구성됩니다. 첫 번째 부분은 계란 챔버 내에서 로컬 세포 규모 (최대 15 세포)에서 actomyosin 신호의 분석에 초점을 맞추고있다. 두 번째 부분에서는 계란 챔버의 자유로운 배양으로 인한 작은 획득 평면과 관련된 한계를 극복하는 데 중점을 둡니다. 이와 관련하여, 우리는 선택적으로 추출하고 원주 조직 표면의 정의 층을 전개 반 대화 형 그래픽 사용자 인터페이스와 새로운 피지 기반의 계산 방법을 개발했다. 이것은 조직 규모 (즉, >50 세포)에서 actomyosin을 분석하는 방법을 설명하는 프로토콜에 의해 뒤따른다. 고전적 z-stack 프로젝션(도 1)을 사용하여 정의된 얇은 층의 정의된 얇은 층의 선택적 추출이 용이하지 않았기 때문에,이 사용하기 쉬운 방법은 포괄적으로 이해하기 위한 중요한 전제 조건으로 작용하여 초파리 난자 챔버의 조직 규모에서 얇은 (&1 μm) 아토미오신 네트워크의 행동.
또한, 프로토콜을 용이하게 하기 위해, 우리는 형광태그가 지정된 비근육 종래의 Myosin II 동작의 예시 타임랩스 영화(TLM) 및 샘플 파일을 제공한다(보충 파일 3참조). 묘신 II는 모터 단백질이며 아토미오신 기계의 활성 수축 부위를 나타낸다. Myosin II를 이미지화하기 위해, 우리는 MRLC라는 Myosin II의 수정 된 조절 광체인을 포함하는 Drosophila 형질 전환 라인을 사용합니다 ::GFP (자세한 내용은 재료 표 참조)12,13. 세포막을 시각화하기 위해, 프로토콜은 상업적 염료를 기반으로 한다(재료 표참조). 이 프로토콜은 작은 세포내 MRLC의 분석뿐만 아니라 12:GFP 신호12뿐만 아니라 생명법으로 관찰된 것과 같은 ±300 μM 정도의 유사한 크기의 세포내 입자에도 적합합니다::GFP12,14.
이러한 두 프로토콜은 시험관 내 배양 Drosophila 난자 챔버를 사용하여 제시되지만, actomyosin 신호의 취득은 또한 배양 매체의 최적화및 가용성에 따라 다른 조직을 사용하여 수행 될 수있다 상응하는 상용 염료를 가진 형광태그된 단백질 또는, 예를 들어, 일시적인 유전자 발현 단면도를 얻기 위하여 mRNA 미세 주사. 유사하게, 원주 표면으로부터 얇은 층을 추출하기 위한 피지 계 프로토콜은 타원 및 장기 유사 조직에 보다 일반적으로 적용될 수 있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schneider Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720-024</td>
			<td>[+]-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#160;[+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 &#181;g/ml Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;F135</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Solution Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033NS</td>
			<td>33 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td></td>
			<td>&#160;#55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Deep Red (cell membrane dye)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64 (cell membrane dye)</td>
			<td>ThermoFisher/Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression dissection slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-560B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steromicroscope</td>
			<td>e.g. Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi SV 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic glass/cover glass</td>
			<td>e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wironit needle holder</td>
			<td>Hammacher</td>
			<td>9160020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus spine</td>
			<td>Echinocactus grusonii/barrel cactus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila stocks used in the manuscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers

초파리 미성숙 계란이라고 하는 계란 챔버, 그리고 그들의 구조는 개발 하는 동안 타원형 모양에 둥근에서 형태 변화를 겪는 원시 장기를 닮은. 이 발달 과정은 oogenesis에게 불리고 다음 플라이 세대를 확보하기 위하여 기능적인 성숙한 계란을 생성하는 것이 중요합니다. 이러한 이유로, 계란 챔버동물 장기 발달을 이해하는 이상적이고 관련 있는 모형으로 봉사했습니다.
몇몇 시험관 내 배양 프로토콜이 개발되었지만, 이러한 프로토콜에는 몇 가지 단점이 있다. 하나는 그들을 고정하고 분석 된 계란 챔버의 원주 표면의 이미지 획득 평면을 증가시키기 위해 이미지 계란 챔버에 인공 압력을 가하는 다양한 커버의 적용을 포함한다. 이러한 접근법은 더 긴 축을 중심으로 계란 챔버를 회전시키는 힘을 생성하는 얇은 아토미오신 기계의 거동에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
따라서, 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 알 챔버의 둘레를 따라 아토미오신 기계를 안정적으로 분석하기 위해 배지에서 Drosophila 난자 챔버를 자유롭게 배양한다. 프로토콜의 첫 번째 부분에서는 로컬 셀룰러 스케일(최대 15셀)에서 제한된 획득 평면에서 actomyosin 기계를 분석하는 방법을 자세히 설명하는 매뉴얼을 제공합니다. 프로토콜의 두 번째 부분에서, 우리는 계란 챔버의 원주 표면의 정의 된 얇은 층의 간단한 추출을 허용 하는 새로운 피지 기반 플러그인을 사용자에 게 제공. 다음 프로토콜은 조직 규모에서 actomyosin 신호를 분석하는 방법을 설명합니다 (>50 세포). 마지막으로, 우리는 현지 세포 및 조직 규모 둘 다에 있는 이 접근의 한계를 찾아내고 그것의 잠재적인 미래 발달 및 가능한 응용을 토론합니다.

이 프로토콜은 과학자가 상피 조직에서 actomyosin 네트워크의 행동을 조사할 수 있게 합니다. 이것은 국소 세포 규모 (몇몇 세포)에서 actomyosin 행동의 상세한 분석이 조직 규모 (많은 세포)에서 유사한 분석과 결합될 때만 가능합니다. 그러나, 상피 조직은 종종 구부러지고 이들 조직의 얇은 층의 추출은 이전에 는 Drosophila 난자 챔버에 나타난 바와 같이 쉽게 불가능하?...

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Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

이 프로토콜은 개별 세포 및 곡선 상피 조직에서 actomyosin 행동을 안정적으로 분석하는 방법을 설명하는 간단한 지침과 함께 피지 기반의 사용자 친화적 인 방법론을 제공합니다. 자습서를 따르기 위해 프로그래밍 기술이 필요하지 않습니다. 모든 단계는 피지와 관련 플러그인의 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 반 대화 형 방식으로 수행됩니다.

배양 된 초파리 계란 챔버의 시간 경과 영화를 사용하여 로컬 세포 및 조직 저울에서 Actomyosin 역학분석

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

우리의 프로토콜은 과학자들이 개별 상피 세포에서 세포 전균 성 악수 망을 분석하는 데 도움이되며 곡선상피 조직에서 다세포 척도에서 유사한 분석을 수행 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 피지 응용 프로그램의 좋은 예입니다. 직관적인 그래픽 사용자 인터페이스를 가지고 있으며 스크립팅에 대한 지식이 필요하지 않습니다.따라서 현장의 초보 사용자에게도 매우 적합합니다. 우리의 방법은 Drosophila 계란 챔버를 위해 개발되었지만, 그것은 또한 Drosophila 상피 외부에 적용 할 수 있습니다. 우리는 과학자들이 모델 시스템에서 프로토콜을 테스트할 것을 권장합니다.동반된 테스트 파일을 사용하여 이 프로토콜에 익숙해. 이 프로토콜의 어느 부분이 개별 연구 질문에 적합한지 결정하는 데 도움이 됩니다. 프로토콜의이 부분은 사용자가 시간 경과 영화에서 상피 세포를 분할하고 이후 Surface Manager를 사용하여 시간이 지남에 따라 개별 세포에서 actomyosin 펄스를 분석 할 수 있습니다.시작하려면 피지를 열고 매크로 티슈셀세그먼트무비(TissueCellSegmentMovie)를 가져옵니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 ijm입니다. 그런 다음 표백제 수정 TIFF 파일을 열고 메뉴 모음으로 이동하여 이미지를 선택하고 색상 다음에 색상을 선택하고 분할 채널을 선택하여 표백제 수정 된 파일의 채널을 분할합니다.아이콘 실행은 열린 스크립트에서 실행아이콘을 눌러 선택한 시간 경과 영화의 활성 셀 멤브레인 채널에서 업로드된 스크립트를 실행합니다. 좋은 세포 마스크를 얻으려면 Gaussian 블러를 2.500으로 설정하고 셀 검출 감도를 뺀 값으로 설정하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 63x 목표로 획득한 시간 경과 영화의 경우 10~20개의 예상 노이즈 허용 오차를 설정하고 확인을 클릭합니다. 생성된 셀 마스크가 분석된 시간 경과 동영상에 나타나고, ParticleStack이라는 새 창이 나타나고, 작업 필요라는 작은 창도 나타납니다. 타임랩스 영화의 셀 마스크에서 중앙의 셀에만 초점을 맞추고 시간 경과 영화 전반에 걸쳐 완전하고 잘 정의된 윤곽선을 제공할 수 있는 간략하게 선택합니다.중앙에 있는 선택된 셀이 실제 세포막에 잘 대응하는 경우, ParticleStack을 TIFF 파일로 저장합니다. 피지에서 해당 ParticleStack TIFF 파일을 엽니다. 피지에 설치된 표면 관리자 플러그인으로, 플러그인을 엽니 다.Surface Manager에서 읽기 개요 이미지 단추를 클릭하고 Jaccard 인덱스를 60%로 설정하면 윤곽선을 셀 수에 따라 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 로드되면 각 셀에 S 번호가 할당되고 Surface Manager 창의 왼쪽 부분에 나타납니다. 선택한 S 번호를 클릭하여 ParticleStack1에서 가져온 셀 윤곽선을 클릭합니다.티프는 타임랩스 영화에 나타납니다. 가져온 각 S 번호를 동영상 전체의 셀 윤곽선 품질에 대 한 확인 하 고 잘못 된 셀 윤곽을 표시 하는 원치 않는 셀을 제거 합니다. 원치 않는 셀을 제거하려면 셀 윤곽선을 강조 표시하고 삭제 버튼을 클릭합니다.브러시 도구를 사용하여 셀 윤곽선을 수정합니다. 완료되면 수정된 셀을 RoiSet으로 저장합니다. 지퍼 파일.actomyosin 펄스가 분석된 조직에 존재하는지 확인하고 상세한 행동, 뿐만 아니라 actomyosin 신호의 방향성을 이해하기 위하여, 피지를 여는 것으로 시작합니다. 시간 경과 동영상을 열고 저장된 ParticleStack1을 로드합니다. 티프 셀 마스크와 표백제 보정 된 시간 경과 영화, 다음 표면 관리자 플러그인 및 RoiSet에서 관심의 해당 영역을로드합니다.지퍼 파일. 다음으로 Surface Manager에서 관심 있는 신호가 있는 채널을 활성화합니다. 통계 버튼을 클릭하여 평균 회색 값 슬라이스라는 창을 슬라이스별로 가져옵니다.actomyosin 신호의 평균 및 중앙값 은 셀의 영역 및 모양과 관련된 다른 매개 변수뿐만 아니라 임의 단위로 시간이 지남에 따라 표시됩니다. 통계 창으로 이동하여 값을 스프레드시트 파일로 저장하고, 파일을 클릭하고, Save As.Similarly를 선택하고, 셀 마스크를 생성하고, 조직 척도에서 actomyosin 펄스를 분석하기 위해 Surface Manager에 로드합니다. 프로토콜의이 부분은 사용자가 선택적으로 시간이 지남에 따라 곡선 상피 조직에서 actomyosin의 얇은 층을 추출 할 수 있습니다.이러한 단계는 사용자 친화적이며 직관적인 그래픽 인터페이스를 기반으로 합니다. 피지를 열고 타원지대 표면 프로젝션 플러그인이 설치되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 타임랩스 영화를 열고 플러그인을 클릭하고 BigDataViewer로 이동하여 XML/HDF5 파일로 내보내기 현재 이미지를 XML/HDF5 파일로 선택하여 XML/HDF5 파일로 내보냅니다.다음으로 플러그인으로 이동하여, 빅데이터뷰어를 클릭하고, 타원지대 표면 프로젝션을 클릭하고 XML 파일을 선택하여 타원성 표면 프로젝션에서 내보낸 파일을 엽니다. 이렇게 하면 계란 챔버의 면각이 있는 새 창이 열리고 처리를 통해 사용자를 안내하는 대화 상자가 나타납니다. 난소 투영이라고 하는 대화 창에는 여러 탭이 있습니다.경계 상자라고 하는 첫 번째 대화 상자 탭에서 타임랩스 동영상의 계란 챔버의 x 및 y 테두리를 경계 상자의 z 너비와 함께 정의하고 세트를 누릅니다. 계란 챔버의 선택한 부분은 분홍색으로 강조 표시됩니다. 다음으로 난소 투영 창에서 Blob 찾기라는 대화 상자 탭에서 신호 Blob의 크기를 정의합니다.시그마와 최소 피크 값을 정의합니다. 그런 다음 컴퓨팅을 눌러 녹색 Blob으로 나타나는 actomyosin 신호를 식별합니다. 약 100개의 반점이 발견될 때까지 다른 매개 변수로 이 단계를 다시 시도합니다.actomyosin 신호를 식별하는 것은 중요한 단계입니다. 신호 품질과 감지된 Blob의 정확한 크기에 따라 달라집니다. 이미지에 표시녹색 반점이 없는 경우 다음 단계가 작동하지 않습니다.타원을 디자인하려면 핏 타원이라고 불리는 탭을 계속 합니다. 임의 샘플을 10, 000으로 설정하고 외부/내부 차단 거리를 1대 10으로 설정한 다음 계산을 클릭합니다. 이 후 프로젝션이라는 탭이 자동으로 열리고 표면 추출의 정의를 허용합니다.투영 탭에서 원하는 타원의 너비로 최소 및 최대 투영 거리를 설정합니다. 최소한의 최대 투영 거리가 적합해야 하며 분홍색 정의 타원 영역은 계란 챔버의 전체 외부 층을 포함합니다. 그런 다음 슬라이스 거리를 하나로 정의합니다.알챔버에 정의된 타원의 분홍색 영역이 계산을 누르기 전에 볼 수 있는지 확인합니다. 그것은 새로운 타원 적합의 품질을 평가하는 데 도움이됩니다. 다음으로 타원성의 출력 폭을 800보다 크거나 같고 400보다 크거나 동일한 높이를 설정합니다.그런 다음 표면 추출 의 지속 시간을 설정하고 구형 또는 원통 투영중 하나를 선택합니다. 필요한 경우 Z를 뒤집고 Y.Press 계산을 정렬하여 이미지라는 새 창의 두 채널에 대한 표면 추출을 얻습니다. 이미지를 클릭하고 조정하고 밝기/대비를 선택하여 투영된 actomyosin 신호를 볼 수 있도록 획득한 이미지 창의 밝기와 대비를 조정합니다.표면 추출이 좋으면 두 채널을 TIFF 파일로 별도로 저장합니다. 또한 이 특정 계란 챔버의 표면이 추출된 방법에 대한 향후 참조를 위해 로그 창 파일을 저장합니다. 그런 다음 피지에서 선호하는 색상 코드로 채널을 병합하고 결과를 TIFF 파일로 저장합니다.이 프로토콜은 과학자들이 상피 조직에서 actomyosin 네트워크의 행동을 조사 할 수 있습니다. 이것은 국소 세포 규모에 있는 actomyosin 행동의 상세한 분석이 조직 규모에 유사한 분석과 결합될 때만 가능합니다. 여기에 는 국소 세포 척도및 지방 2 돌연변이 Drosophila 계란 챔버에 대한 조직 척도에서 동적 myosin II 행동의 대표적인 예입니다.기저 단일 평면에서, 미오신 II 신호의 녹색 변형 된 조절 광 체인은 제어 계란 챔버의 전방 후방 축에 수직이동합니다. 이러한 극성은 fat2 돌연변이 계란 챔버에서 손실되고 anisotropic myosin II 펄스, 조직 수준에서 진동, 대조군 샘플에서 myosin II의 녹색 변형 된 조절 광 사슬로 이어지는 상피 회전을 촉진하는 데 필요한 동기화 된 힘을 생성한다. 대조적으로, fat2 돌연변이 계란 챔버의 여포 상피는 기저측에서 강하게 펄스하고 상피 회전을 촉진하는 데 필요한 동기화 된 힘을 생성하지 못합니다.Drosophila 계란 챔버의 얇은 apical 영역에서, fat2 돌연변이는 또한 myosin II의 녹색 수정 된 규제 라이트 체인의 변경 된 동적 거동 행동을 제시.이 비디오를 시청 한 후, 당신은 피지를 사용하여 드로소필라 계란 챔버에서 로컬 및 조직 규모에서 actomyosin 네트워크를 분석하는 방법의 좋은 아이디어를 가져야한다. 보다 실용적인 팁과 문제 해결을 위해 프로토콜 후 토론 부분을 참조하십시오. 당신은 피지 또는 우리의 플러그인과 관련된 질문이있는 경우, 각각의 웹 페이지를 참조하거나 저희에게 연락.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

의 수직 이미지<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 챔버

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

연구

발생학

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

시간 경과 브라이트 실체 현미경으로 Zebrafish의 애벌레에서 조직 복구를 캡처

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

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에서 이미징 칼슘<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 활성화에

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

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<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 방법 배양 된 쥐 장간막 미세 혈관 네트워크의 타임 랩스 영상에 대한

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

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Vasculogenesis의 운동 분석 역학 Vasculogenesis 및 신생에서 생체 외에서 의 단정

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

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Vivo에서 근육-힘 줄 Morphogenesis 초파리 번데기에의 이미징

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

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푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...