Name: analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers
Uploaded: 2019-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

Forfatterne er svært takknemlig til Miriam Osterfield for å dele sine råd om in vitro livet Imaging av egg kamre ved hjelp av en tilnærming vedtatt fra Celeste Berg laboratoriet4. Vi takker også Sebastian Tosi for Fiji script som muliggjør celle segmentering.

Merk: Følgende protokoll gir instruksjoner om hvordan å analysere actomyosin på det lokale mobilnettet og vevet skala i Drosophila egg kamre. Det innenbys-skalaen adgang innrømmer brukernes å analysere detaljert actomyosin opptreden inne til 15 celler per eggkammeret og behøver oppkjøpet av TLMs for en kort perioden (5 – 10 min) av benytter høy-fart tenkelig og en invertert konfokalmikroskopi mikroskop. I kontrast gir vevs vekten brukerne actomyosin informasjon i 50 – 100 celler og k...

<ol>
	<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).</li><li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+oogenesis.">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68, 207-217 (2014).</li><li>Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Ovaries.">Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries.</a> Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).</li><li>Peters, N. C., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Culturing+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Egg+Chambers:+A+History+and+Adaptable+Method.">In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method.</a> Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).</li><li>Spradling, A. C., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Genetics+of+Oogenesis.">Developmental Genetics of Oogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. , 1-70 (1993).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331, 1071-1074 (2011).</li><li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila.">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development. 143, 1375-1387 (2016).</li><li>Pokrywka, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+GFP-labeled+proteins+in+Drosophila+oocytes.">Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50044 (2013).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bullwinkle+is+required+for+epithelial+morphogenesis+during+Drosophila+oogenesis.">bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).</li><li>Cetera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+rotation+promotes+the+global+alignment+of+contractile+actin+bundles+during+Drosophila+egg+chamber+elongation.">Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation.</a> Nature Communications. 5, 5511 (2014).</li><li>Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+rotation+is+preceded+by+planar+symmetry+breaking+of+actomyosin+and+protects+epithelial+tissue+from+cell+deformations.">Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations.</a> PLOS Genetics. 13, e1007107 (2017).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+polarized+actomyosin+contractile+flows+control+epithelial+junction+remodelling.">Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling.</a> Nature. 468, 1110-1114 (2010).</li><li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis.">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).</li><li>. Surface manager Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager">https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager</a> (2018)</li><li>. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins">https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins</a> (2018)</li><li>. BigDataViewer Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/BigDataViewer">https://imagej.net/BigDataViewer</a> (2017)</li><li>Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigDataViewer:+visualization+and+processing+for+large+image+data+sets.">BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets.</a> Nature Methods. 12, 481-483 (2015).</li><li>Turner, C. M., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons+in+the+morphogenesis+of+epidermal+hairs+during+wing+development+in+Drosophila.">Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila.</a> Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).</li><li>Heemskerk, I., Streichan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cartography:+compressing+bio-image+data+by+dimensional+reduction.">Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction.</a> Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).</li><li>Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+Breaking+in+an+Edgeless+Epithelium+by+Fat2-Regulated+Microtubule+Polarity.">Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity.</a> Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).</li><li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists.">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nature Methods. 12, 30-34 (2015).</li></ol>

Kritiske trinn og feilsøking for disseksjon og dyrking av egg kamre
Hvis for mange fluer er plassert i et lite hetteglass, kan fly mat slå gjørmete etter 2-3 dager på grunn av omfattende mengder fôring larver og voksne fluer får fanget i fly mat. I et slikt tilfelle, Vend resten av disse fluene inn i en ny hetteglass med fersk mat og downsize deres antall. Spesielt utelukke kvinner som ble sittende fast i maten.
Schneider mix (SM) bør tilbere...

Den kontinuerlige utviklingen av romanen bilde-og programvare teknologier med programmer i biovitenskap har gitt en enorm innvirkning på forståelsen av livets grunnleggende prinsipper. En av hovedutfordringene er den pålitelige visualiseringen av utviklingsprosesser i kombinasjon med deres Live Imaging i ulike vev. Vev er deler av organer og organer, og som sådan, de fleste er ikke lett tilgjengelig for Imaging. Derfor er protokoller som tillater at deres disseksjon og in vitro-dyrking er utviklet for å visualisere biologiske hendelser som tilstrekkelig reflekterer in vivo-situasjonen i et levende legeme.
I løpet av de siste ti årene, dyrking og live Imaging av Drosophila egg kamre, acinar strukturer som likner primitive organer, har bidratt umåtelig til forståelsen av de grunnleggende prinsippene for primitive orgel utvikling1 , 2 andre priser , 3. for tiden er det flere dyrking protokoller tilgjengelig, og deres bruk avhenger av oppkjøpet tid, celle type som skal avbildet, og deres tilgjengelighet (f. eks indre germline g. ytre somatiske linje)4.
En vanlig funksjon i alle disse dyrking protokollene er behovet for immobilisering av analysert egg kamre som viser en høy kontraktile aktivitet i flytende Media. Den kontraktile aktivitet av egg Chambers er forårsaket hovedsakelig av muskelen ark som dekker en lang rekke koblet egg Chambers5,6,7. Derfor, for å oppnå riktig immobilisering av unge egg kamre, har ulike tilnærminger er utviklet, som involverer dekker egg kamre med coverslips6,8,9 eller fleksible tepper4, 10 eller bygge dem inn i lav-smelte-punkt agarose3,11. Disse tilnærmingene er populære som de også tillate Imaging av en større visuell planet på grunn av subtile flatere av circumferential overflaten av egg kamre.
Men nylig har det vist seg at unge egg kamre (etappe 1-8) roterer rundt deres fremre-bakre akse6 og at dette vevet bevegelse er drevet av en fin actomyosin nettverk nær circumferential overflaten av disse unge egg kamre 12. derfor kan kunstig endring av mobilnettet overflaten skyldes en subtil flatere av dette vevet har en negativ innvirkning på atferden til kraft-generering actomyosin maskiner. Kontrapunkt er at hvis egget kammer vevet ikke slås sammen, blir mikroskopisk bilde av proteiner på circumferential overflate av egg kamre enda mer begrenset av den reduserte størrelsen på oppkjøpet flyet.
Derfor har vi kombinerte protokoller fra Prasad et al.9 og laboratoriet av Celeste Berg4,10 og ytterligere modifisert dem slik at ingen dekkglass/fleksibelt teppe/agarose brukes i den utviklede metoden. Drosophila egg kamre er fritt kultivert i Media og protokollen som presenteres her gjelder bare invertert mikroskopi. Det er to deler til protokollen. Den første delen er fokusert på analyse av actomyosin signaler på den lokale mobilnettet skala (opptil 15 celler) i egg kamre. I den andre delen, fokuserer vi på å overvinne begrensningene forbundet med et lite oppkjøp fly forårsaket av den frie dyrking av egg kamre. I denne forbindelse har vi utviklet en roman Fiji-baserte beregningsorientert metode med en semi-interaktivt grafisk brukergrensesnitt som selektivt ekstrakter og utfolder definerte lag av en circumferential vev overflaten. Dette etterfølges av en protokoll som beskriver hvordan man analyserer actomyosin på vevs vekten (dvs. > 50 celler). Som selektiv ekstraksjon av et definert tynt lag av buet epitel vev har ikke vært lett mulig å bruke en klassisk z-stack projeksjon (figur 1), denne lett-å-bruke metoden fungerer som en viktig forutsetning for å omfattende forstå atferden til en tynn (< 1 μm) actomyosin nettverk på vevet skala i Drosophila egg kamre.
I tillegg, for å lette protokollen, tilbyr vi eksempel tidsforløp filmer (TLMs) og eksempel filer av fluorescensmerkete tagget nonmuscle konvensjonelle myosin II-atferd (se tilleggsfil 3). Myosin II er et motor protein og representerer den aktive kontraktile delen av actomyosin maskineri. For å image myosin II bruker vi Drosophila transgene Lines som inneholder en modifisert regulatoriske lys kjede av myosin II kalt MRLC:: GFP (se tabell over materialer for detaljer)12,13. For å visualisere cellemembraner, er protokollen basert på kommersielle fargestoffer (se tabell over materialer). Denne protokollen er egnet ikke bare for analyse av små subcellulære MRLC:: GFP signaler12 , men også for alle lignende store subcellulære partikler rundt ± 300 μM, slik som de som er observert med Life-Act:: GFP12,14.
Selv om begge disse protokollene er presentert med in vitro kultivert Drosophila egg kamre, kan oppkjøpet av actomyosin signaler også utføres ved hjelp av andre vev på optimalisering av dyrking Media og avhengig av tilgjengelighet av enten fluorescensmerkete merkede proteiner med tilsvarende kommersielle fargestoffer eller, for eksempel, mRNA microinjections å få forbigående gen uttrykks profiler. På samme måte kan den Fiji-baserte protokollen for ekstraksjon av et tynt lag fra en circumferential overflate brukes mer generelt til ellipsoiden vev.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schneider Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720-024</td>
			<td>[+]-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#160;[+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 &#181;g/ml Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;F135</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Solution Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033NS</td>
			<td>33 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td></td>
			<td>&#160;#55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Deep Red (cell membrane dye)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64 (cell membrane dye)</td>
			<td>ThermoFisher/Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression dissection slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-560B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steromicroscope</td>
			<td>e.g. Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi SV 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic glass/cover glass</td>
			<td>e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wironit needle holder</td>
			<td>Hammacher</td>
			<td>9160020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus spine</td>
			<td>Echinocactus grusonii/barrel cactus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila stocks used in the manuscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers

Drosophila umodne egg kalles egg kamre, og deres struktur ligner primitive organer som gjennomgår morfologiske endringer fra en runde til en ellipsoiden form under utvikling. Denne utviklingsmessige prosessen kalles oogenese og er avgjørende for å generere funksjonelle modne egg for å sikre neste fly generasjon. Av disse grunner har egg kamre fungert som en ideell og relevant modell for å forstå dyr orgel utvikling.
Flere in vitro dyrking protokoller er utviklet, men det er flere ulemper til disse protokollene. En innebærer anvendelse av ulike deksler som utøver et kunstig press på avbildet egg kamre for å nakkens dem og å øke avbildet oppkjøpet flyet av circumferential overflaten av analysert egg kamre. En slik tilnærming kan negativt påvirke atferden til den tynne actomyosin maskiner som genererer makt til å rotere egg kamre rundt deres lengre akse.
Derfor, for å overvinne denne begrensningen, kultur vi Drosophila egg kamre fritt i media for å pålitelig analysere actomyosin maskiner langs omkretsen av egg kamre. I den første delen av protokollen, gir vi en manuell detaljering hvordan å analysere actomyosin maskiner i et begrenset oppkjøp flyet på den lokale mobilnettet skala (opptil 15 celler). I den andre delen av protokollen, gir vi brukerne en ny Fiji-basert plugin som gjør det mulig for enkel ekstraksjon av et definert tynt lag av egg kamre ' circumferential overflate. Følgende protokoll beskriver deretter hvordan du analyserer actomyosin signaler på vevs vekten (> 50 celler). Til slutt, vi finne begrensningene i disse tilnærmingene på både den lokale cellulære og vev skalaer og diskutere sin potensielle fremtidige utvikling og mulige anvendelser.

Denne protokollen gjør det mulig for forskere å undersøke atferden til actomyosin nettverk i epitel vev. Dette er bare mulig når en detaljert analyse av actomyosin atferd på den lokale mobilnettet skala (noen få celler) er kombinert med en lignende analyse på vev skala (mange celler). Men epitel vev er ofte buet og ekstraksjon av et tynt lag av disse vev var tidligere ikke lett mulig, som vist i Drosophila egg kamre (figur 1). Protokollen som ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Denne protokollen gir en Fiji-basert, brukervennlig metodikk sammen med enkle instruksjoner som forklarer hvordan du pålitelig analysere actomyosin atferd i individuelle celler og buet epitel vev. Ingen programmeringskunnskaper kreves for å følge opplæringen; alle trinnene utføres i en semi-interaktiv måte ved hjelp av det grafiske brukergrensesnittet i Fiji og tilhørende plugins.

Analyse av Actomyosin Dynamics på lokale Cellular og tissue skalaer bruke time-lapse Movies of kultivert Drosophila egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Vår protokoll hjelper forskere med å analysere subcellulært actomyosin-nettverk i individuelle epitelceller og tillater dem også å utføre lignende analyse i flercellet skala i buet epitelvev. Vår protokoll er et fint eksempel på en Fiji-applikasjon. Den har et intuitivt grafisk brukergrensesnitt, og det krever ingen kunnskap om skripting.Derfor er det svært egnet også for nybegynnere i feltet. Selv om vår metode ble utviklet for Drosophila eggkamre, er det også aktuelt utenfor Drosophila epithelia. Vi oppfordrer forskere til å teste vår protokoll i sine modellsystemer.Bruk de med fulgte testfilene for å bli kjent med denne protokollen. Det vil hjelpe deg å bestemme hvilken del av denne protokollen som passer for ditt individuelle forskningsspørsmål. Denne delen av protokollen gjør det mulig for brukere å segmentere epitelceller i tidsforløpsfilmer og deretter analysere actomyosin pulser i individuelle celler over tid ved hjelp av Surface Manager.Du kan begynne, åpne Fiji og importere makroen TissueCellSegmentMovie. som beskrevet i den medfølgende tekstprotokollen. Deretter åpner du en blekemiddelkorrigert TIFF-fil, og deler kanalene til den blekemiddelkorrigerte filen ved å gå til menylinjen, velge Bilde, etterfulgt av Farge og velge Delte kanaler.Kjør det opplastede skriptet på den aktive cellemembrankanalen i den valgte tidsforløpsfilmen ved å trykke på ikonet Kjør i det åpne skriptet. For å få en fin cellemaske, sett gaussisk uskarphet til 2.500 og celledeteksjonsfølsomheten til minus en, og klikk OK. Deretter angir du den estimerte støytoleransen mellom 10 og 20 for time-lapse-filmer som er anskaffet med 63x-målet, og klikker OK. En generert cellemaske vises i den analyserte tidsforløpsfilmen, et nytt vindu kalt ParticleStack vises, og et lite vindu kalt Handling kreves vises også. Fokuser bare på celler i midten fra cellemasken på tidsforløpsfilmen, og velg de som kan gi fullstendige og veldefinerte konturer gjennom tidsforløpsfilmen.Når de valgte cellene i midten samsvarer pent med de virkelige cellemembranene, lagrer du ParticleStack som en TIFF-fil. Åpne den tilsvarende ParticleStack TIFF-filen på Fiji. Med Surface Manager plugin installert i Fiji, åpne plugin.I Surface Manager klikker du på knappen Les omrissbilde, og setter Jaccard-indeksen til 60 % Lasting av disposisjonene kan ta flere minutter, avhengig av antall celler. Når den er lastet inn, tilordnes hver celle et S-nummer og vises i venstre del av Surface Manager-vinduet. Klikk på det valgte S-nummeret slik at den importerte celleomrisset fra ParticleStack1.tiff vises på time-lapse filmen. Kontroller hvert importert S-nummer for celleomrisskvalitet gjennom hele filmen, og fjern uønskede celler som viser feil celledisposisjoner. Hvis du vil fjerne en uønsket celle, merker du celleomrisset og klikker på Slett-knappen.Bruk penselverktøyet til å korrigere celleomrisser. Når du er ferdig, lagrer du de korrigerte cellene som en RoiSet. zip-filen.For å identifisere om actomyosin pulser er tilstede i det analyserte vevet og for å forstå detaljert oppførsel, samt retningsbestemthet av actomyosin signaler, begynner ved å åpne Fiji. Åpne en time-lapse film, laste den lagrede ParticleStack1. tiff cellemaske og blekemiddel-korrigert time-lapse film, deretter laste Surface Manager plugin og tilsvarende interesseområde fra RoiSet.zip-filen. Deretter aktiverer du en kanal med signaler av interesse i Surface Manager. Klikk Statistikk-knappen for å få tak i vinduet Gjennomsnitt grå verdi Slice etter slice.Gjennomsnittlige og median intensiteter av actomyosin signaler vil bli vist over tid i vilkårlige enheter, samt andre parametere knyttet til cellens område og form. Lagre verdiene som en regnearkfil ved å gå til Statistikk-vinduet, klikke på Fil og velge Lagre som.På samme måte, generere en cellemaske og laste den inn i Surface Manager for å analysere actomyosin pulser på vevsskalaen. Denne delen av protokollen tillater brukere å selektivt trekke ut et tynt lag av actomyosin i det buede epitelvevet over tid.Disse trinnene er brukervennlige og basert på et intuitivt grafisk grensesnitt. Åpne Fiji, og kontroller at plugin-modulen Ellipsoid Surface Projection er installert. Deretter åpner du en time-lapse-film, og eksporterer den som en XML / HDF5-fil ved å klikke på Plugins, gå til BigDataViewer og velge Eksporter gjeldende bilde som XML / HDF5-fil.Deretter åpner du den eksporterte filen i Ellipsoid Surface Projection ved å gå til Plugins, klikke på BigDataViewer, etterfulgt av Ellipsoid Surface Projection og velge XML-fil. Dette vil åpne et nytt vindu med sagittal visninger av eggkammeret, og en dialogboks for å veilede brukeren gjennom behandling vises. Dialogvinduet, kalt Ovaries Projection, har flere faner.I den første kategorien, kalt markeringsboks, definerer du x- og y-kantlinjene til et eggkammer i tidsforløpsfilmen sammen med z-bredden på markeringsboksen, og trykker på settet. De valgte delene av eggkammeret er uthevet i rosa. Deretter definerer du størrelsen på signalblober i kategorien finn blobs i Ovaries Projection-vinduet.Definer sigma og minimal toppverdi. Deretter trykker du på databehandling for å identifisere actomyosin-signalene, som vil vises som grønne blobs. Prøv dette trinnet på nytt med forskjellige parametere til rundt 100 flekker blir funnet.Identifisering av actomyosin signaler er et avgjørende skritt. Det avhenger av signalkvaliteten og riktig størrelse på de oppdagede blobs. Hvis det ikke er synlige grønne flekker i bildet, vil neste trinn ikke fungere.Hvis du vil utforme ellipsoiden, fortsetter du med kategorien kalt fit ellipsoid. Sett tilfeldige eksempler til 10 000, utsiden/innsiden av cutoff-avstanden til én til ti, og klikk deretter databehandling. Etter dette vil fanen kalt projeksjon automatisk åpnes og gir mulighet for definisjonen av overflateekstraksjonen.I projeksjonsfanen setter du opp en minimums- og maksimumsprojeksjonsavstand som bredden på ønsket ellipsoid. Den minimale og maksimale projeksjonsavstanden må passe slik at den rosa definerte ellipsoidregionen inkluderer hele det ytre laget av eggkammeret. Deretter definerer du skiveavstanden som én.Pass på at den rosa regionen av ellipsoid med definert med på eggkammeret er synlig før du trykker på databehandling. Det bidrar til å evaluere kvaliteten på en ny ellipsoid passform. Deretter angir du en utgangsbredde på ellipsoiden til større enn eller lik 800 og en høyde som er større enn eller lik 400.Deretter angir du varigheten av overflateekstraksjonen, og velger enten en sfærisk eller en sylindrisk projeksjon. Om nødvendig kan du vende Z og justere Y.Press compute for å få en overflateuttrekking for begge kanalene i nye vinduer kalt bilde. Juster lysstyrken og kontrasten til de oppnådde bildevinduene for å kunne se de projiserte actomyosin-signalene ved å klikke på Bilde, gå til Juster og velge Lysstyrke / kontrast.Hvis overflateutvinningen ser bra ut, lagrer du begge kanalene separat som TIFF-filer. I tillegg lagrer du loggvindusfilen for fremtidig referanse om hvordan overflaten av dette bestemte eggkammeret ble ekstrahert. Deretter slår du sammen kanalene med en foretrukket fargekode på Fiji, og lagrer resultatene som TIFF-filer.Denne protokollen gjør det mulig for forskere å undersøke oppførselen til actomyosin-nettverk i epitelvev. Dette er bare mulig når en detaljert analyse av actomyosin oppførsel på den lokale cellulære skalaen kombineres med en lignende analyse på vevsskalaen. Vist her er representative eksempler på dynamisk myosin II oppførsel på den lokale cellulære skalaen og på vevsskalaen for kontroll og fat2 muterte Drosophila eggkamre.På basal enkeltplan beveger den grønne modifiserte regulatoriske lyskjeden myosin II-signaler vinkelrett på den fremre bakre aksen av kontrolleggkamre. Denne polariteten går tapt i fett2 muterte eggkamre og fører til anisotropiske myosin II pulser, svingninger På vevsnivå genererer den grønne modifiserte regulatoriske lyskjeden myosin II i kontrollprøven den synkroniserte kraften som kreves for å fremme epitelrotasjon. I motsetning, follikkel epitel av en fat2 mutant egg kammer puls sterkt på basalsiden og ikke klarer å generere synkronisert kraft som kreves for å fremme epitelrotasjon.I en tynn apical region av Drosophila egg kammeret, fat2 mutant presenterer også med endret dynamisk oppførsel av den grønne modifiserte regulatoriske lyskjeden myosin II.Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god ide om hvordan du analyserer et actomyosin-nettverk på lokal og vevsskala i Drosophila eggkamre ved hjelp av Fiji. Hvis du vil ha flere praktiske tips og feilsøking, kan du se diskusjonsdelen etter protokollen. Hvis du har spørsmål knyttet til Fiji eller våre plugins, se de respektive nettsidene eller kontakt oss.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Oppreist Imaging av<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Fange Tissue Repair i Sebrafisk Larver med Time-lapse Lysfelt stereomikros

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyserer<em&gt; I Vivo</em&gt; Cell Migration bruker Cell transplantasjoner og Time-lapse Imaging in Sebrafisk embryo

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse av Sebrafisk Nyre Development med Time-lapse Imaging Ved hjelp av en dissekere mikroskop Utstyrt for Optical Seksjonering

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Kalsium i<em&gt; Drosophila</em&gt; På Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Metode for Time-Lapse Imaging av Dyrkede Rat mesenteric mikrovaskulære nettverk

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetisk analyse av Vasculogenesis kvantifiserer dynamikken i Vasculogenesis og angiogenese In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

I Vivo Avbildning av muskel-sene Morphogenesis i Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Bildebehandling og analyse av vevsorientering og vekstdynamikk i developing Drosophila Epithelia under pupal stadier

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Retrograd tracing av Drosophila embryonale motor neurons bruke lipofile fluorescerende fargestoffer

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...