Name: analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers
Uploaded: 2019-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

Авторы очень благодарны Мириам Остерфилд для обмена ее советы по in vitro жизни изображения яичных камер, используя подход, принятый из лаборатории Селеста Берг4. Мы также благодарим Себастьяна Тоси за сценарий Фиджи, который позволяет сегментации клеток.

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол содержит инструкции о том, как анализировать актомиозин в местной клеточной и ткани масштаба в дрозофилы яйцеклеток. Локальный подход позволяет пользователям анализировать детальное поведение актомиозина в 15 яйцеклетках на одну яичную ка...

<ol>
	<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).</li><li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+oogenesis.">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68, 207-217 (2014).</li><li>Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Ovaries.">Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries.</a> Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).</li><li>Peters, N. C., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Culturing+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Egg+Chambers:+A+History+and+Adaptable+Method.">In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method.</a> Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).</li><li>Spradling, A. C., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Genetics+of+Oogenesis.">Developmental Genetics of Oogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. , 1-70 (1993).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331, 1071-1074 (2011).</li><li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila.">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development. 143, 1375-1387 (2016).</li><li>Pokrywka, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+GFP-labeled+proteins+in+Drosophila+oocytes.">Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50044 (2013).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bullwinkle+is+required+for+epithelial+morphogenesis+during+Drosophila+oogenesis.">bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).</li><li>Cetera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+rotation+promotes+the+global+alignment+of+contractile+actin+bundles+during+Drosophila+egg+chamber+elongation.">Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation.</a> Nature Communications. 5, 5511 (2014).</li><li>Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+rotation+is+preceded+by+planar+symmetry+breaking+of+actomyosin+and+protects+epithelial+tissue+from+cell+deformations.">Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations.</a> PLOS Genetics. 13, e1007107 (2017).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+polarized+actomyosin+contractile+flows+control+epithelial+junction+remodelling.">Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling.</a> Nature. 468, 1110-1114 (2010).</li><li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis.">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).</li><li>. Surface manager Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager">https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager</a> (2018)</li><li>. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins">https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins</a> (2018)</li><li>. BigDataViewer Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/BigDataViewer">https://imagej.net/BigDataViewer</a> (2017)</li><li>Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigDataViewer:+visualization+and+processing+for+large+image+data+sets.">BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets.</a> Nature Methods. 12, 481-483 (2015).</li><li>Turner, C. M., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons+in+the+morphogenesis+of+epidermal+hairs+during+wing+development+in+Drosophila.">Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila.</a> Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).</li><li>Heemskerk, I., Streichan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cartography:+compressing+bio-image+data+by+dimensional+reduction.">Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction.</a> Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).</li><li>Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+Breaking+in+an+Edgeless+Epithelium+by+Fat2-Regulated+Microtubule+Polarity.">Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity.</a> Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).</li><li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists.">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nature Methods. 12, 30-34 (2015).</li></ol>

Критические шаги и устранение неполадок для вскрытия и культивирования яичных камер
Если слишком много мух помещаются в небольшой флакон, муха пища может превратиться грязной после 2-3 дней из-за большого количества кормления личинок и взрослых мух попасть в ло?...

Постоянное развитие новых технологий визуализации и программного обеспечения с применением в науке о жизни оказало огромное влияние на понимание основных принципов жизни. Одной из основных задач является надежная визуализация процессов развития в сочетании с их живой визуализацией в различных тканях. Ткани являются частями органов и органов, и, как таковые, большинство из них не легко доступны для визуализации. Таким образом, протоколы, которые позволяют их вскрытия и in vitro культивирования были разработаны для того, чтобы визуализировать биологические события, которые достаточно отражают in vivo ситуации в живом теле.
За последние десятилетия культивирование и живое изображение яичных камер Дрозофилы, ацинар-подобных структур, напоминающих примитивные органы, внесло огромный вклад в понимание основных принципов развития примитивных органов1 , 2 , 3. В настоящее время существует несколько протоколов культивирования, и их использование зависит от времени приобретения, типа ячейки, подимеющейся на изображении, и их доступности (например, внутренней зародышевой линии против внешней соматической линии)4.
Общей чертой во всех этих протоколах культивирования является необходимость иммобилизации проанализированных яичных камер, которые отображают высокую сократительую активность в жидких носителях. Сократительная активность яичных камер вызвана главным образом мышечным листом, который покрывает длинную строку подключенных яичных камер5,6,7. Таким образом, для достижения надлежащей иммобилизации молодых яичных камер,различные подходы были разработаны, с участием покрытия яичные камеры с крышками 6,8,9 или гибкие одеяла4, 10 или встраивание их в низкоплавительную точку агарозы3,11. Эти подходы популярны, поскольку они также позволяют изображения большего визуального плана из-за тонкого уплощения окружной поверхности яичных камер.
Однако, недавно, было показано, что молодые яичные камеры (этап 1-8) вращаются вокруг их передней задней оси6 и что это движение ткани питается от тонкой сети актомиозина близко к окружной поверхности этих молодых яичных камер 12. Таким образом, искусственное изменение клеточной поверхности, вызванное тонким уплощением этой ткани, может негативно сказаться на поведении силового актомиозина. Контрапункт заключается в том, что если ткань яичной камеры не сплющена, микроскопическая визуализация белков на окружной поверхности яичных камер становится еще более ограниченной уменьшением размера плоскости приобретения.
Таким образом, мы объединили протоколы от Prasad et al.9 и лаборатории Селеста Берг4,10 и далее модифицировали их так, чтобы в разработанном методе не использовалось покрытие/гибкое одеяло/агароз. Дрозофилы яичные камеры свободно культивируются в средствах массовой информации и протокол, представленный здесь применяется только перевернутая микроскопия. Протокола две части. Первая часть сосредоточена на анализе сигналов атомиозина в локальном клеточном масштабе (до 15 клеток) в яйцеклетках. Во второй части мы фокусируемся на преодолении ограничений, связанных с небольшой плоскостью приобретения, вызванной бесплатной культивированием яичных камер. В этой связи мы разработали новый фиджийский вычислительный метод с полуинтерактивным графическим пользовательским интерфейсом, который выборочно извлекает и разворачивает определенные слои поверхности окружной ткани. За этим следует протокол, который описывает, как анализировать актомиозин в масштабе ткани (т.е. клетки. Поскольку селективная экстракция определенного тонкого слоя изогнутых эпителиальных тканей не была легковозможна с помощью классической проекции z-стека(рисунок1), этот простой в использовании метод служит важным условием для всестороннего понимания поведение тонкой (злт;1 мкм) сети актомиозина в масштабе ткани в яйцеклетках Drosophila.
Кроме того, для облегчения протокола, мы предоставляем пример замедленного фильмов (TLMs) и образцы файлов флуоресцентно помечены немышечной обычного поведения Миозина II (см. Дополнительный файл 3). Миозин II является моторным белком и представляет собой активную сократителемую часть актомиозина. Для того, чтобы изображение Myosin II, мы используем Drosophila трансгенных линий, которые содержат модифицированные нормативные световой цепи Myosin II называется MRLC::GFP (см. Таблица материалов для деталей)12,13. Для визуализации клеточных мембран протокол основан на коммерческих красителей (см. ТаблицуМатериалов). Этот протокол подходит не только для анализа малых субклеточных MRLC: GFP сигналы12, но и для любых аналогичных размеров субклеточных частиц вокруг 300 мкм, таких, как те, которые наблюдаются с Life-Act::GFP12,14.
Хотя оба эти протоколы представлены с использованием in vitro культивированных камер дрозофилы яйцо, приобретение сигналов actomyosin также может быть выполнена с использованием других тканей на оптимизацию культивирования средств массовой информации и в зависимости от наличия либо флуоресцентно помеченных белков с соответствующими коммерческими красителями или, например, микроинъекций мРНК для получения преходящих профилей экспрессии генов. Аналогичным образом, фиджийский протокол для извлечения тонкого слоя из окружной поверхности может быть применен в более общем плане к эллипсоидным и органоподобным тканям.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schneider Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720-024</td>
			<td>[+]-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#160;[+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 &#181;g/ml Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;F135</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Solution Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033NS</td>
			<td>33 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td></td>
			<td>&#160;#55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Deep Red (cell membrane dye)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64 (cell membrane dye)</td>
			<td>ThermoFisher/Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression dissection slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-560B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steromicroscope</td>
			<td>e.g. Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi SV 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic glass/cover glass</td>
			<td>e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wironit needle holder</td>
			<td>Hammacher</td>
			<td>9160020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus spine</td>
			<td>Echinocactus grusonii/barrel cactus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila stocks used in the manuscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers

Дрозофилы незрелые яйца называются яичными камерами, и их структура напоминает примитивные органы, которые претерпевают морфологические изменения от круглой до эллипсоидной формы во время развития. Этот процесс развития называется oogenesis и имеет решающее значение для генерации функциональных зрелых яиц для обеспечения следующего поколения мух. По этим причинам яичные камеры служили идеальной и соответствующей моделью для понимания развития органов животных.
Было разработано несколько протоколов по культивированию in vitro, но в этих протоколах есть несколько недостатков. Один включает в себя применение различных охватывает, которые оказывают искусственное давление на изображения яичных камер для того, чтобы обездвижить их и увеличить изображение плоскости приобретения окружной поверхности проанализированных яичных камер. Такой подход может негативно повлиять на поведение тонкого актомиозина, который генерирует способность вращать яичные камеры вокруг своей более длинной оси.
Таким образом, чтобы преодолеть это ограничение, мы культуры Drosophila яичные камеры свободно в средствах массовой информации для того, чтобы надежно анализировать актомиозина машины вдоль окружности яичных камер. В первой части протокола мы предоставляем инструкцию с подробным описанием того, как анализировать актомиозиновое оборудование в ограниченной плоскости приобретения в локальном сотовом масштабе (до 15 ячеек). Во второй части протокола мы предоставляем пользователям новый плагин на основе Фиджи, который позволяет просто йодицию определенного тонкого слоя окружной поверхности яичных камер. Затем в следующем протоколе описывается, как анализировать сигналы актомиозина в масштабе ткани (Ят;50 клеток). Наконец, мы выявляем ограничения этих подходов как на локальном клеточном, так и в тканевом масштабе и обсуждаем его потенциальное будущее развитие и возможное применение.

Этот протокол позволяет ученым исследовать поведение актомиозина сетей в эпителиальных тканях. Это возможно только тогда, когда подробный анализ поведения актомиозина в локальном клеточном масштабе (несколько клеток) сочетается с аналогичным анализом в масштабе тк?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Этот протокол обеспечивает основанную на Фиджи, удобную методологию наряду с простыми инструкциями, объясняющие, как надежно анализировать поведение актомиозина в отдельных клетках и изогнутых эпителиальных тканях. Нет навыков программирования не требуется, чтобы следовать учебник; все шаги выполняются в полуинтерактивной манере с использованием графического пользовательского интерфейса Фиджи и связанных с ними плагинов.

Анализ динамики actomyosin на местных сотовых и тканевых весов использованием покадровой фильмы культурных Дрозофила яйцо камер

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Наш протокол помогает ученым анализировать субклеточную сеть актомиозина в отдельных эпителиальных клетках, а также позволяет им проводить подобный анализ в многоклеточной шкале в изогнутых эпителиальных тканях. Наш протокол является хорошим примером приложения Фиджи. Он имеет интуитивно понятный графический пользовательский интерфейс, и он не требует каких-либо знаний о сценарии.Таким образом, он очень подходит также для начинающих пользователей в этой области. Хотя наш метод был разработан для drosophila яичные камеры, это также применимо за пределами эпителии Drosophila. Мы призываем ученых протестировать наш протокол в своих модельных системах.Используйте сопровождаемые тестовые файлы, чтобы ознакомиться с этим протоколом. Это поможет вам решить, какая часть этого протокола подходит для вашего индивидуального исследовательского вопроса. Эта часть протокола позволяет пользователям сегментировать эпителиальные клетки в фильмах замедленного действия и впоследствии анализировать актомиозин импульсы в отдельных клетках с течением времени с помощью Surface Manager.Для начала откройте Фиджи и импортируем макро TissueCellSegmentMovie. ijm, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Затем откройте исправленный отбеливателем файл TIFF и разделите каналы исправленного отбеливателя файла, заехав в бар меню, выбрав изображение, а затем Цвет и выбрав сплит-каналы.Вы запустите загруженный скрипт на активном клеточном мембранном канале выбранного фильма замедленного действия, нажав значок Run в открытом скрипте. Для того, чтобы получить хорошую маску ячейки, установить Gaussian размытия до 2500 и чувствительность обнаружения клеток до минус одного, и нажмите OK. Затем установите расчетную шумоустойчивость от 10 до 20 для фильмов замедленного действия, приобретенных с целью 63x, и нажмите OK. В анализируемом фильме замедленного действия появляется генерируемая ячейка, появляется новое окно под названием ParticleStack, а также появляется небольшое окно под названием Action Required. Из маски ячейки в замедленном фильме сосредоточьтесь только на ячейках в центре и выберите те, которые могут обеспечить полные и четко определенные контуры на протяжении всего фильма замедленного действия.Когда выбранные клетки в центре хорошо соответствуют реальным клеточным мембранам, сохраните ParticleStack в качестве файла TIFF. Откройте соответствующий файл ParticleStack TIFF на Фиджи. С помощью плагина Surface Manager, установленного на Фиджи, откройте плагин.В Surface Manager нажмите кнопку изображения Контур чтения и установите индекс Jaccard до 60%, загрузка контуров может занять несколько минут в зависимости от количества ячеек. После загрузки каждой ячейке будет присвоен номер S и он появится в левой части окна Surface Manager. Нажмите на выбранный номер S, чтобы контур импортированных ячеек от ParticleStack1.tiff появляется на замедленном фильме. Проверьте каждый импортированный номер S на качество контура ячейки на протяжении всего фильма и удалите нежелательные ячейки, отображая неправильные контуры ячеек. Чтобы удалить нежелательную ячейку, выделите контур ячейки и нажмите на кнопку Удалить.Используйте инструмент Brush для коррекции контуров ячеев. После завершения, сохранить исправленные ячейки, как RoiSet. почтовый файл.Определить, присутствуют ли актомиозиновые импульсы в анализируемой ткани и понять детальное поведение, а также направленность сигналов актомиозина, начните с открытия Фиджи. Откройте фильм замедленного действия, загрузите сохраненный ParticleStack1. Tiff сотовая маска и отбеливатель исправленный промежуток времени фильм, а затем загрузить Surface Manager плагин и соответствующую область интереса от RoiSet.почтовый файл. Далее, в Surface Manager, активировать канал с сигналами интереса. Нажмите кнопку Статистика, чтобы получить окно под названием Среднее серое значение Фрагмент за ломтиком.Средняя и медианная интенсивность сигналов актомиозина будет отображаться с течением времени в произвольных единицах, а также других параметрах, связанных с областью и формой клетки. Сохраните значения в качестве файла электронной таблицы, заехав в окно Статистики, нажав на файл и выбрав Save As.Similarly, создайте маску ячейки и загрузите ее в Surface Manager, чтобы проанализировать импульсы актомиозина в шкале тканей. Эта часть протокола позволяет пользователям выборочно извлекать тонкий слой актомиозина в изогнутой эпителиальной ткани с течением времени.Эти шаги удобны и основаны на интуитивно понятном графическом интерфейсе. Откройте Фиджи и убедитесь, что плагин Ellipsoid Surface Projection установлен. Затем откройте покадровой фильм и экспортуте его в качестве файла XML/HDF5, нажав на плагины, перейдите на BigDataViewer и выбрав Export Current Image в качестве файла XML/HDF5.Затем откройте экспортируемый файл в эллипсоидной проекции поверхности, перейдите на Плагины, нажав на BigDataViewer, а затем Эллипсоидная проекция поверхности и выбрав файл XML. Это откроет новое окно с sagittal мнениями яичной камеры, и диалог, чтобы направлять пользователя через обработку появится. Окно диалога, называемое Проекция яичников, имеет несколько вкладок.В первой вкладке диалога, называемой обвяжающая окно, определите границы x и y яичной камеры в фильме замедленного действия вместе с шириной z коробки границ и набором прессы. Выбранные части яичной камеры выделены розовым цветом. Затем определите размер капли сигнала в вкладке диалог, называемой «найти капли» в окне проекции яичников.Определите сигму и минимальное пиковое значение. Затем нажмите вычисления, чтобы определить сигналы актомиозина, которые будут отображаться как зеленые капли. Повторить этот шаг с различными параметрами, пока около 100 пятен находятся.Определение сигналов актомиозина является важным шагом. Это зависит от качества сигнала и правильного размера обнаруженных капли. Если на изображении нет видимых зеленых пятен, то следующий шаг не сработает.Для разработки эллипсоидов, продолжить с вкладкой называется подходят эллипсоид. Установите случайные образцы до 10 000, расстояние отсечения снаружи/внутри до 10, а затем щелкните вычисления. После этого вкладка, называемая проекцией, автоматически откроется и позволит дать определение извлечения поверхности.В проекционной вкладке установите минимальное и максимальное проекционные расстояния в качестве ширины желаемого эллипсоида. Минимальное и максимальное расстояние проекции должно соответствовать так розовый определенный эллипсоидный регион включает в себя весь внешний слой яичной камеры. Затем определите расстояние среза как одно.Убедитесь, что розовая область эллипсоида с определенным на яичной камере видна перед нажатием вычисления. Это помогает оценить качество нового эллипсоида подходят. Затем установите выходную ширину эллипсоида больше или равную 800 и высоту, которая больше или равна 400.Затем установите продолжительность извлечения поверхности и выберите либо сферическую, либо цилиндрическую проекцию. При необходимости переверните и выровняете вычисления Y.Press, чтобы получить извлечение поверхности для обоих каналов в новых окнах, называемых изображением. Отрегулируйте яркость и контрастность полученных окон изображения, чтобы иметь возможность видеть проецируемые сигналы актомиозина, нажав на изображение, отрегулируя и выбрав яркость/контрастность.Если извлечение поверхности выглядит хорошо, сохраните оба канала отдельно, как файлы TIFF. Кроме того, сохраните файл окна журнала для будущей ссылки на то, как была извлечена поверхность этой конкретной яичной камеры. Затем объединить каналы с предпочтительным цветовым кодом на Фиджи, и сохранить результаты, как TIFF файлов.Данный протокол позволяет ученым исследовать поведение актомиозиновых сетей в эпителиальных тканях. Это возможно только тогда, когда детальный анализ поведения актомиозина в местной клеточной шкале сочетается с аналогичным анализом в шкале тканей. Здесь показаны репрезентативные примеры динамического поведения миозин II в локальной клеточной шкале и в шкале тканей для контроля и жира2 мутанта Drosophila яичных камер.На базальной одной плоскости зеленая модифицированная регулятивная световая цепь сигналов миозин II переходит перпендикулярно передней-задней оси контрольных яичных камер. Эта полярность теряется в камерах мутантных яиц fat2 и приводит к анисотропным импульсам миозин II, колебаниям на уровне тканей, зеленой модифицированной регулятивной световой цепи миозин II в контрольном образце генерирует синхронизированную силу, необходимую для содействия эпителиального вращения. В отличие от этого, фолликул эпителий жира2 мутантной яичной камеры импульс сильно на базальной стороне и не в состоянии генерировать синхронизированную силу, необходимую для содействия эпителиального вращения.В тонкой апической области яичной камеры Drosophila, мутант fat2 также представляет с измененным динамическим поведением зеленой модифицированной регулятивной световой цепи myosin II.После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее представление о том, как проанализировать сеть актомиозина на местном и тканевой шкале в яичной камере Drosophila с помощью Фиджи. Дополнительные практические советы и устранение неполадок, пожалуйста, смотрите обсуждение части после протокола. Если у вас есть какие-либо вопросы, связанные с Фиджи или наши плагины, смотрите соответствующие веб-страницы или свяжитесь с нами.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Вертикальный Визуализация<em&gt; Drosophila</em&gt; Яйцо палат

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Захват восстановления тканей в данио рерио Личинки с Интерв светлого стереомикроскопия

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Анализ<em&gt; В Vivo</em&gt; Миграция клеток с использованием мобильных трансплантаций и время покадровой визуализации у эмбрионов данио рерио

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Анализ развития данио почки с течением времени покадровой визуализации Использование рассекает микроскопа, оборудованного для оптического секционирования

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Визуализации кальция в<em&gt; Drosophila</em&gt; При активации Egg

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Метод ЗАМЕДЛЕННАЯ визуализации культивируемых Rat брыжеечные микрососудистых сетей

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Кинетический анализ Vasculogenesis дает количественную оценку динамики Vasculogenesis и ангиогенеза в пробирке

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

В естественных условиях Imaging мышц сухожилие морфогенеза в куколки дрозофилы

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Изображение и анализ ориентации тканей и динамики роста в развивающихся дрозофилы Эпителия во время Pupal Этапы

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Ретроградная трассировка дрозофилических мотонейронов с использованием липофильных флуоресцентных красителей

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...