Name: analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers
Uploaded: 2019-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

Yazarlar çok Miriam Osterfield için bir yaklaşım Celeste Berg laboratuar4kabul kullanarak yumurta odaları in vitro yaşam görüntüleme onu tavsiye paylaşımı için minnettar. Ayrıca, hücre segmentasyonunu sağlayan Fiji senaryosu için Sebastian Tosi 'ye teşekkür ederiz.

Not: Aşağıdaki protokol, yerel hücresel ve Drosophila yumurta odalarında doku ölçeği aktomiozin analiz talimatları sağlar. Yerel ölçekli yaklaşım, kullanıcıların yumurta odasına göre 15 hücreye kadar ayrıntılı akomyosin davranışını analiz etmelerini sağlar ve yüksek hızlı görüntüleme ve ters bir Konfokal mikroskop kullanarak kısa bir süre için (5 – 10 dakika) TLMs satın almayı gerektirir. Buna karşılık, doku ölçeği 50 – 100 hücrelerde aktomiozin ...

<ol>
	<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).</li><li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+oogenesis.">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68, 207-217 (2014).</li><li>Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Ovaries.">Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries.</a> Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).</li><li>Peters, N. C., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Culturing+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Egg+Chambers:+A+History+and+Adaptable+Method.">In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method.</a> Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).</li><li>Spradling, A. C., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Genetics+of+Oogenesis.">Developmental Genetics of Oogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. , 1-70 (1993).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331, 1071-1074 (2011).</li><li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila.">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development. 143, 1375-1387 (2016).</li><li>Pokrywka, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+GFP-labeled+proteins+in+Drosophila+oocytes.">Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50044 (2013).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bullwinkle+is+required+for+epithelial+morphogenesis+during+Drosophila+oogenesis.">bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).</li><li>Cetera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+rotation+promotes+the+global+alignment+of+contractile+actin+bundles+during+Drosophila+egg+chamber+elongation.">Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation.</a> Nature Communications. 5, 5511 (2014).</li><li>Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+rotation+is+preceded+by+planar+symmetry+breaking+of+actomyosin+and+protects+epithelial+tissue+from+cell+deformations.">Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations.</a> PLOS Genetics. 13, e1007107 (2017).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+polarized+actomyosin+contractile+flows+control+epithelial+junction+remodelling.">Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling.</a> Nature. 468, 1110-1114 (2010).</li><li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis.">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).</li><li>. Surface manager Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager">https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager</a> (2018)</li><li>. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies Available from: <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins">https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins</a> (2018)</li><li>. BigDataViewer Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/BigDataViewer">https://imagej.net/BigDataViewer</a> (2017)</li><li>Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigDataViewer:+visualization+and+processing+for+large+image+data+sets.">BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets.</a> Nature Methods. 12, 481-483 (2015).</li><li>Turner, C. M., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons+in+the+morphogenesis+of+epidermal+hairs+during+wing+development+in+Drosophila.">Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila.</a> Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).</li><li>Heemskerk, I., Streichan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cartography:+compressing+bio-image+data+by+dimensional+reduction.">Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction.</a> Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).</li><li>Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+Breaking+in+an+Edgeless+Epithelium+by+Fat2-Regulated+Microtubule+Polarity.">Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity.</a> Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).</li><li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists.">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nature Methods. 12, 30-34 (2015).</li></ol>

Yumurta odalarının diseksiyonu ve kültürü için kritik adımlar ve sorun giderme
Eğer çok fazla sinekler küçük bir şişeye yerleştirilir, sinek gıda 2 – 3 gün sonra büyük miktarlarda besleme larvaları ve yetişkin sinek gıda sıkışıp almak sinek nedeniyle çamurlu açabilirsiniz. Böyle bir durumda, bu sineklerin geri kalanını taze yiyeceklerle yeni bir şişeye çevirin ve sayısını küçültür. Özellikle, gıda sıkışmış kadın hariç.
<p...

Yeni görüntüleme ve yazılım teknolojilerinin yaşam bilimleri uygulamalarında sürekli gelişimi, yaşamın temel ilkelerini anlamakta büyük bir etki sağladı. Ana zorluklardan biri, çeşitli dokularda canlı görüntüleme ile birlikte gelişimsel süreçlerin güvenilir bir şekilde görselleştirilmesi. Dokular organlar ve organları ve bu nedenle, çoğunluğu kolayca görüntüleme için erişilebilir değildir. Bu nedenle, kendi diseksiyon ve in vitro kültür izin protokolleri yeterince canlı bir vücut içinde in vivo durumu yansıtmak biyolojik olayları görselleştirmek için geliştirilmiştir.
Geçtiğimiz yıllarda, Drosophila yumurta odalarının kültür ve canlı görüntülemesinde, ilkel organlara benzeyen acinar benzeri yapıların, ilkel organ gelişimi temel prensiplerinin anlayışına son derece katkı sağladı1 , 2 , 3. Şu anda, mevcut çeşitli kültür protokolleri vardır, ve kullanımı edinme süresi bağlıdır, hücre türü görüntülenmiş olması, ve onların Erişilebilirlik (örn., iç germline vs dış somatik hattı)4.
Tüm bu kültür protokollerinde ortak bir özellik sıvı medyada yüksek kontril aktivite gösteren analiz yumurta odaları immobilizasyon için ihtiyaç vardır. Yumurta odaları kontril aktivite bağlı yumurta odaları uzun bir dize kapsayan kas levha ağırlıklı olarak neden olur5,6,7. Bu nedenle, Genç yumurta odalarının düzgün immobilizasyonu elde etmek için, çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir, Cover,6,8,9 veya esnek battaniye 4 ile yumurta odaları kapsayan içeren, 10 veya düşük erime noktası agaroz3,11içine katıştırma. Aynı zamanda yumurta odalarının çevresel yüzeyinin ince düzleştirme nedeniyle daha büyük bir görsel düzlem görüntüleme izin olarak bu yaklaşımlar popülerdir.
Ancak, son zamanlarda, bu genç yumurta odaları (Aşama 1-8) onların anterior-posterior eksen etrafında döndürmek gösterilmiştir6 ve bu doku hareketi bu genç yumurta odalarının çevresel yüzeyine yakın ince bir aktomiozin ağ tarafından desteklenmektedir olduğunu 12. bu nedenle, bu doku ince bir düzleştirme neden hücresel yüzey yapay değişiklik kuvvet üreten aktomiozin makine davranışı üzerinde olumsuz bir etkisi olabilir. Kontrpuan, yumurta odası dokusu düzleştirilmiş değilse, yumurta odalarının çevresel yüzeyinde proteinlerin mikroskobik görüntüleme daha da satın uçak azalan boyutu ile sınırlı hale gelir.
Bu nedenle, Prasad ve al.9 ve Celeste Berg4,10 laboratuvarından birleştirilmiş protokollere sahibiz ve gelişmiş yöntemde hiçbir coverslip/esnek battaniye/agarose kullanılabilmesi için onları daha fazla değiştirdik. Drosophila yumurta odaları serbestçe medyada kültürlü ve burada sunulan protokol sadece ters mikroskopiye uygulanır. Protokole iki parça vardır. İlk bölüm, yumurta odaları içinde yerel hücresel ölçekte (15 hücreye kadar) akomyosin sinyallerinin analizine odaklanmıştır. İkinci bölümde, yumurta odalarının ücretsiz kültürü nedeniyle küçük bir satın alma uçağı ile ilişkili sınırlamaları üstesinden odaklanıyoruz. Bu bağlamda, biz seçici özler ve bir çevresel doku yüzeyi tanımlanan katmanları ortaya çıkaran bir yarı interaktif grafik kullanıcı arayüzü ile bir roman Fiji tabanlı hesaplama yöntemi geliştirdik. Bunun ardından doku ölçeğinde akomyosin nasıl çözümleneceğini açıklayan bir protokol izlenir (yani, > 50 hücre). Eğri epitelyal dokularda tanımlanmış bir ince tabakanın seçici olarak çıkarılması, klasik z-Stack projeksiyon kullanarak kolayca mümkün olmamıştır (Şekil 1), bu kolay kullanımlı Yöntem, önemli bir ön koşul olarak anlaşılır Drosophila yumurta odalarında doku ölçeğinde ince (< 1 μm) aktomiozin ağının davranışı.
Buna ek olarak, protokol kolaylaştırmak için, biz örnek zaman atlamalı Filmler (tlms) ve floresan etiketli kasa invaze olmayan konvansiyonel myosin II davranış örnek dosyaları ( ek dosya 3bakın) sağlar. Myosin II bir motor proteindir ve akomyosin makinenin aktif kontroton parçasını temsil eder. Myosin II görüntü için, biz myosin II adlandırılan mrlc değiştirilmiş bir düzenleyici ışık zinciri içeren Drosophila transjenik hatları kullanın:: GFP (Ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın)12,13. Hücre zarlarını görselleştirmek için protokol ticari boyalara dayanır (bkz. malzeme tablosu). Bu protokol sadece küçük hücre altı mrlc analizi için uygundur:: Gfp sinyalleri12 ama aynı zamanda ± 300 μM civarında herhangi bir benzer boyutlu hücre altı parçacıklar için, böyle yaşam-ACT ile gözlenen gibi:: Gfp12,14.
Her ikisi de bu protokoller içinde vitro kültürlü Drosophila yumurta odaları kullanılarak sunulmasına rağmen, akomyosin sinyalleri satın alma da kültür medyanın optimizasyonu üzerine diğer dokularda kullanılarak yapılabilir ve kullanılabilirliği bağlı ilgili ticari boyalar veya örneğin, mRNA mikroenjeksiyonları geçici gen ifade profilleri elde etmek için floresan etiketli proteinlerin. Benzer şekilde, bir çevresel yüzeyden ince bir tabakanın çıkarılması için Fiji tabanlı protokol, elipsoid ve organ benzeri dokulara daha genel olarak uygulanabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schneider Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720-024</td>
			<td>[+]-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#160;[+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 &#181;g/ml Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;F135</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Solution Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033NS</td>
			<td>33 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td></td>
			<td>&#160;#55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Deep Red (cell membrane dye)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64 (cell membrane dye)</td>
			<td>ThermoFisher/Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression dissection slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-560B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steromicroscope</td>
			<td>e.g. Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Stemi SV 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc microscope</td>
			<td>e.g. Zeiss/Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic glass/cover glass</td>
			<td>e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wironit needle holder</td>
			<td>Hammacher</td>
			<td>9160020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cactus spine</td>
			<td>Echinocactus grusonii/barrel cactus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila stocks used in the manuscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of actomyosin dynamics at local cellular and tissue scales using time-lapse movies of cultured drosophila egg chambers

Drosophila olgunlaşmamış Yumurtalar yumurta odaları denir ve onların yapısı geliştirme sırasında bir elipsoid şekle bir turda morfolojik değişiklikler geçmesi ilkel organlar benzer. Bu gelişimsel süreç oogenesis denir ve bir sonraki sinek nesil güvenli fonksiyonel Olgun yumurta üretmek için çok önemlidir. Bu nedenlerden dolayı, yumurta odaları hayvan organı gelişimini anlamak için ideal ve ilgili bir model olarak hizmet vermiştir.
Çeşitli in vitro kültür protokolleri geliştirilmiştir, ancak bu protokoller için çeşitli dezavantajları vardır. Biri, onları hareketsiz ve analiz yumurta odalarının çevresel yüzeyinin görüntülenmiş edinme düzlemini artırmak için görüntülenmiş yumurta odalarında yapay bir basınç sağlayan çeşitli kapakları uygulama içerir. Böyle bir yaklaşım, uzun eksenleri etrafında yumurta odaları döndürmek için güç üreten ince akomyosin makinenin davranışını olumsuz etkileyebilir.
Böylece, bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, yumurta odalarının çevresi boyunca akomyosin makinelerini güvenilir bir şekilde analiz etmek amacıyla medyada serbestçe Drosophila Egg Chambers kültürü sunuyoruz. Protokolün ilk bölümünde, yerel hücresel ölçekte (15 hücreye kadar) sınırlı bir satın alma düzleminde aktomiozin makinelerini nasıl analiz edebileceğiz hakkında ayrıntılı bir kılavuz sağlıyoruz. Protokol ikinci bölümünde, biz yumurta odaları ' çevresel yüzey tanımlanmış bir ince tabaka basit ekstraksiyon sağlayan yeni bir Fiji tabanlı eklentisi ile kullanıcılara sağlar. Aşağıdaki protokol daha sonra doku ölçeğinde (> 50 hücre) akomyosin sinyallerinin nasıl çözümleneceğini açıklar. Son olarak, bu yaklaşımların kısıtlamalarını hem yerel hücresel hem de doku ölçeklerde tespit ediyoruz ve potansiyel gelecekteki gelişimini ve olası uygulamalarını tartışıyoruz.

Bu protokol bilim adamlarının epitel dokularda akomyosin ağlarının davranışlarını araştırmasını sağlar. Bu sadece yerel hücresel ölçekte (birkaç hücre) aktomiozin davranışının ayrıntılı bir analizi doku ölçeği (birçok hücre) benzer bir analiz ile birleştirildiğinde mümkündür. Ancak, epitelyal dokular genellikle kavisli ve bu dokuların ince bir tabaka çıkarma daha önce kolayca mümkün değildi, Drosophila yumurta odalarında gösterildiği ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Bu protokol, tek hücrelerde ve kavisli epitelyal dokularda akomyosin davranışlarını nasıl güvenilir bir şekilde analiz ettiğini açıklayan basit yönergelerle birlikte Fiji tabanlı, Kullanıcı dostu bir metodoloji sunar. Öğretici izlemek için hiçbir programlama becerileri gereklidir; tüm adımlar Fiji grafik kullanıcı arayüzü ve ilişkili eklentileri kullanarak yarı interaktif bir şekilde gerçekleştirilir.

Kültür Drosophila Egg Chambers Time-Lapse filmler kullanarak yerel hücresel ve doku ölçeklerde Actomyosin dinamikleri Analizi

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Protokolümüz bilim adamlarının hücre altı actomiyozin ağını tek tek epitel hücrelerinde analiz etmelerine yardımcı olur ve aynı zamanda kavisli epitel dokularda çok hücreli ölçekte benzer analizler yapmalarını sağlar. Protokolümüz Fiji uygulamasının güzel bir örneğidir. Sezgisel bir grafik kullanıcı arabirimine sahiptir ve komut dosyası bilgisi gerektirmez.Bu nedenle, alanında acemi kullanıcılar için de son derece uygundur. Yöntemimiz Drosophila yumurta odaları için geliştirilmiş olmasına rağmen, Drosophila epitel dışında da uygulanabilir. Bilim adamlarını protokolümüzü model sistemlerinde test etmeye teşvik ediyoruz.Bu protokole aşina olmak için eşlik eden test dosyalarını kullanın. Bu protokolün hangi bölümünün bireysel araştırma sorunuz için uygun olduğuna karar vermenize yardımcı olacaktır. Protokolün bu bölümü, kullanıcıların zaman atlamalı filmlerde epitel hücrelerini segmente etmesini ve surface manager'ı kullanarak zaman içinde hücrelerdeki actomiyozin darbelerini tek tek analiz etmesine olanak tanır.Başlamak için Fiji'yi açın ve makro TissueCellSegmentMovie'yi alın. ijm olarak eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi. Ardından, ağartıcı düzeltilmiş bir TIFF dosyasını açın ve menü çubuğuna giderek, Görüntü'yü seçerek ve ardından Renk'i seçerek ve Split Kanalları seçerek ağartıcı düzeltilmiş dosyanın kanallarını bölün.Yüklenen komut dosyasını, açık komut dosyasında Çalıştır simgesine basarak seçili hızlandırılmış filmin etkin hücre zarı kanalında çalıştırın. Güzel bir hücre maskesi almak için Gaussian bulanıklığını 2.500'e, hücre algılama hassasiyetini eksi bire ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın. Ardından, 63x hedefiyle edinilen hızlandırılmış filmler için tahmini gürültü toleransını 10 ile 20 arasında ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın. Oluşturulan hücre maskesi çözümlenen hızlandırılmış filmde görünür, ParticleStack adlı yeni bir pencere görüntülenir ve Eylem Gerekli adlı küçük bir pencere de görünür. Hızlandırılmış filmdeki hücre maskesinden yalnızca merkezdeki hücrelere odaklanın ve hızlandırılmış film boyunca tam ve iyi tanımlanmış anahatlar sağlayabilecek olanları seçin.Merkezdeki seçili hücreler gerçek hücre zarlarına güzel bir şekilde karşılık geldiğinde, ParticleStack'i TIFF dosyası olarak kaydedin. Fiji'de ilgili ParticleStack TIFF dosyasını açın. Fiji'de Surface Manager eklentisi yüklüolduğu için eklentiyi açın.Surface Manager'da, Anahat Oku görsel düğmesini tıklatın ve Jaccard dizini %60'a ayarlayın Anahatların yüklenmesi hücre sayısına bağlı olarak birkaç dakika sürebilir. Yüklendikten sonra, her hücreye bir S numarası atanır ve Surface Manager penceresinin sol bölümünde görünür. ParticleStack1'den alınan hücre anahattının seçili S numarasını tıklatın.tiff hızlandırılmış filmde görünür. Film boyunca alınan her s numarasını hücre anahattı kalitesi için denetleyin ve yanlış hücre anahatlarını görüntüleyen istenmeyen hücreleri kaldırın. İstenmeyen bir hücreyi kaldırmak için hücre anahattını vurgulayın ve Sil düğmesini tıklatın.Hücre anahatlarını düzeltmek için Fırça aracını kullanın. Tamamlandığında, düzeltilmiş hücreleri RoiSet olarak kaydedin. zip dosyası.Analiz edilen dokuda actomiyozin darbelerinin bulunup bulunmadığını belirlemek ve akralozin sinyallerinin yönünün ayrıntılı davranışını anlamak için Fiji'yi açarak başlar. Hızlandırılmış bir film açın, kaydedilen ParticleStack1'i yükleyin. tiff hücre maskesi ve ağartıcı düzeltilmiş hızlandırılmış film, sonra Surface Manager eklentisi ve RoiSet ilgi ilgili bölge yükleyin.zip dosyası. Ardından, Surface Manager'da ilgi sinyalleri içeren bir kanalı etkinleştirin. Dilime Göre Ortalama gri değeri Dilim adlı pencereyi elde etmek için İstatistikler düğmesini tıklatın.Actomiyozin sinyallerinin ortalama ve ortanca yoğunlukları zaman içinde rasgele birimlerde ve hücrenin alanı ve şekliyle ilgili diğer parametrelerde görüntülenir. İstatistikler penceresine giderek, Dosya'ya tıklayarak ve As.Similar'u Kaydet'i seçerek, bir hücre maskesi oluşturarak ve doku ölçeğinde actomiyozin darbelerini analiz etmek için Surface Manager'a yükleyerek değerleri elektronik tablo dosyası olarak kaydedin. Protokolün bu bölümü kullanıcıların seçici zaman içinde kavisli epitel doku da aktomiyozin ince bir tabaka ayıklamak için izin verir.Bu adımlar kullanıcı dostudur ve sezgisel bir grafik arabirimine dayanır. Fiji'yi açın ve Elipsoid Yüzey Projeksiyon eklentisinin takılı olduğundan emin olun. Ardından, hızlandırılmış bir film açın ve Eklentileri tıklatarak, BigDataViewer'a giderek ve XML/HDF5 dosyası olarak Geçerli Görüntüyü Dışa Aktar'ı seçerek XML/HDF5 dosyası olarak dışa aktarın.Ardından, Eklentilere giderek, BigDataViewer'ı tıklatarak, ardından Elipsoid Yüzey Projeksiyonu'nu izleyerek ve XML dosyasını seçerek Elipsoid Yüzey Projeksiyonu'nda dışa aktarılan dosyayı açın. Bu, yumurta odasının sagital görünümleri ile yeni bir pencere açacak ve işleme yoluyla kullanıcıya rehberlik edecek bir iletişim görüntülenir. Yumurtalık Projeksiyonu adı verilen iletişim penceresinin birkaç sekmesi vardır.Sınırlama kutusu olarak adlandırılan ilk iletişim sekmesinde, zaman atlamalı filmdeki bir yumurta odasının x ve y kenarlıklarını sınırlayıcı kutunun z genişliğiyle birlikte tanımlayın ve sete basın. Yumurta odasının seçilen kısımları pembe renkte vurgulanır. Ardından, Yumurtalıkprojeksiyon penceresinde ki blobları bul adlı iletişim sekmesinde sinyal lekelerinin boyutunu tanımlayın.Sigma ve en az tepe değerini tanımlayın. Daha sonra, yeşil lekeler olarak görünecek actomiyozin sinyalleri tanımlamak için hesaplama ya basın. Yaklaşık 100 nokta bulunana kadar farklı parametrelerle bu adımı yeniden deneyin.Actomiyozin sinyallerini tanımlamak çok önemli bir adımdır. Sinyal kalitesine ve algılanan lekelerin doğru boyutuna bağlıdır. Görüntüde görünür yeşil noktalar yoksa, bir sonraki adım çalışmaz.Elipsoidi tasarlamak için fit elipsoid adı verilen sekmeyle devam edin. Rasgele örnekleri 10,000'e, dış/iç kesme mesafesini 1'den 10'a ayarlayın ve ardından hesaplamayı tıklatın. Bundan sonra, projeksiyon adı verilen sekme otomatik olarak açılır ve yüzey ekstraksiyonunun tanımına izin verir.Projeksiyon sekmesinde, istenilen elipsoid genişliği olarak minimum ve maksimum projeksiyon mesafesi ayarlayın. Pembe tanımlı elipsoid bölge yumurta odasının tüm dış tabakasını içermelidir böylece minimal ve maksimal projeksiyon mesafesi uygun olmalıdır. Ardından, dilim uzaklığı bir olarak tanımlayın.Hesaplamaya basmadan önce elipsoidin pembe bölgesinin yumurta odası üzerinde tanımlanan pembe bölgesinin görünür olduğundan emin olun. Bu yeni bir elipsoid uyum kalitesini değerlendirmek için yardımcı olur. Ardından, elipsoidin çıkış genişliğini 800'den büyük veya eşit ve 400'den büyük veya eşit bir yüksekliğe ayarlayın.Daha sonra, yüzey çıkarma süresini ayarlayın ve küresel veya silindirik bir projeksiyon seçin. Gerekirse, görüntü adı verilen yeni pencerelerdeki her iki kanal için de yüzey ekstraksiyonu elde etmek için Z tuşuna basın ve Y.Press bilgisayarlarını hizala. Görüntü'ye tıklayarak, Ayarla'ya giderek ve Parlaklık/Kontrast'ı seçerek yansıtılan actomiyozin sinyallerini görebilmek için elde edilen görüntü pencerelerinin parlaklığını ve kontrastını ayarlayın.Yüzey ekstraksiyonu iyi görünüyorsa, her iki kanalı da TIFF dosyaları olarak ayrı ayrı kaydedin. Ayrıca, bu yumurta odasının yüzeyinin nasıl çıkarıldığına yönelik ileride başvuru için Log penceresi dosyasını kaydedin. Ardından, kanalları Fiji'de tercih edilen bir renk koduyla birleştirin ve sonuçları TIFF dosyaları olarak kaydedin.Bu protokol bilim adamlarının epitel dokularda actomiyozin ağlarının davranışını araştırmalarını sağlar. Bu ancak yerel hücresel ölçekte aktomiyozin davranışının ayrıntılı bir analizi doku ölçeğinde benzer bir analiz ile kombine edildiğinde mümkündür. Burada gösterilen yerel hücresel ölçekte dinamik miyozin II davranışıtemsili örnekler ve kontrol ve fat2 mutant Drosophila yumurta odaları için doku ölçeğinde.Bazal tek düzlemde, miyozin II sinyallerinin yeşil modifiye düzenleyici ışık zinciri kontrol yumurta odalarının ön-posterior eksenine dik hareket. Bu polarite fat2 mutant yumurta odalarında kaybolur ve anisotropik miyozin II darbeleryol açar, doku düzeyinde salınımlar, kontrol örneğinde miyozin II yeşil modifiye düzenleyici ışık zinciri epitel rotasyonu teşvik etmek için gerekli senkronize kuvvet oluşturur. Buna karşılık, bazal tarafında güçlü bir yağ2 mutant yumurta odası nabız folikül epitel ve epitel rotasyon teşvik etmek için gerekli senkronize kuvvet oluşturmak için başarısız olur.Drosophila yumurta odası ince bir apikal bölgede, fat2 mutant da miyozin II yeşil modifiye düzenleyici ışık zincirinin değiştirilmiş dinamik davranış ile sunar.Bu videoyu izledikten sonra, Fiji kullanarak Drosophila yumurta odalarında yerel ve doku ölçeğinde bir actomiyozin ağ analiz etmek için nasıl iyi bir fikir olmalıdır. Daha fazla pratik ipucu ve sorun giderme için lütfen protokolden sonraki tartışma bölümüne bakın. Fiji veya eklentilerimizle ilgili sorularınız varsa, ilgili web sayfalarına bakın veya bizimle iletişime geçin.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Dik Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Odaları

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Görüntüleme Kalsiyum<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Aktifleştirme de

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

bir<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Yöntem kültürlü Rat Mezenterik Mikrovasküler Ağları Time-Lapse Görüntüleme için

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Vasculogenesis Kinetik analizi Vasculogenesis ve anjiogenezi Vitro dinamiklerini Quantifies

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...