Name: how to quantify the fraction of photoactivated fluorescent proteins in bulk and in live cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dorigo laboratorium og neurovidenskab Imaging Service på Stanford University School of Medicine for at levere udstyr og plads til dette projekt.

1. plasmid konstruktion
<ol><li>Generere to-farve fusion sonder. Bruge et pattedyr celle udtryk vektor (Se Tabel af materialer) i hvilken mCherry112 og PA-mCherry113 er blevet indsat med begrænsningen websteder, AgeI og BsrGI.
</li>
	<li>Bestille brugerdefinerede oligo-nukleotider til at forstærke de monomere varianter af eGFP og PA-eGFP indeholdende A206K mutation, dvs., mEGFP og PA-mEGFP14 uden en sto...

<ol>
	<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li><li>Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+9.">Ch. 9.</a> The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. , 201-228 (2014).</li><li>Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocontrollable+fluorescent+proteins+for+superresolution+imaging.">Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging.</a> Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Henderson, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+photoactivatable+green+fluorescent+protein.">Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+mechanism+of+PAmCherry+based+on+crystal+structures+of+the+protein+in+the+dark+and+fluorescent+states.">Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).</li><li>Wiedenmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EosFP,+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion.">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li><li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mKikGR,+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein.">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3 (12), e3944 (2008).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Slocum, J. D., Webb, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Double+Decarboxylation+in+Superfolder+Green+Fluorescent+Protein+Leads+to+High+Contrast+Photoactivation.">A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation.</a> Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).</li><li>Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+monomeric+photoactivatable+red+fluorescent+protein+for+two-color+super-resolution+sptPALM+of+live+cells.">Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).</li><li>Renz, M., Wunder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+rulers+to+assess+fluorescent+protein+photoactivation+efficiency.">Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency.</a> Cytometry A. , (2017).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).</li></ol>

Hidtil, eksisterede ingen metode til at bestemme i løs vægt brøkdel af PA-FPs udtrykt i levende celler, der er photoactivated at være fluorescerende. Den præsenterede protokol kan bruges til ethvert spektralt forskellige fluorescerende proteiner par. Mens eksemplificeret her for den uigenkaldelige PA-FPs PA-normal god landbrugspraksis og PA-kirsebær, er denne fremgangsmåde i princippet gældende til photoconvertible proteiner samt. Den spektralt forskellige fluorescerende proteiner, men skal vælges omhyggeligt at...

I 2002, var den første store træk gældende photoactivatable (PA-normal god landbrugspraksis1) og photoconvertible (Kaede2) fluorescerende proteiner beskrevet. Disse optiske overstregningstusch fluorescerende proteiner ændrer deres spektrale egenskaber ved bestråling med UV-lys, dvs., de bliver lyse (photoactivatable fluorescerende proteiner, dvs., PA-FPs), eller ændre deres farve (photoconvertible FPs). Til dato har adskillige reversibel og irreversibel photoactivatable og photoconvertible fluorescerende proteiner været udviklet3,4. I ensemble eller bulk undersøgelser, har optisk overstregningstuscher været brugt til at studere dynamikken i hele celler eller proteiner, og tilslutning af subcellulært rum. Derudover baseret optisk overstregningstuscher aktiveret enkelt-molekyle superresolution imaging teknikker som PALM5 og FPALM6.
Selv om fotokemiske processer under photoactivation eller -konvertering er blevet beskrevet for mange optisk overstregningstuscher og endda krystallografiske strukturer før og efter photoactivation / - konvertering er blevet gjort tilgængelig7 , 8, den underliggende fotografifysiske mekanisme photoactivation og - konvertering er ikke helt forstået. Derudover hidtil kun rå estimater findes effektivisering af photoactivation og -konvertering, dvs brøkdel af fluorescerende proteiner udtrykt det er faktisk photoconverted eller photoactivated at være fluorescerende. In vitro ensemble undersøgelser har været rapporteret kvantificere skift i absorptionsspektre og mængden af indfødte og aktiveret protein i en gel9,10,11.
Vi præsenterer her, en protokol, der involverer fluorescerende proteiner kimærer for at vurdere brøkdel af photoactivated fluorescerende proteiner i bulk og i levende celler. Når arbejder med genetisk kodet fluorescerende proteiner, den absolutte mængde af protein udtrykt varierer fra celle til celle og er ukendt. Hvis en celle udtrykker et PA-FP viser en lysere signal efter photoactivation end en anden celle, kan det være differentieret hvis dette lysere signal skyldes højere udtryk for PA-FP eller en mere effektiv photoactivation af PA-FP. For at standardisere udtryk niveau i cellerne, indfører vi interne herskere af genetisk koblede spektralt forskellige fluorescerende proteiner. Af kobling den genetiske information af en photoactivatable fluorescerende proteiner for en spektralt særskilte altid-på fluorescerende proteiner, interne herskere er lavet, vil stadig udtrykkes et ukendt beløb, men i en fast og kendt relative mængde af 1:1. denne strategi giver kvantitative karakterisering af forskellige UV-lys photoactivation ordninger, dvs., vurdering af den relative mængde af PA-FPs, der kan være photoactivated med forskellige former for photoactivation, og dermed tillader at definere photoactivation ordninger, der er mere effektive end andre. Desuden, denne strategi giver i princippet vurdering af den absolutte kvantificering af photoactivated PA-FP brøkdel. Med henblik herpå er det vigtigt at indse, at præsenteres ensemble undersøgelser intensitet-baseret som gør analysen mere kompliceret som fastlagt i denne protokol. Parametre fastlæggelsen af målte fluorescerende intensitet, dvs., forskellige molekylære lysstyrke, absorbans og emission spectra og FRET virkninger, skal overvejes, når man sammenligner fluorescens intensiteter af forskellige fluorescerende proteiner.
Præsenteres ratiometric intensitet-baserede kvantificering af photoactivation effektivitet er eksemplificeret for PA-normal god landbrugspraksis og PA-kirsebær i levende celler, men er i princippet stort set gældende og kan bruges til enhver photoactivatable fluorescerende proteiner under nogen eksperimentelle tilstand.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pEGFP-N1 mammalian cell expression vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM w/o phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin w/o phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

how to quantify the fraction of photoactivated fluorescent proteins in bulk and in live cells

Photoactivatable og -konvertible fluorescerende proteiner (PA-FPs) har været brugt i fluorescens live-celle mikroskopi til at analysere dynamikken i celler og protein ensembler. Hidtil, ingen metode har været til rådighed til at kvantificere i bulk og i levende celler, hvor mange af PA-FPs udtrykt er photoactivated til fluorescerer.
Her, præsenterer vi en protokol, der involverer interne herskere, dvs, genetisk koblet spektralt særskilt (photoactivatable) fluorescerende proteiner, til ratiometrically kvantificere brøkdel af alle PA-FPs udtrykt i en celle, der er tændt for at være fluorescerende. Bruger denne protokol, viser vi, at forskellige former for photoactivation givet forskellige photoactivation effektivitet. Kort bølgelængde photoactivation med en Konfokal laser scanning mikroskop (CLSM) resulterede i op til fire gange lavere photoactivation effektivitet end hundredvis af low-level engagementer anvendes af CLSM eller en kort puls anvendes af widefield belysning. Mens protokollen har været eksemplificeret her for (PA-) normal god landbrugspraksis og (PA-) kirsebær, kan det i princippet anvendes til ethvert spektralt særskilt photoactivatable eller photoconvertible fluorescerende proteiner par og enhver eksperimentelle set-up.

Viser den protokol, der præsenteres her ratiometric kvantificering af brøkdel af fluorescerende proteiner, der er photoactivated at være fluorescerende (figur 1). Denne fraktion er forskellig afhængigt af tilstanden af photoactivation.
En typisk resultat ved hjælp af kort tid high-power photoactivation med en Konfokal laser scanning mikroskop (CLSM) er vist i figur 2 c</str...

Watch this Scientific Journal Video about How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells at JoVE.com

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hvordan man kan kvantificere brøkdel af Photoactivated fluorescerende proteiner i Bulk og i levende celler

Vi præsenterer her, en protokol, der involverer genetisk koblede spektralt særskilte photoactivatable og fluorescerende proteiner. Disse fluorescerende proteiner kimærer tillade kvantificering af de PA-FP fraktion, der er photoactivated at være fluorescerende, dvs., photoactivation effektivitet. Protokollen afslører, at forskellige former for photoactivation give forskellige photoactivation effektivitet.

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Vi præsenterer her en protokol, der involverer genetisk koblede spektrally forskellige foto-aktiverelige og fluorescerende proteiner. Disse interne linealer gør det muligt at kvantificere den PAFP-fraktion, der er fotoaktiveret, til at være fluorescerende. Hidtil har der ikke været nogen metode til at kvantificere i løs vægt i livsceller, hvor mange af PAFP udtrykt er foto aktiveret til fluorescerende. Den præsenterede kvantificering af fotoaktiveringseffektivitet eksemplificeres for PA-GFP og PA Cherry i levende celler, men det er i princippet bredt anvendeligt og kan anvendes til ethvert fotoaktivatorisk fluorescerende protein under enhver eksperimentel tilstand. Når man arbejder med genetisk kodede fluorescerende proteiner, varierer den absolutte mængde proteiner fra celle til celle, og det er ukendt. For at standardisere ekspressionen blandt celler introducerer vi interne herskere af genetisk koblede spektrally forskellige fluorescerende proteiner. Ved at koble den genetiske information af et fotoaktiveret lysstofprotein til et spektrisk særskilt altid på fluorescerende protein interne linealer skabes, som stadig vil blive udtrykt til en ukendt samlet mængde, men i en fast kendt relativ mængde af en til en. For at begynde at konstruere plasmider som beskrevet i den medfølgende tekstprotokol. Også kultur i standard celle linje i sit perspektiv medium ved hjælp af phenol rød gratis version. Når du er klar til at begynde forsøget, høste cellerne ved hjælp af trypsin uden phenol rød for at reducere baggrunden florescence. Efter høst fyldes en 2 ml pipette med cellesuspensionen fra en sammenløbet cellekultur, der dyrkes i en T 12.5 cellekulturkolbe. Tilføj en dråbe i hvert kammer af en otte kammer glas dias. Skuber diaset under standardcellekulturbetingelser i 24 timer. Næste transfect cellerne ved hjælp af kommercielle reagenser efter distributører protokol. Transfect cellerne med GFP Cherry, PA-GFP Cherry og GFPPA Cherry kimærer. Vend derefter cellerne tilbage til kuvøsen for at give mulighed for proteinudtryk, foldning og modning. Efter i alt 20 timer efter transfektion, overføre cellerne til det stadium af en konfokal florescent mikroskop udstyret med befugtet og opvarmet miljøkammer forvarmet til 37

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termostabilisering, Expression, Rensning, og Krystallisation af Human Serotonin Transporter Bundet til<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Forberedelse af Keratin hydrolysat fra kylling fjer og dens anvendelse i kosmetik

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Ændre Baculovirus udtryk vektorer til at producere udskilles vegetabilske proteiner i insekt celler

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende sølv farvning af proteinerne i polyacrylamidgeler

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Ved hjælp af højt indhold Imaging for at kvantificere mål Engagement i vedhængende celler

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Brug af rekombinant Fusion proteiner i et fluorescerende Protease Assay Platform og deres i-gel genopretning

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering af SUMO-modificerede proteiner ved hjælp af fluorescerende Sumo-diffuse Rings proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Analyse af interaktionen mellem fluorescerende mærkede proteiner med kunstige fosfolipidmikrovesikler ved hjælp af kvantitativ flowcytometri

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...