Name: how to quantify the fraction of photoactivated fluorescent proteins in bulk and in live cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells at JoVE.com

Wij wil het Dorigo laboratorium en de neurowetenschappen Imaging Service aan Stanford University School of Medicine bedanken voor het verstrekken van apparatuur en ruimte voor dit project.

1. plasmide bouw
<ol><li>Twee kleuren fusion sondes te genereren. Gebruik een vector van zoogdiercellen expressie (Zie Tabel van materialen) in welke mCherry112 en13 van de PA-mCherry1 zijn ingevoegd met de beperking sites AgeI en BsrGI.
</li>
	<li>Aangepaste oligo-nucleotiden aan het versterken van de monomere varianten van eGFP en PA-eGFP met de A206K mutatie, dat wil zeggen, mEGFP en PA-mEGFP14 zonder ...

<ol>
	<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li><li>Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+9.">Ch. 9.</a> The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. , 201-228 (2014).</li><li>Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocontrollable+fluorescent+proteins+for+superresolution+imaging.">Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging.</a> Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Henderson, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+photoactivatable+green+fluorescent+protein.">Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+mechanism+of+PAmCherry+based+on+crystal+structures+of+the+protein+in+the+dark+and+fluorescent+states.">Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).</li><li>Wiedenmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EosFP,+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion.">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li><li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mKikGR,+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein.">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3 (12), e3944 (2008).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Slocum, J. D., Webb, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Double+Decarboxylation+in+Superfolder+Green+Fluorescent+Protein+Leads+to+High+Contrast+Photoactivation.">A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation.</a> Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).</li><li>Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+monomeric+photoactivatable+red+fluorescent+protein+for+two-color+super-resolution+sptPALM+of+live+cells.">Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).</li><li>Renz, M., Wunder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+rulers+to+assess+fluorescent+protein+photoactivation+efficiency.">Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency.</a> Cytometry A. , (2017).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).</li></ol>

Tot nu toe bestond geen methode om te bepalen in de bulk van de Fractie van de PA-FPs uitgedrukt in levende cellen die photoactivated als tl. Het gepresenteerde protocol kan worden gebruikt voor elk paar spectraal verschillende fluorescente proteïne. Terwijl geïllustreerd hier voor de onomkeerbare PA-FPs PA-GFP en PA-Cherry, is deze aanpak in principe van toepassing op photoconvertible eiwitten zo goed. De spectraal verschillende fluorescente proteïne, echter moet worden geselecteerd zorgvuldig om te minimaliseren van...

In 2002, werden de eerste breed toepasbare photoactivatable (PA-GFP1) en photoconvertible (Kaede2) fluorescente proteïnen beschreven. Deze optische markeerstift fluorescente proteïnen wijzigen hun spectrale eigenschappen bij bestraling met UV-licht, dat wil zeggen, ze helder (photoactivatable fluorescerende eiwitten, dat wil zeggen, PA-FPs) of hun kleur (photoconvertible wijzigen FPs). Tot op heden, zijn verschillende omkeerbaar en onomkeerbare photoactivatable en photoconvertible fluorescerende eiwitten ontwikkelde3,4. In ensemble of bulk studies, zijn optische markeerstiften gebruikt om de dynamiek van hele cellen of eiwitten, en de connectiviteit van subcellular compartimenten te studeren. Bovendien gebaseerd optische markeerstiften ingeschakeld single-molecuul super-resolution beeldvormende technieken zoals PALM5 en FPALM6.
Hoewel de foto-chemische tijdens processen photoactivation of -conversie zijn beschreven voor vele optische markeerstiften en zelfs kristallografische structuren voor en na photoactivation / - conversie beschikbaar7 zijn aangebracht , 8, het onderliggendefysieke mechanisme van de foto van photoactivation en -conversie is niet volledig begrepen. Bovendien, tot nu toe slechts ruwe schattingen bestaan uit de efficiëntie van photoactivation en -conversie, dat wil zeggen, de Fractie van fluorescente proteïnen uitgedrukt dat is eigenlijk photoconverted of photoactivated als tl. In vitro ensemble studies hebben gemeld kwantificering van de verschuiving in de absorptiespectra en het bedrag voor native en geactiveerd proteïne in een gel9,10,11.
Hier presenteren we een protocol waarbij fluorescent proteïne Chimaera om te beoordelen van de Fractie van photoactivated fluorescerende eiwitten in bulk en in levende cellen. Wanneer werkt met genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten, de absolute hoeveelheid eiwit uitgedrukt varieert van cel naar cel en is onbekend. Als één cel uiting van een PA-FP een helderder signaal na photoactivation dan een andere cel toont, kunnen niet worden onderscheiden als dit helderder signaal te wijten aan hogere uitdrukking van het PA-KP of een efficiënter photoactivation van het PA-KP is. Om te standaardiseren op het niveau van de expressie in cellen, introduceren we interne heersers van genetisch gekoppelde spectraal verschillende fluorescente proteïnen. Door koppeling van de genetische gegevens van een photoactivatable TL proteïne aan een spectraal verschillende altijd-op fluorescente proteïnen, interne linialen worden gemaakt die zal nog steeds worden uitgedrukt aan een onbekende totaalbedrag maar in een vaste en bekende relatieve hoeveelheid 1: 1. deze strategie staat de kwantitatieve karakterisering van verschillende UV-licht photoactivation regelingen, dat wil zeggen, de beoordeling van de relatieve hoeveelheid PA-FPs die kan worden photoactivated door de verschillende modi van photoactivation, en daardoor vergunningen definiëren van photoactivation regelingen die effectiever dan anderen zijn. Bovendien kan deze strategie in beginsel de beoordelingvan de absolute kwantificering van de photoactivated PA-FP breuk. Te dien einde is het belangrijk om te beseffen dat de gepresenteerde ensemble studies intensiteit gebaseerde waardoor de analyse meer complexe zijn zoals uiteengezet in dit protocol. Parameters bepalen de gemeten fluorescerende intensiteit, d.w.z., verschillende moleculaire helderheid, absorptie en emissie spectra en FRET effecten moeten worden overwogen bij het vergelijken van de fluorescentie intensiteiten van verschillende fluorescente proteïnen.
De kwantificering van de intensiteit gebaseerde van de gepresenteerde ratiometric van photoactivation-efficiëntie wordt geïllustreerd voor PA-GFP en PA-kers in levende cellen, maar is in principe breed toepasbare en kan worden gebruikt voor een photoactivatable fluorescerende eiwit onder experimentele conditie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pEGFP-N1 mammalian cell expression vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM w/o phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin w/o phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

how to quantify the fraction of photoactivated fluorescent proteins in bulk and in live cells

Photoactivatable en -converteerbare fluorescente proteïnen (PA-FPs) hebben in fluorescentie live-cel microscopie is gebruikt voor het analyseren van de dynamiek van cellen en eiwit ensembles. Tot nu toe geen methode beschikbaar te kwantificeren in bulk geweest en in levende cellen hoeveel van de PA-FPs uitgedrukt zijn photoactivated te lichten.
Hier presenteren we een protocol met betrekking tot interne heersers, dat wil zeggen, genetisch waaraan spectraal onderscheiden (photoactivatable) fluorescente proteïnen, ratiometrically kwantificeren van de Fractie van alle PA-FPs, uitgedrukt in een cel die zijn ingeschakeld als TL. Met behulp van dit protocol, laten we zien dat de verschillende vervoerswijzen photoactivation verschillende photoactivation efficiëntie opgeleverd. Korte high-power photoactivation met een confocale laser scanning microscoop (CLSM) resulteerde in tot viermaal lagere photoactivation efficiëntie dan honderden low-level vorderingen toegepast door CLSM of een korte puls toegepast door widefield verlichting. Terwijl het protocol heeft hier zijn geïllustreerd voor (PA-) GFP en Cherry (PA-), kan het in principe worden toegepast op elk spectraal verschillende photoactivatable of photoconvertible TL proteïne paar en een experimentele opstelling.

Het hier gepresenteerde protocol toont de kwantificering van de ratiometric van de Fractie van fluorescente proteïnen toe die photoactivated als tl (Figuur 1). Deze fractie verschilt afhankelijk van de wijze van photoactivation.
Een typisch resultaat met behulp van korte tijd high-power photoactivation met een confocale laser scanning microscoop (CLSM) wordt weergegeven in Figu...

Watch this Scientific Journal Video about How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells at JoVE.com

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hoe te kwantificeren van de Fractie van Photoactivated fluorescerende eiwitten in Bulk en in levende cellen

Hier presenteren we een protocol waarbij genetisch gekoppelde spectraal verschillende photoactivatable en fluorescente proteïnen. Deze TL proteïne Chimaera toestaan kwantificering van de PA-FP-breuk thats photoactivated als tl, dat wil zeggen, de efficiëntie van de photoactivation. Het protocol blijkt dat verschillende vervoerswijzen photoactivation verschillende photoactivation efficiëntieverbeteringen opleveren.

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

We presenteren hier een protocol dat genetisch gekoppelde spectrally verschillende foto-geactiveerde en fluorescerende eiwitten omvat. Deze interne linialen maken kwantificering van de PAFP-fractie mogelijk die wordt geactiveerd om fluorescerend te zijn. Tot nu toe is er geen methode beschikbaar om in bulk in levenscellen te kwantificeren hoeveel van de uitgedrukte PAFP's zijn geactiveerd om te fluoresten. De gepresenteerde kwantificering van foto-activering efficiëntie wordt geïllustreerd voor PA-GFP en PA Cherry in levende cellen, maar het is in principe breed toepasbaar en kan worden gebruikt voor elke foto-activatable fluorescerende eiwit onder een experimentele conditie. Wanneer het werken met genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten, de absolute hoeveelheid eiwitten uitgedrukt varieert van cel tot cel en het is onbekend. Om de expressie tussen cellen te standaardiseren, introduceren we interne heersers van genetisch gekoppelde spectrally verschillende fluorescerende eiwitten. Door de genetische informatie van een foto-activatable florescent eiwit te koppelen aan een spectraal onderscheiden altijd op fluorescerende eiwit interne heersers worden gemaakt die nog steeds zal worden uitgedrukt tot een onbekende totale hoeveelheid, maar in een vaste bekende relatieve hoeveelheid van een op een. Om te beginnen met de bouw van de plasmiden zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Ook cultuur in de standaard cellijn in zijn perspectiefmedium met behulp van de fenol rode gratis versie. Wanneer klaar om het experiment te beginnen, oogst de cellen met behulp van trypsine zonder fenol rood om achtergrond florescentie te verminderen. Vul na de oogst een pipet van 2 ml met de celsuspensie van een samenvloeiende celkweek die in een T 12,5-celkweek wordt gekweekt. Voeg een druppel in elke kamer van een acht kamer glazen dia. De glijbaan gedurende 24 uur onder standaard celkweekomstandigheden uitbroeden. Vervolgens transfect de cellen met behulp van commerciële reagentia volgens de distributeurs protocol. Transfecteer de cellen met de GFP Cherry, PA-GFP Cherry en GFPPA Cherry chimaera's. Breng de cellen vervolgens terug naar de couveuse om eiwitexpressie, vouwen en rijping mogelijk te maken. Breng de cellen na in totaal 20 uur na de doorfectie over naar het stadium van een confocale fluakelmicroscoop die is uitgerust met de bevochtigde en verwarmde milieukamer die voorverwarmd is naar 37

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan<em&gt; S</em&gt; citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Voorbereiding van keratine hydrolysaat van kippenveren en haar toepassing in cosmetica

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Wijzigen Baculovirus expressievectoren voor de productie van plantaardige eiwitten in Insect cellen uitgescheiden

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Met behulp van hoog gehalte Imaging om te kwantificeren Target Engagement in Adherente cellen

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Gebruik van recombinante Fusion eiwitten in een fluorescerende Protease Assay Platform en hun In-gel renaturatie

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisatie van SUMO-gemodificeerde eiwitten met behulp van fluorescerende Sumo-trapping eiwitten

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Analyse van de interactie van fluorescerende gelabelde eiwitten met kunstmatige fosfolipide microvesicles met behulp van kwantitatieve flowcytometrie

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...