Name: how to quantify the fraction of photoactivated fluorescent proteins in bulk and in live cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells at JoVE.com

Nous tenons à remercier le laboratoire Dorigo et le Service d’imagerie de Neuroscience à la Stanford University School of Medicine pour la fourniture d’équipements et espace pour ce projet.

1. Construction de plasmide
<ol><li>Générer des sondes de la fusion de deux couleurs. Utiliser un vecteur d’expression de cellules de mammifères (voir Table des matières) dans lequel mCherry112 et PA-mCherry1,13 ont été insérés avec la restriction sites AgeI et BsrGI.
</li>
	<li>Commande personnalisée oligo-nucléotides pour amplifier les variantes monomères d’eGFP et PA-eGFP contenant l’A206K mutation, c'est-à-dire,...

<ol>
	<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li><li>Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+9.">Ch. 9.</a> The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. , 201-228 (2014).</li><li>Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocontrollable+fluorescent+proteins+for+superresolution+imaging.">Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging.</a> Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Henderson, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+photoactivatable+green+fluorescent+protein.">Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+mechanism+of+PAmCherry+based+on+crystal+structures+of+the+protein+in+the+dark+and+fluorescent+states.">Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).</li><li>Wiedenmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EosFP,+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion.">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li><li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mKikGR,+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein.">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3 (12), e3944 (2008).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Slocum, J. D., Webb, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Double+Decarboxylation+in+Superfolder+Green+Fluorescent+Protein+Leads+to+High+Contrast+Photoactivation.">A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation.</a> Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).</li><li>Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+monomeric+photoactivatable+red+fluorescent+protein+for+two-color+super-resolution+sptPALM+of+live+cells.">Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).</li><li>Renz, M., Wunder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+rulers+to+assess+fluorescent+protein+photoactivation+efficiency.">Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency.</a> Cytometry A. , (2017).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).</li></ol>

Jusqu’ici, aucune méthode n’existait pour déterminer, en vrac, la fraction de PA-FPs exprimées dans des cellules vivantes qui est photoactivées d’être fluorescente. Le protocole présenté peut être utilisé pour n’importe quelle paire de protéine fluorescente spectralement distinctes. Bien qu’illustrée ici pour l’irréversible PA-FPs PA-GFP et PA-cerise, cette approche est en principe applicable aux protéines et ainsi. La protéine fluorescente spectralement distincte, toutefois, doit être sélecti...

En 2002, le premier largement applicable photoactivatable (PA-GFP1) et des protéines fluorescentes et (Kaede2) ont été décrits. Ces protéines fluorescentes surligneur optique modifier leurs propriétés spectrales lors de l’irradiation UV-lumière, c'est-à-dire, ils deviennent lumineux (protéines fluorescentes photoactivatable, c.-à-d., PA-FPs), ou changer leur couleur (et Images/s). A ce jour, plusieurs réversibles et irréversibles photoactivatable et et protéines fluorescentes ont été développés3,4. Dans les études d’ensemble ou en vrac, surligneurs optiques ont été utilisés pour étudier la dynamique des cellules entières ou des protéines et la connectivité des compartiments subcellulaires. En outre, surligneurs optique activées seule molécule basée superrésolution imaging techniques telles que PALM5 et6de la FPALM.
Bien que la photochimique traite pendant photoactivation ou - conversion ont été décrits pour de nombreuses optiques surligneurs et structures cristallographiques même avant et après photoactivation / - conversion ont disponible7 , 8, le mécanismephysique sous-jacent de photo de photoactivation et - conversion n’est pas complètement élucidé. En outre, jusqu’ici seulement brutes estimations existent de l’efficacité de photoactivation et - conversion, c'est-à-dire la fraction des protéines fluorescentes exprimées autrement dit effectivement photoconverted ou photoactivation être fluorescent. Des études in vitro ensemble ont été signalés à quantifier la Maj dans les spectres d’absorption et de la quantité de natif et activé des protéines dans un gel9,10,11.
Nous présentons ici un protocole impliquant les chimères de la protéine fluorescente afin d’évaluer la fraction des protéines fluorescentes photoactivation en vrac et dans des cellules vivantes. Chaque fois que travaillant avec des protéines fluorescentes génétiquement encodés, la quantité absolue de la protéine exprimée varie de cellule en cellule et ne connaît pas. Si une cellule exprimant une PA-FP présente un signal plus clair après photoactivation qu’une autre cellule, on ne peut pas différencier si ce signal lumineux est due à une expression plus élevée de la PA-FP ou une photoactivation plus efficace du PA-FP. Pour uniformiser le niveau d’expression dans les cellules, nous introduisons des règles internes de protéines fluorescentes spectralement distinctes génétiquement couplés. Par couplage de l’information génétique d’une protéine fluorescente photoactivatable à un spectralement distincts toujours en protéines fluorescentes, règles internes sont créés qui sera toujours exprimé pour un montant inconnu, mais dans une quantité relative fixe et connue de 1 : 1. cette stratégie permet la caractérisation quantitative des différents régimes photoactivation lumière UV, c'est-à-dire l’évaluation de la quantité relative de PA-FPs pouvant être photoactivées avec différents modes de photoactivation, et permet donc pour définir des schémas de photoactivation qui sont plus efficaces que d’autres. En outre, cette stratégie permet en principe de l’évaluation de la quantification absolue de la fraction de photoactivation PA-FP. À cette fin, il est important de réaliser que les études d’ensemble présenté sont fondés sur l’intensité qui rend l’analyse plus complexe comme décrit dans le présent protocole. Paramètres déterminant l’intensité de fluorescence mesurée, c'est-à-dire différentes luminosité moléculaire, absorbance et spectres d’émission et effets de la frette, doivent être examinées lors de la comparaison des intensités de fluorescence de différentes protéines fluorescentes.
La quantification de basé sur l’intensité ratiométrique présenté de photoactivation efficacité est illustrée pour PA-GFP et PA-Cherry dans des cellules vivantes, mais est en principe largement applicables et peut être utilisée pour n’importe quelle protéine fluorescente photoactivatable sous aucune conditions expérimentales.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pEGFP-N1 mammalian cell expression vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM w/o phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin w/o phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

how to quantify the fraction of photoactivated fluorescent proteins in bulk and in live cells

Photoactivatable et - protéines fluorescentes convertibles (PA-FPs) ont été utilisés en microscopie de fluorescence cellules vivantes pour analyser la dynamique des cellules et des ensembles de protéines. Jusqu’ici, aucune méthode n’a été disponible à quantifier en vrac et en live cellules exprimé combien du PA-SFP sont photoactivation de fluorescence.
Ici, nous présentons un protocole mettant en cause des règles internes, c'est-à-dire génétiquement couplés protéines fluorescentes spectralement distinctes (photoactivatable), à ratiometrically quantifier la fraction de tous les PA-MF intégré à une cellule qui s’allument pour être fluorescent. Utilisant ce protocole, nous montrons que les différents modes de photoactivation donné photoactivation différentes efficacités. Courte photoactivation haute puissance avec un confocal laser scanning microscope (CLSM) a entraîné jusqu'à quatre fois plus faible photoactivation efficacité que des centaines d’expositions bas niveau appliquées par CLSM ou une brève impulsion appliquée par widefield illumination. Alors que le protocole a été exemplifié ici pour GFP (PA-) et Cherry (PA-), il peut en principe être appliqué à n’importe quelle paire de protéine fluorescente photoactivatable ou et spectralement distinctes et tout montage expérimental.

Le protocole présenté ici montre la quantification logométrique de la fraction des protéines fluorescentes qui sont photoactivées d’être fluorescente (Figure 1). Cette fraction est différent selon le mode de photoactivation.
Le résultat typique à l’aide de photoactivation de haute puissance peu de temps avec un confocal laser scanning microscope (CLSM) est affiché à la <strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells at JoVE.com

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Comment quantifier la Fraction des protéines fluorescentes photoactivation en vrac et dans des cellules vivantes

Nous présentons ici un protocole qui implique de photoactivatable spectralement distincte génétiquement couplé et des protéines fluorescentes. Ces chimères de la protéine fluorescente permettent de quantification de la fraction de PA-FP est photoactivation être fluorescents, c'est-à-dire l’efficacité de photoactivation. Le protocole indique que les différents modes de photoactivation rendement photoactivation différentes efficacités.

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Nous présentons ici un protocole qui implique des protéines photoactivables et fluorescentes génétiquement couplées spectralement distinctes. Ces règles internes permettent la quantification de la fraction PAFP qui est photo activée pour être fluorescente. Jusqu’à présent, aucune méthode n’a été disponible pour quantifier en vrac dans les cellules de vie combien de pafp exprimés sont photo activé à fluoresce. La quantification présentée de l’efficacité de la photo-activation est illustrée pour PA-GFP et PA Cherry dans les cellules vivantes, mais elle est en principe largement applicable et peut être utilisée pour n’importe quelle protéine fluorescente photoactivable dans n’importe quelle condition expérimentale. Chaque fois que vous travaillez avec des protéines fluorescentes génétiquement codées, la quantité absolue de protéines exprimées varie d’une cellule à l’autre et elle est inconnue. Pour normaliser l’expression entre les cellules, nous introduisons des règles internes de protéines fluorescentes génétiquement couplées spectralement distinctes. En coupant l’information génétique d’une protéine florescent photo-activateable à une distincte spectrale toujours sur les règles internes de protéine fluorescente sont créées qui seront toujours exprimées à une quantité totale inconnue mais dans une quantité relative connue fixe d’un à un. Pour commencer à construire les plasmides tels que décrits dans le protocole texte qui l’accompagne. En outre, la culture dans la ligne cellulaire standard dans son milieu de perspective en utilisant la version sans phénol rouge. Lorsqu’elles sont prêtes à commencer l’expérience, récoltez les cellules à l’aide de trypsine sans rouge phénol pour réduire la florescence de fond. Après la récolte, remplir une pipette de 2 ml avec la suspension cellulaire d’une culture cellulaire confluente cultivée dans un flacon de culture cellulaire T 12,5. Ajouter une goutte dans chaque chambre d’une glissière en verre de huit chambre. Incuber la diapositive dans des conditions normales de culture cellulaire pendant 24 heures. Ensuite, transfectez les cellules à l’aide de reagents commerciaux suivant le protocole des distributeurs. Transfect les cellules avec les chimères GFP Cherry, PA-GFP Cherry et GFPPA Cherry. Retournez ensuite les cellules à l’incubateur pour permettre l’expression des protéines, le pliage et la maturation. Après un total de 20 heures après transfection, transférer les cellules au stade d’un microscope florescent confocal équipé de la chambre environnementale humidifiée et chauffée préchauffée à 37

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilisation, Expression, purification et cristallisation du Serotonin Human Transporter Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Recherche

Biochimie

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Préparation d’hydrolysat de kératine des plumes de poulet et son Application dans les produits cosmétiques

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimétrie dissipatif pour étudier la dynamique de la liaison des phospholipides Binding Protein annexine A2 de bicouches lipidiques solide soutenu par utilisant un résonateur à Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Modification des vecteurs d’Expression Baculovirus pour produire sécrétée des protéines végétales dans des cellules d’insecte

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescent coloration à l’argent des protéines dans les Gels de Polyacrylamide

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

À l’aide de contenu élevé d’imagerie afin de quantifier l’Engagement de cibles en cellules adhérentes

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Utilisation des protéines de Fusion recombinantes dans une plate-forme de test de protéase Fluorescent et leur Renaturation en gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse de repliement des protéines, des transports et dégradation dans les cellules vivantes par radioactifs Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Localisation des protéines modifiées par SUMO à l’aide de protéines de piégeage du sumo fluorescent

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Analyse de l’interaction des protéines marquées par fluorescence avec des microvésicules de phospholipides artificielles à l’aide de la cytométrie quantitative en flux

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...