Name: how to quantify the fraction of photoactivated fluorescent proteins in bulk and in live cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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我々 はこのプロジェクトの設備やスペースを提供するため Dorigo 研究所、スタンフォード大学医学部で神経イメージング サービスを感謝したいです。

1. プラスミド構築
<ol><li>2 色のフュージョン プローブを生成します。哺乳動物細胞発現ベクターを使用 (材料の表を参照) を mCherry112と PA mCherry113制限に挿入されているサイトの上井とBsrGI 。
</li>
	<li>EGFP と A206K の突然変異、すなわちmEGFP、 SalI 病原フラグメントとして停止コドンせず PA mEGFP14を含む...

<ol>
	<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li><li>Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+9.">Ch. 9.</a> The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. , 201-228 (2014).</li><li>Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocontrollable+fluorescent+proteins+for+superresolution+imaging.">Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging.</a> Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Henderson, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+photoactivatable+green+fluorescent+protein.">Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+mechanism+of+PAmCherry+based+on+crystal+structures+of+the+protein+in+the+dark+and+fluorescent+states.">Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).</li><li>Wiedenmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EosFP,+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion.">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li><li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mKikGR,+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein.">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3 (12), e3944 (2008).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Slocum, J. D., Webb, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Double+Decarboxylation+in+Superfolder+Green+Fluorescent+Protein+Leads+to+High+Contrast+Photoactivation.">A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation.</a> Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).</li><li>Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+monomeric+photoactivatable+red+fluorescent+protein+for+two-color+super-resolution+sptPALM+of+live+cells.">Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).</li><li>Renz, M., Wunder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+rulers+to+assess+fluorescent+protein+photoactivation+efficiency.">Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency.</a> Cytometry A. , (2017).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).</li></ol>

これまでのところ、PA-FPs の生きている細胞に発現する蛍光センサーである分数を一括で確認する方法は存在しません。提案するプロトコルは、任意の波長の異なる蛍光タンパク質ペアに対して使用できます。PA FPs PA GFP と PA 桜の不可逆的にここで代表される、このアプローチは、蛍光タンパク質を同様に適用可能な原則です。しかし、波長の異なる蛍光タンパク質はことを考えると光変換蛍...

2002 年に、最初に広く適用光活性化 (PA GFP1) ・蛍光 (楓2) 蛍光タンパク質が記述されていた。これら光蛍光蛍光タンパク質 UV 光、すなわち照射時にそのスペクトル特性を変更彼らが明るいになる (活性型蛍光蛋白質、すなわち、 PA FPs)、または (蛍光色を変更します。FPs)。日には、いくつか可逆・不可逆的な光活性化・光変換蛍光蛋白質は開発3,4をされています。アンサンブルや一括学全体の細胞やタンパク質のダイナミクスと細胞内コンパートメントの接続を勉強する光蛍光ペンを使用されています。さらに、単一分子光蛍光ペンを有効に基づく超解像イメージング技術のパーム5 FPALM6などです。
中に、写真化学処理が photoactivation の前後には、photoactivation または変換には多くの光の蛍光ペンとも結晶構造について記載されている/- 変換を行われているご利用いただけます7,8、光変換の基になる写真物理機構が完全に理解されていません。さらに、これまでだけ粗見積もり存在の photoactivation、変換の効率は、つまり蛍光タンパク質の割合実際に photoconverted または蛍光するセンサー。吸収スペクトルとネイティブの量の変化を定量化し、ゲル9,10,11にタンパク質を活性化、アンサンブルin vitro研究が報告されています。
ここでは、蛍光タンパク質センサー蛍光タンパク質一括と生きている細胞の割合を評価するためにキメラを含むプロトコルを提案する.遺伝子符号化された蛍光蛋白質を使用、必ずタンパク質の絶対量は細胞から細胞への変化し、は知られています。PA FP を表現する 1 つのセルは他のセルよりも光後明るい信号を示している場合、この明るい信号 PA FP の高い表現や PA FP のより効率的な photoactivation のためが場合区別することはできません。細胞で発現レベルを標準化するには、遺伝子結合スペクトルの異なる蛍光蛋白質の内部支配者を紹介します。カップリング、スペクトルの異なる常に蛍光蛋白質、内部支配者活性型蛍光タンパク質の遺伝情報が作成されますが、まだ表現される未知の合計量ですが固定かつ知られている相対的な量1:1. この方法により別紫外線 photoactivation のスキーム、すなわち定量化の photoactivation、異なるモードでセンサーをすることができます、それによって許可 PA FPs の相対的な量の評価他の人よりも効果的 photoactivation スキームを定義します。さらに、この戦略は、原則として、センサー PA FP の端数の絶対定量評価をできます。このためには、実現するために提示されたアンサンブル研究強度に基づくこのプロトコルより複雑な解析になる重要です。蛍光強度、すなわち、別の分子の明るさ、吸光度発光スペクトルとフレットの効果を決定するパラメーターは、異なる蛍光タンパク質の蛍光強度を比較するときに考慮する必要があります。
光効率の提示のレシオ メトリック強烈さベース定量化 PA GFP および生きているセルの PA 桜の例示しますが、原則として広く適用といずれかに任意の活性型蛍光タンパク質に使用できます。実験の条件。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pEGFP-N1 mammalian cell expression vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM w/o phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin w/o phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

how to quantify the fraction of photoactivated fluorescent proteins in bulk and in live cells

光活性化・転換蛍光タンパク質 (PA FPs) は、細胞やタンパク質のアンサンブルのダイナミクスを分析するため生細胞の蛍光顕微鏡に使用されています。これまでのところ、方法がない一括で定量化されているし、ライブで PA FPs の数を表明した細胞が蛍光を発するにセンサー。
ここでは、内部の支配者を含むプロトコルを提案する、すなわち、遺伝子 ratiometrically に異なるスペクトル (活性型) 蛍光蛋白質を結合するをオンにセルで表されるすべての PA-FPs の割合を数値化蛍光。Photoactivation の異なるモードが異なる光効率を得られたことを示すこのプロトコルを使用して、.共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM) で短いハイパワー光と CLSM で適用される低レベルの曝露や広視野照明によって適用される短パルスの数百人よりも 4 倍低い光効率までなりました。プロトコルは GFP (PA-) と (PA-) 桜のここで例示していて、間それ原則的に適用できます任意のスペクトルの異なる活性型または蛍光蛍光タンパク質ペアとすべての実験の設定。

ここで提示されたプロトコルは、センサー蛍光する蛍光タンパク質の分画のレシオ メトリック定量化を示しています (図 1)。この画分は、光のモードによって異なります。
共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM) で短時間高出力の photoactivation を使用して典型的な結果を図 2 cに示しま...

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How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

センサー蛍光蛋白質生きているセルおよびバルク量を定量化する方法

遺伝的結合スペクトルの光活性化・蛍光タンパク質を含むプロトコルを紹介します。これらの蛍光タンパク質のキメラは photoactivation 効率すなわち、蛍光、するセンサーは、PA FP 端数の数量を許可します。プロトコルでは、光の異なるモードが異なる光効率をもたらすことを明らかにします。

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

ここでは、遺伝子組み合わせたスペクトル的に異なる光活性化能および蛍光タンパク質を含むプロトコルを提示する。これらの内部定規は蛍光されるように活性化されるPAFPの分率の定量を可能にする。これまで、蛍光に活性化されたPAFPの発現量を生命細胞で一括定量する方法は利用されていない。光活性化効率の提示定量は、生細胞のPA-GFPおよびPA Cherryに例示されるが、それは原理的に広く適用可能であり、任意の実験条件下で任意の光活性化可能な蛍光タンパク質に使用することができる。遺伝的にコードされた蛍光タンパク質を使用する場合、発現するタンパク質の絶対量は細胞によって異なり、未知です。細胞間の発現を標準化するために、我々は、遺伝子組み合わせたスペクトル的に異なる蛍光タンパク質の内部定規を導入する。蛍光タンパク質の常にスペクトル的に区別される蛍光タンパク質のスペクトル的に区別される蛍光タンパク質の遺伝情報に結合することによって、まだ未知の総量に発現されるが、1対1の固定既知の相対量で作成されます。付随するテキストプロトコルに記載されているようにプラスミドの構築を開始する。また、フェノールレッドフリー版を用いてその遠近媒体中の標準細胞株で培養する。実験を開始する準備ができたら、フェノールレッドを使わずにトリプシンを使って細胞を収穫し、背景の蛍光を減らします。収穫後、T12.5細胞培養フラスコで増殖したコンフルエント細胞培養液から細胞懸濁液を2mlのピペットに充填する。8つのチャンバーガラススライドの各チャンバーに1滴を加えます。標準的な細胞培養条件下でスライドを24時間インキュベートします。次に、流通器プロトコルに従って市販の試薬を使用して細胞をトランスフェクトする。GFPチェリー、PA-GFPチェリー、GFPPAチェリーキメラで細胞をトランスフェクトします。次に、タンパク質発現、折りたたみ、成熟を可能にするために、細胞をインキュベーターに戻します。トランスフェクション後合計20時間後、加湿および加熱された環境室を備えた共焦点の花膜顕微鏡のステージに細胞を37に移す

Research

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