Name: how to quantify the fraction of photoactivated fluorescent proteins in bulk and in live cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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우리는이 프로젝트에 대 한 장비와 공간을 제공 하기 위한 Dorigo 실험실 그리고 스탠포드 대학의과 대학에서 신경 과학 이미징 서비스를 감사 하 고 싶습니다.

1. 플라스 미드 건설
<ol><li>2 색 퓨전 프로브를 생성 합니다. 포유류 세포 식 벡터를 사용 하 여 ( 재료의 표참조)는 mCherry112 , PA mCherry113 제한으로 삽입 되어 있는 사이트 AgeI 및 BsrGI.
</li>
	<li>사용자 지정 올리고 뉴클레오티드 eGFP 및 PA eGFP A206K 돌연변이, 즉, mEGFP PA mEGFP14 사리 BamHI 단편으로 정지 codon 없이...

<ol>
	<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li><li>Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+9.">Ch. 9.</a> The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. , 201-228 (2014).</li><li>Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocontrollable+fluorescent+proteins+for+superresolution+imaging.">Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging.</a> Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Henderson, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+photoactivatable+green+fluorescent+protein.">Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+mechanism+of+PAmCherry+based+on+crystal+structures+of+the+protein+in+the+dark+and+fluorescent+states.">Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).</li><li>Wiedenmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EosFP,+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion.">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li><li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mKikGR,+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein.">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3 (12), e3944 (2008).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Slocum, J. D., Webb, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Double+Decarboxylation+in+Superfolder+Green+Fluorescent+Protein+Leads+to+High+Contrast+Photoactivation.">A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation.</a> Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).</li><li>Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+monomeric+photoactivatable+red+fluorescent+protein+for+two-color+super-resolution+sptPALM+of+live+cells.">Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).</li><li>Renz, M., Wunder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+rulers+to+assess+fluorescent+protein+photoactivation+efficiency.">Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency.</a> Cytometry A. , (2017).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).</li></ol>

지금까지, 방법은 없습니다 대량에서 PA-FPs의 라이브 셀에서 표현 photoactivated 형광 하는 분수 결정에 존재. 어떤 괴기 하 게 고유한 형광 단백질 쌍 제시 프로토콜을 사용할 수 있습니다. PA FPs PA-GFP와 PA-체리는 돌이킬 수 없는 대 한 여기 exemplified, 동안이 방식은 원칙적으로 뿐만 아니라 photoconvertible 단백질에 적용 합니다. 그러나 괴기 하 게 고유한 형광 단백질,, 선택 되어야 합니다 신중 하 게 photo...

2002 년, 첫 번째 광범위 하 게 적용 가능한 photoactivatable (PA-GFP1) 및 photoconvertible (가2) 형광 단백질 설명 했다. 자외선과, 즉, 방사선 조사 시 스펙트럼 그들의 속성을 변경 하는이 광 형광펜 형광 단백질 그들은 밝은 될 (photoactivatable 형광 성 단백질, 즉, PA FPs), 또는 (photoconvertible 그들의 색상을 변경 FPs)입니다. 날짜 하려면, 여러 가지 되돌릴 수와 돌이킬 수 없는 photoactivatable 및 photoconvertible 형광 단백질 개발된3,4되었습니다. 앙상블 또는 대량 연구, 광학 형광펜 subcellular 구획의 연결 전체 셀 또는 단백질의 역학을 공부 하 고 사용 되었습니다. 또한, 광학 형광펜 사용 단일 분자 이미징 기술이 팜5 FPALM6해상도 기반으로 합니다.
비록 중 사진화학 처리 photoactivation 또는-변환 설명 되었습니다. 많은 광학 형광펜 및 심지어 결정학 구조 photoactivation 전후 /-변환 사용할 수7 되었습니다. , 8, photoactivation 및-변환의 기본 사진물리적 메커니즘 완전히 이해 하지는. 또한, 지금까지 원유 추정 존재의 photoactivation-변환 효율의 즉, 즉 표현 형광 단백질의 분수 실제로 photoconverted 또는 형광 수 photoactivated. 네이티브의 양과 흡수 스펙트럼의 변화를 측정 하 고 젤9,,1011에 단백질 활성화 앙상블 연구 생체 외에서 보고 되었습니다.
여기, 선물이 photoactivated 형광 단백질 대량에서 및 라이브 셀에 분수를 평가 하기 위해 형광 단백질 키메라를 포함 하는 프로토콜. 때마다 형광 단백질 유전자 인코딩된 작업, 표현 하는 단백질의 절대 크기가 셀에서 변화 하 고 알. PA FP를 표현 하는 하나의 셀 다른 셀 보다 photoactivation 후 밝은 신호를 보여줍니다, 경우이 밝은 신호 파 FP의 높은 식 또는 PA-FP의 더 효율적인 photoactivation 분화 될 수 없습니다. 셀에 식 수준 표준화, 유전자 결합된 spectrally 고유한 형광 단백질의 내부 통치자 소개 합니다. 괴기 하 게 뚜렷한 항상에 형광 단백질, 내부 통치자 photoactivatable 형광 단백질의 유전 정보가 만들어집니다 커플링으로는 여전히 표현 됩니다 알 수 없는 총 금액만의 고정 및 알려진 상대 금액에서 1:1.이이 전략 수 제도의 다른 UV 빛 photoactivation, 즉, 양적 특성 photoactivation, 다른 모드와 photoactivated 수를 그로 인하여 허용 PA FPs의 상대적인 양의 평가 다른 사람 보다 더 효과적인 photoactivation 스키마를 정의 합니다. 또한,이 전략 photoactivated PA FP 분수의 절대 정량화 평가 원리에 있습니다. 이 위해, 그것은 제시 앙상블 연구는 강도-기반 분석으로이 프로토콜에 누워 복잡 한 게 실현 하는 것이 중요. 측정 된 형광 강도, 즉, 다른 분자 밝기, 흡 광도 및 방출 스펙트럼 무서 워 효과 결정 하는 매개 변수 다른 형광 단백질의 형광 강도 비교할 때 고려 될 필요가 있다.
Photoactivation 효율성의 제시 비율 강도 기반 정량화 GFP PA 및 PA-벚꽃 라이브 셀에 대 한 예증 하지만 원칙적으로 광범위 하 게 적용 및 어떤 photoactivatable 형광 단백질에서 사용 될 수 있습니다. 실험 조건입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pEGFP-N1 mammalian cell expression vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM w/o phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin w/o phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

how to quantify the fraction of photoactivated fluorescent proteins in bulk and in live cells

Photoactivatable 및-컨버터블 형광 성 단백질 (PA-FPs) 세포와 단백질 앙상블의 역학을 분석 하기 위한 형광 라이브 셀 현미경에 사용 되었습니다. 지금까지, 방법은 없습니다 대량에서 계량 수 되었으며 라이브에서 PA-FPs의 얼마나 많은 표현 세포 형광을 photoactivated 있습니다.
여기, 우리가 현재 내부 통치자를 포함 하는 프로토콜, 즉, 유전자 결합 spectrally 별개 (photoactivatable) 형광 단백질, ratiometrically 모든 PA-FPs의 것에 전환 하는 셀에 표시의 일부분을 계량 형광. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 photoactivation의 다양 한 모드로 다른 photoactivation 효율성 나왔고 보여줍니다. Confocal 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 짧은 고 전력 photoactivation CLSM으로 적용 하는 낮은 수준의 노출 또는 widefield 조명에 의해 적용 짧은 펄스의 수백 보다 4 배 더 낮은 photoactivation 효율까지 결과. 프로토콜 GFP (펜 실바 니 아-)와 (펜 실바 니 아-) 체리 여기 궁 행 되는, 하는 동안 그것은 원칙에 적용할 수 있습니다 어떤 괴기 하 게 명료한 photoactivatable 또는 photoconvertible 형광 단백질 쌍 및 모든 실험 설정.

여기에 제시 된 프로토콜 표시 photoactivated 형광 수은 형광 단백질의 분수의 비율 정량화 (그림 1). 이 분수는 photoactivation의 모드에 따라 다릅니다.
Confocal 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 짧은 시간 고 전력 photoactivation를 사용 하 여 일반적인 결과 그림 2 c에 표시 됩니다. 픽셀에 의해 대?...

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How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Photoactivated 형광 단백질 대량 및 라이브 셀의 일부분을 계량 하는 방법

여기, 선물이 형광 단백질 유전자 결합된 괴기 하 게 명료한 photoactivatable를 포함 하는 프로토콜. 이러한 형광 단백질 키메라 photoactivation 효율성 즉, 형광, 수의 photoactivated는 PA FP 분수의 정량화를 허용 합니다. 프로토콜은 photoactivation의 다양 한 모드로 다른 photoactivation 효율성 산출을 보여준다.

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

우리는 여기에 유전적으로 결합 된 스펙트럼 고유의 사진 활성 및 형광 단백질을 포함하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 내부 통치자는 형광으로 활성화된 사진이 되는 PAFP 분획의 정량화를 허용합니다. 지금까지, 어떤 방법은 형광에 활성화 된 사진 표현PAFP의 얼마나 많은 생명 세포에서 대량으로 정량화 할 수 없었다. 사진 활성화 효율의 제시된 정량화는 살아있는 세포에서 PA-GFP 및 PA Cherry에 대한 예시이지만 원칙적으로 광범위하게 적용가능하며 실험 적인 조건 하에서 모든 사진 활성형 형광 단백질에 사용할 수 있습니다. 유전적으로 인코딩된 형광 단백질로 작업할 때마다 발현된 단백질의 절대양은 세포마다 다르며 알 수 없습니다. 세포 간 발현을 표준화하기 위해, 우리는 유전적으로 결합된 광등 단백질의 내부 통치자를 소개합니다. 사진 활성성 식물성 단백질의 유전정보를 형광 단백질 내부 눈금자에 항상 구별하는 것으로 결합함으로써 여전히 알려지지 않은 총양으로 표현되지만 1대 1의 고정된 상대적 양으로 발현된다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플라스미드를 구성하기 시작합니다. 또한, 페놀 레드 프리 버전을 이용한 원근 매체에서 표준 세포주에서의 배양. 실험을 시작할 준비가 되면 페놀 레드없이 트립신을 사용하여 세포를 수확하여 배경 꽃을 줄입니다. 수확 후, T 12.5 세포 배양 플라스크에서 자란 컨부유한 세포 배양으로부터 세포 현탁액으로 2ml 파이펫을 채우세요. 8개의 챔버 유리 슬라이드의 각 챔버에 한 방울을 추가합니다. 24시간 동안 표준 세포 배양 조건 하에서 슬라이드를 배양합니다. 다음으로 유통 프로토콜에 따라 상용 시약을 사용하여 세포를 트랜스펙트합니다. GFP 체리, PA-GFP 체리와 GFPPA 체리 키메라와 세포를 트랜스펙트. 그런 다음 단백질 발현, 접이식 및 성숙을 허용하기 위해 세포를 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 총 20시간 후, 가습및 가열된 환경챔버를 장착한 공초점 플로리센트 현미경의 단계로 세포를 37시간으로 미리 데워

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

항온, 발현, 정제, 인간 세로토닌 전달체 결정화 바운드<em&gt; S</em&gt; 시탈 로프 람

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

연구

생화학

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

각 질의 닭 깃털 및 화장품에의 응용에서의 준비

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Polyacrylamide 젤에 단백질의 형광은 얼룩

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

척도 부착 셀에 대상 참여를 이미징 높은 콘텐츠를 사용 하 여

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

형광 효소 분석 결과 플랫폼에 그들의에서 젤 Renaturation 재조합 융합 단백질의 사용

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

스모를 이용한 스모 변성 단백질의 국 소화-단백질 포착

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

정량적 유세포 분석기를 사용하여 형광 표지 단백질과 인공 인지질 마이크로베시클의 상호작용 분석

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...