Name: how to quantify the fraction of photoactivated fluorescent proteins in bulk and in live cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Dorigo laboratorium og nevrovitenskap Imaging tjenesten på Stanford University School of Medicine for å tilby utstyr og plass for dette prosjektet.

1. plasmider konstruksjon
<ol><li>Generer to farger fusion sonder. Bruke en pattedyr celle uttrykk vektor (se Tabell for materiale) i som mCherry112 og PA-mCherry113 er satt inn med begrensning nettsteder AgeI og BsrGI.
</li>
	<li>For egendefinerte oligo-nukleotider å forsterke monomerisk variantene av eGFP og PA-eGFP som inneholder A206K mutasjon, dvs mEGFP og PA-mEGFP14 uten en stopp codon som et S...

<ol>
	<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li><li>Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+9.">Ch. 9.</a> The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. , 201-228 (2014).</li><li>Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocontrollable+fluorescent+proteins+for+superresolution+imaging.">Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging.</a> Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Henderson, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+photoactivatable+green+fluorescent+protein.">Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+mechanism+of+PAmCherry+based+on+crystal+structures+of+the+protein+in+the+dark+and+fluorescent+states.">Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).</li><li>Wiedenmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EosFP,+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion.">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li><li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mKikGR,+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein.">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3 (12), e3944 (2008).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Slocum, J. D., Webb, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Double+Decarboxylation+in+Superfolder+Green+Fluorescent+Protein+Leads+to+High+Contrast+Photoactivation.">A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation.</a> Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).</li><li>Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+monomeric+photoactivatable+red+fluorescent+protein+for+two-color+super-resolution+sptPALM+of+live+cells.">Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).</li><li>Renz, M., Wunder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+rulers+to+assess+fluorescent+protein+photoactivation+efficiency.">Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency.</a> Cytometry A. , (2017).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).</li></ol>

Så langt eksisterte ingen metode for å bestemme bulk brøkdel av PA-FPs uttrykt i levende celler som er photoactivated skal fluorescerende. Presentert protokollen kan brukes for alle spectrally distinkte fluorescerende protein par. Mens eksemplifisert her for den irreversibel PA-FPs PA-GFP og PA-kirsebær, er denne tilnærmingen i prinsippet gjelder for photoconvertible proteiner også. Spectrally distinkte fluorescerende protein, men må velges nøye å minimere spectral overlapping gitt at photoconvertible fluorescer...

I 2002 beskrevet den første bredt aktuelt photoactivatable (PA-GFP1) og photoconvertible (Kaede2) fluorescerende proteiner. Disse optisk merkepenn fluorescerende proteiner endre spektrale egenskapene ved bestråling med UV-lys, dvs. de blir lyse (photoactivatable fluorescerende proteiner, dvs., PA-FPs), eller endre farge (photoconvertible FPs). Hittil har flere reversible og irreversible photoactivatable og photoconvertible fluorescerende proteiner vært utviklet3,4. I ensemble eller bulk studier, har optisk merkepenner blitt brukt til å studere dynamikken i hele celler eller proteiner og tilkobling av subcellular rom. Videre basert optisk merkepenner aktivert single-molekylet superresolution imaging teknikker som PALM5 og FPALM6.
Selv om Fotokjemiske prosesser under photoactivation eller -konvertering har blitt beskrevet i mange optisk merkepenner og selv krystallografisk strukturer før og etter photoactivation / - konvertering er gjort tilgjengelig7 , 8, den underliggende bildetfysisk mekanismen av photoactivation og -konvertering er ikke helt forstått. Videre så langt bare grove anslag finnes for effektiviteten av photoactivation og -konvertering, dvs brøkdel av fluorescerende proteiner uttrykt som er faktisk photoconverted eller photoactivated skal fluorescerende. In vitro ensemble studier har rapportert kvantifisere skifte i absorpsjon spectra og mengden av innfødte og aktivert protein i en gel9,10,11.
Her presenterer vi en protokoll med fluorescerende protein chimeras å vurdere brøkdel av photoactivated fluorescerende proteiner i bulk og lever celler. Når arbeider med genetisk kodet fluorescerende proteiner, den absolutte mengden protein uttrykt varierer fra celle til celle og er ukjent. Hvis en celle uttrykke PA-FP viser et klarere signal etter photoactivation enn en annen celle, kan ikke det differensieres hvis lysere signalet skyldes høyere uttrykk for PA-FP eller en mer effektiv photoactivation av PA-FP. For å standardisere hvilket uttrykk i celler, introdusere vi interne herskere av genetisk kombinert spectrally distinkte fluorescerende proteiner. Ved kobling den genetiske informasjonen som en photoactivatable fluorescerende protein en spectrally distinkte alltid fluorescerende proteiner, interne herskere opprettes som fortsatt måles til en ukjent totalbeløp, men i en fast og kjente relative 1: 1 denne strategien kan kvantitative karakterisering av ulike UV-lys photoactivation ordninger, dvs. vurdering av relative PA-FPs som kan være photoactivated med forskjellige moduser av photoactivation, og dermed tillater definere photoactivation ordninger som er mer effektive enn andre. Videre, denne strategien kan i prinsippet vurdering av den absolutte kvantifiseringen av photoactivated PA-FP brøken. Dette er det viktig å innse at presentert ensemble studiene er intensitetsbasert som gjør analysen mer komplisert som fastsatt i denne protokollen. Bestemme målt fluorescerende intensitet, dvs. forskjellige molekylær lysstyrken, absorbansen og utslipp spectra og bånd effekter, må vurderes når man sammenligner fluorescens intensiteter av ulike fluorescerende proteiner.
Presentert ratiometric intensitetsbasert kvantifisering av photoactivation effektiviteten er eksemplifisert PA-GFP og PA-Cherry i levende celler, men er i prinsippet bredt aktuelt og kan brukes for alle photoactivatable fluorescerende protein under noen eksperimentell tilstand.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pEGFP-N1 mammalian cell expression vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM w/o phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin w/o phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

how to quantify the fraction of photoactivated fluorescent proteins in bulk and in live cells

Photoactivatable og -cabriolet fluorescerende proteiner (PA-FPs) har blitt brukt i fluorescens live-celle mikroskopi for å analysere dynamikken i celler og protein ensembler. Så langt ingen metode er tilgjengelig å kvantifisere samtidig og i levende celler hvor mange av PA-FPs uttrykt er photoactivated til fluoresce.
Her presenterer vi en protokoll med interne herskere, dvs koblet genetisk spectrally distinkte (photoactivatable) fluorescerende proteiner, til ratiometrically kvantifisere brøkdel av alle PA-FPs uttrykt i en celle som er slått på skal fluorescerende. Bruker denne protokollen, viser vi at forskjellige moduser av photoactivation gitt forskjellige photoactivation effektivitet. Kort høyeffekts photoactivation med en AC confocal laserskanning mikroskopet (CLSM) førte til fire ganger lavere photoactivation effektivitet enn hundrevis av lavnivå eksponeringer av CLSM eller en kort puls av widefield belysning. Mens protokollen har vært eksemplifisert her (PA-) GFP og (PA-) Cherry, kan den i prinsippet brukes noen spectrally distinkte photoactivatable eller photoconvertible fluorescerende protein par og noen eksperimentelle set-up.

Protokollen presenteres her viser ratiometric kvantifisering av brøkdelen av fluorescerende proteiner som er photoactivated skal fluorescerende (figur 1). Denne fraksjonen være forskjellig avhengig av modus for photoactivation.
Et vanlig resultat kort tid høyeffekts photoactivation med en AC confocal laserskanning mikroskopet (CLSM) vises i figur 2 c. Etter titrating...

Watch this Scientific Journal Video about How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells at JoVE.com

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hvordan kvantifisere brøkdel av Photoactivated fluorescerende proteiner i Bulk og lever celler

Her presenterer vi en protokoll som innebærer genetisk kombinert spectrally forskjellige photoactivatable og fluorescerende proteiner. Disse fluorescerende protein chimeras tillater kvantifisering av PA-FP brøken som photoactivated skal fluorescerende, dvs photoactivation effektivitet. Protokollen avslører at forskjellige moduser av photoactivation gir forskjellige photoactivation effektivitet.

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Vi presenterer her en protokoll som involverer genetisk sammenlignet spektralt distinkte fotoaktiverbare og fluorescerende proteiner. Disse interne herskerne tillater kvantifisering av PAFP-brøken som er bildeaktivert for å være fluorescerende. Så langt har ingen metode vært tilgjengelig for å kvantifisere i bulk i livsceller hvor mange av PAFP uttrykt er foto aktivert for å fluorisere. Den presenterte kvantifiseringen av fotoaktiveringseffektivitet er eksemplifisert for PA-GFP og PA Cherry i levende celler, men det er i prinsippet bredt anvendelig og kan brukes til ethvert fotoaktiverbart fluorescerende protein under enhver eksperimentell tilstand. Når du arbeider med genetisk kodede fluorescerende proteiner, varierer den absolutte mengden proteiner uttrykt fra celle til celle, og det er ukjent. For å standardisere uttrykket blant celler, introduserer vi interne herskere av genetisk sammenlignet spektralt distinkte fluorescerende proteiner. Ved å koble den genetiske informasjonen til et fotoaktiverbart florescent protein til en spektralt distinkt alltid på fluorescerende protein interne herskere er opprettet som fortsatt vil bli uttrykt til en ukjent total mengde, men i en fast kjent relativ mengde av en til en. For å begynne å konstruere plasmidene som beskrevet i den medfølgende tekstprotokollen. Også kultur i standard cellelinje i sitt perspektiv medium ved hjelp av fenol rød fri versjon. Når du er klar til å begynne eksperimentet, høste cellene ved hjelp av trypsin uten fenolrød for å redusere bakgrunns florescence. Etter høst, fyll en 2 ml pipette med cellesuspensjon fra en samløpet cellekultur dyrket i en T 12,5 cellekulturkolbe. Legg til en dråpe i hvert kammer av en åtte kammerglasssklie. Inkuber lysbildet under standard cellekulturforhold i 24 timer. Deretter transfect cellene ved hjelp av kommersielle reagenser etter distributører protokollen. Transfect cellene med GFP Cherry, PA-GFP Cherry og GFPPA Cherry chimeras. Deretter returnerer cellene til inkubatoren for å tillate proteinuttrykk, folding og modning. Etter totalt 20 timer etter transfection, overføre cellene til scenen av en konokkal florescent mikroskop utstyrt med fuktet og oppvarmet miljøkammer pre-oppvarmet til 37

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Rensing, og Krystallisering av Human Serotonin Transporter Bound til<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Utarbeidelse av Keratin hydrolyse fra kylling fjær og dens anvendelse i kosmetikk

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Endre Baculovirus uttrykk vektorer å produsere utskilles anlegget proteiner i insekt celler

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende sølv farging av proteiner i polyakrylamid Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Bruke høyt innhold å kvantifisere målet engasjement i tilhenger celler

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Bruk av rekombinant Fusion proteiner i en fluorescerende Protease analysen plattform og deres i-gel-Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering av SUMO-modifisert proteiner bruke fluorescerende Sumo-fangst proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Analysere samspillet mellom fluorescerende merkede proteiner med kunstige fosfolipidmikrovesikler ved hjelp av kvantitativ strømningscytometri

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...