Name: how to quantify the fraction of photoactivated fluorescent proteins in bulk and in live cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Gostaríamos de agradecer o laboratório Dorigo e o serviço de Imaging neurociência na faculdade de medicina da Universidade de Stanford para fornecimento de equipamento e espaço para este projeto.

1. plasmídeo construção
<ol><li>Gere a fusão de duas cores sondas. Usar um vetor de expressão de células de mamíferos (ver Tabela de materiais) em que mCherry112 e PA-mCherry113 foram inseridos com a restrição de sites AgeI e BsrGI.
</li>
	<li>Ordem personalizada oligo-nucleotídeos para amplificar as variantes monoméricas de eGFP e PA-eGFP contendo a mutação A206K, i.e., mEGFP e PA-mEGFP14 se...

<ol>
	<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li><li>Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+9.">Ch. 9.</a> The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. , 201-228 (2014).</li><li>Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocontrollable+fluorescent+proteins+for+superresolution+imaging.">Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging.</a> Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Henderson, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+photoactivatable+green+fluorescent+protein.">Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+mechanism+of+PAmCherry+based+on+crystal+structures+of+the+protein+in+the+dark+and+fluorescent+states.">Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).</li><li>Wiedenmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EosFP,+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion.">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li><li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mKikGR,+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein.">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3 (12), e3944 (2008).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Slocum, J. D., Webb, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Double+Decarboxylation+in+Superfolder+Green+Fluorescent+Protein+Leads+to+High+Contrast+Photoactivation.">A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation.</a> Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).</li><li>Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+monomeric+photoactivatable+red+fluorescent+protein+for+two-color+super-resolution+sptPALM+of+live+cells.">Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).</li><li>Renz, M., Wunder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+rulers+to+assess+fluorescent+protein+photoactivation+efficiency.">Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency.</a> Cytometry A. , (2017).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).</li></ol>

Até agora, nenhum método existia para determinar a granel a fração de PA-FPs expressado em células vivas que é fotoativo ser fluorescente. O protocolo apresentado pode ser usado para qualquer par de proteína fluorescente espectralmente distintas. Enquanto aqui exemplificada para o irreversível FPs PA PA-GFP e PA-cereja, esta abordagem é, em princípio aplicável às proteínas photoconvertible também. A proteína fluorescente espectralmente distinta, no entanto, deve ser selecionada cuidadosamente para minimiza...

Em 2002, o primeiro photoactivatable amplamente aplicável (PA-GFP1) e photoconvertible (Kaede2) proteínas fluorescentes foram descritas. Estas proteínas fluorescentes marcador óptico alterar suas propriedades espectrais após irradiação com luz UV, ou seja, eles tornam-se brilhantes (proteínas fluorescentes photoactivatable, i.e., PA-FPs), ou alterar sua cor (photoconvertible FPs). Até à data, vários reversíveis e irreversíveis photoactivatable e photoconvertible proteínas fluorescentes foram desenvolvidos3,4. Em estudos de conjunto ou a granel, marcadores ópticos têm sido utilizados para estudar a dinâmica de células inteiras ou proteínas e a conectividade dos compartimentos subcellular. Além disso, único-molécula de marcadores ópticos habilitados com base superresolution de imagens técnicas como o PALM5 e FPALM6.
Embora a fotografiaquímica processa durante photoactivation ou - conversão foram descritos para muitos marcadores ópticos e estruturas cristalográficas mesmo antes e após a fotoativação / - conversão foram feitas disponíveis7 , 8, o mecanismofísico subjacente de foto de fotoativação e - conversão não é completamente compreendido. Além disso, até agora só brutas estimativas existem da eficiência de fotoativação e - conversão, ou seja, a fração de proteínas fluorescentes expressado ou seja realmente photoconverted ou fotoativados ser fluorescente. Foram relatados em vitro estudos ensemble quantificar a mudança em espectros de absorção e a quantidade de nativo e ativou a proteína em um gel de9,10,11.
Aqui, apresentamos um protocolo envolvendo quimeras de proteína fluorescente para avaliar a fração de proteínas fluorescentes fotoativo a granel e em células vivas. Sempre que trabalhar com proteínas fluorescentes geneticamente codificadas, a quantidade absoluta de proteínas expressada varia de célula para célula e é desconhecida. Se uma célula expressando um PA-FP mostra um sinal brilhante após a fotoativação do que outra célula, não podem ser diferenciado se este sinal mais brilhante é devido a maior expressão de PA-FP ou uma fotoativação mais eficiente do PA-FP. Para padronizar o nível de expressão nas células, nós introduzimos governantes internos de proteínas fluorescentes espectralmente distintas geneticamente acopladas. Por acoplamento a informação genética de uma proteína fluorescente photoactivatable para um espectralmente distintas sempre-em proteínas fluorescentes, governantes internos são criados que será ainda expressa para um total desconhecido, mas em uma fixa e conhecida a quantidade relativa de 1:1. essa estratégia permite a caracterização quantitativa da luz UV photoactivation esquemas, ou seja, a avaliação da quantidade relativa de PA-FPs, que pode ser fotoativados com diferentes modos de fotoativação e desse modo permite para definir o photoactivation regimes que são mais eficazes do que outros. Além disso, esta estratégia permite em princípio, a avaliação da quantificação absoluta da fração fotoativados PA-FP. Para este fim, é importante perceber que os estudos apresentados ensemble são baseados em intensidade o que torna a análise mais complexos, como previsto no presente protocolo. Parâmetros para determinar a intensidade fluorescente medida, ou seja, brilho molecular diferente, absorvância e espectros de emissão e FRET efeitos, precisam ser considerados ao comparar as intensidades de fluorescência das diferentes proteínas fluorescentes.
Ratiometric apresentado com base em intensidade quantificação dos photoactivation eficiência é exemplificada por PA-GFP e PA-cereja em células vivas, mas em princípio amplamente aplicável e pode ser usada para qualquer proteína fluorescente photoactivatable sob qualquer condição experimental.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pEGFP-N1 mammalian cell expression vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM w/o phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin w/o phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

how to quantify the fraction of photoactivated fluorescent proteins in bulk and in live cells

Photoactivatable e - proteínas fluorescentes conversíveis (PA-FPs) têm sido utilizadas em microscopia de fluorescência viver-pilha para analisar a dinâmica das células e conjuntos de proteína. Até agora, nenhum método esteve disponível para quantificar a granel e em vivo células expressaram como muitos dos PA-FPs são fotoativo de fluorescência.
Aqui, apresentamos um protocolo envolvendo governantes internos, ou seja, geneticamente acoplado a proteínas fluorescentes espectralmente distintos (photoactivatable), a ratiometrically quantificar a fração de todos os PA-FPs expresso em uma célula que está ligado ao ser fluorescentes. Usando este protocolo, mostramos que os diferentes modos de fotoativação renderam photoactivation diferentes eficiências. Curto photoactivation de alta potência com um laser confocal microscópio (CLSM) resultou em até quatro vezes menor photoactivation eficiência do que centenas de exposições de baixo nível aplicadas por CLSM ou um pulso curto aplicado por widefield iluminação. Enquanto o protocolo tem sido exemplificado aqui para GFP (PA-) e Cherry (PA-), pode em princípio ser aplicado a qualquer par de proteína fluorescente de photoactivatable ou photoconvertible espectralmente distintas e qualquer montagem experimental.

O protocolo aqui apresentado mostra a ratiometric a quantificação da fração de proteínas fluorescentes que são fotoativados ser fluorescente (Figura 1). Esta fração difere dependendo do modo de fotoativação.
Um resultado típico usando pouco tempo photoactivation de alta potência com um laser confocal microscópio (CLSM) é mostrado na Figura 2C. Depois titul...

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How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Como quantificar a fração de proteínas fluorescentes fotoativo a granel e em células vivas

Aqui, apresentamos um protocolo que envolve photoactivatable espectralmente distinto geneticamente acoplado e proteínas fluorescentes. Estas quimeras de proteína fluorescente permitam a quantificação da fração de PA-FP que é fotoativo ser fluorescente, ou seja, a eficiência de fotoativação. O protocolo revela que diferentes modos de fotoativação produzem photoactivation diferentes eficiências.

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Apresentamos aqui um protocolo que envolve geneticamente acoplado espectroticamente distintos proteínas foto-ativadas e fluorescentes. Estas réguas internas permitem quantificação da fração PAFP que é foto ativada para ser fluorescente. Até agora, nenhum método foi disponibilizado para quantificar em massa em células de vida quantos dos PAFP expressos são ativados por foto para fluoresce. A quantificação apresentada da eficiência de foto-ativação é exemplificada para PA-GFP e PA Cherry em células vivas, mas é, em princípio, amplamente aplicável e pode ser usada para qualquer proteína fluorescente foto-ativada sob qualquer condição experimental. Sempre que se trabalha com proteínas fluorescentes geneticamente codificadas, a quantidade absoluta de proteínas expressas varia de célula para célula e é desconhecida. Para padronizar a expressão entre as células, introduzimos governantes internos de proteínas fluorescentes geneticamente acoplizadas espectralmente distintas. Ao acoplar as informações genéticas de uma proteína florescente foto-ativada a uma proteína espectralmente distinta sempre em réguas internas de proteína fluorescente são criadas que ainda serão expressas a uma quantidade total desconhecida, mas em uma quantidade relativa conhecida fixa de um para um. Para começar a construir os plasmídeos como descrito no protocolo de texto que acompanha. Além disso, cultura na linha celular padrão em seu meio de perspectiva usando a versão livre de fenol vermelho. Quando estiver pronto para começar o experimento, colde as células usando trippsina sem fenol vermelho para reduzir a florescência de fundo. Após a colheita, encha uma pipeta de 2 ml com a suspensão celular de uma cultura celular confluente cultivada em um frasco de cultura celular T 12.5. Adicione uma gota em cada câmara de um escorregador de vidro de oito câmaras. Incubar o slide sob condições padrão de cultura celular por 24 horas. Em seguida, transfem as células usando reagentes comerciais seguindo o protocolo dos distribuidores. Transfectar as células com as quimeras GFP Cherry, PA-GFP Cherry e GFPPA Cherry. Em seguida, devolva as células à incubadora para permitir a expressão proteica, dobramento e maturação. Após um total de 20 horas após a transfecção, transfira as células para o estágio de um microscópio florescente confocal equipado com a câmara ambiental umidificada e aquecida pré-aquecida para 37

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