Name: methanol independent expression by pichia pastoris employing de-repression technologies
Uploaded: 2019-01-23T14:45:00
Duration: 5 min 30 s
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ROBOX は、アクション H2020 LEIT 生物-2014-1 ROBOX (グラント契約 n ° 635734) EU のホライゾン 2020年プログラム研究と技術革新の下で欧州連合 (EU) プロジェクトから資金を受けています。見解や意見を表明、著者し、必ずしも欧州連合研究機関のものを反映しています。欧州連合はここに含まれる情報の行われる可能性があります使用するため責任を負うべきではありません。
J. フィッシャーの博士論文は、協調融資助成金」Industrienahe 論文「オーストリア ファンディングエージェンシー フリのため。
Gernot ジョン (ギフト商品 GmbH) は、有用な議論と原稿草案について貴重なご意見を感謝いたします。

1. メディアの準備
<ol><li>バッファーの最小媒体 (グリセロールと BMG、炭素源としてブドウ糖と BMD) 準備 (1 L)<ol>
<li>オートクレーブ 650 mL の蒸留水 1 L スクリュー キャップ ガラス瓶で。冷却後オートクレーブ 10 10 %w/v グルコースやグリセロール (目的の生成されたバイオマス量に応じて 30 100 mL、200 mL (1 M, pH 6) カリウム リン酸バッファーの YNB (134 グラム/L のイースト窒素塩基アミノ酸 w/o) 倍の 100 mL を追加して媒体を完成させます。ビオチン (10 mg/mL) ソリューションと滅菌で 1 L までフィル x 滅菌 500 の mL の 2 バッチ)、中に蒸留水。 注: すべての成分は、別のフラスコでオートクレーブする必要があります。ビオチンは、オートクレーブときは、破棄され、したがって、0.2 μ m メンブレン フィルターで滅菌フィルターでなければなりません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>バッファーに格納されたリッチ ・ メディア (BYPG) (1 L)<ol>
<li>オートクレーブ 700 mL の蒸留水 1 L スクリュー キャップ ボトルで 1 w/v 酵母エキスと 2 %w/v ペプトンと。冷却後別にオートクレーブ 10 w/v グリセロール、カリウム リン酸バッファー (1 M, pH 6) の 200 mL の 30-100 mL を追加し、滅菌蒸留水 1 L を記入します。、</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. シェイク フラスコ準備
<ol><li>5 mL の蒸留水を加えて 250 mL 困惑してフラスコを振る、綿の布の 2 つの層でカバー、ゴムのバンドの場所でそれを修正します。アルミ箔の切れ端の布をカバーします。</li>
	<li>オートクレーブによる殺菌のため 20 分の 121 ° C でフラスコ。</li>
	<li>フラスコから事前に準備されたメディアの分注 50 mL 各フラスコに残留水を削除します。</li>
</ol>3. 一晩培養接種
<ol><li>ふたは適切な通気できるように少し開いてそのまま YPD (1 w/v 酵母エキス、ペプトン 2 w/v、2 w/v グルコース) 50 mL の遠心管に 5 mL の目的の式ひずみの単一新鮮なコロニーで一晩かけて培養 (ONC) を開始します。</li>
	<li>28 ° c、湿度 80%、100-130 rpm (振動直径 2.5 cm) でシェーカーで一晩育てましょう。</li>
</ol>4. 測定セットアップおよび主な文化育成
<ol><li>オンライン監視システムを設定するのには、デバイスの適切な校正のための製造元の指示をに従ってください。</li>
	<li>測定局に Bluetooth 接続の範囲を監視するための適切なソフトウェアがインストールされている、コンピューターを配置します。Bluetooth 経由でデバイスを接続するためのソフトウェアを起動します。<ol>
<li>前面に銀色のボタンを押すことでバイオマス計測デバイスの Bluetooth 接続をオンに。</li>
		<li>ソフトウェアで、デバイス、デバイスを検索をクリックします。 注: デバイスがウィンドウ タスク行の下にリストとして表示されます。そうでない場合、バッテリが充電し、コンピューターが Bluetooth 接続の届くかどうかをチェックすることをお勧めします。</li>
		<li>ドラッグし、画面測定トレイの右側にある正方形に発見されたデバイスをドロップします。</li>
		<li>接続をクリックします。 注: 接続が成功すると、管理画面が表示されます。</li>
		<li>Bluetooth 接続の実行テストを開始するには、測定をクリックします。</li>
		<li>実験を設定します。<ol>
<li>測定を開始、実験の名前をクリックし、監視するために必要なすべてのパラメーターを有効にします。 注: 可能な測定パラメーターのそれぞれのライセンスが必要です。</li>
			<li>間隔を 3 分に設定します。 注: 間隔を決定どのくらいの頻度測定ポイント取られ、すべての測定点の結果値にその後。1 分ごとの測定は非常に正確が評価するより面倒になる大量のデータが生成されます。</li>
			<li>平均測定ポイントを 11 に設定します。 注: この設定は、どのように多くの測定ポイントで 3 分ごと撮影実際に決定します。したがって、出力は 11 の測定ポイント以上 11 の平均値 s。</li>
			<li>サンプルの名前を入力します。</li>
			<li>角度が (手順 4.1) 前に既に校正された、次の画面をスキップします。 注: 安定した接続と接続するコンピューターの適切な場所を確保するためには、テストの主な文化を接種する前に Bluetooth 接続の実行の使用をお勧めします。また、電池は、課金する必要があります。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>波長 600 nm で分光光度計で培 (1:20) で希釈した ONC (ステップ 3.1) の細胞密度を測定します。媒体の 50 mL を接種する (炭素ソース濃度 0.3 1 をお勧めします %、異なるメディアできるだけ手順 1 で説明。) 次の計算を使って、0.05 の OD600 ONC と。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58589/58589eq1.jpg">
</li>
	<li>検出器に、フラスコを置き、28 ° C、130 rpm、80% の湿度で振る。 注: それはフラスコの底に付着し、間違った値を降伏にセルを避けるために測定を開始する前に、文化の揺れの 5 分を与えることが非常に重要です。</li>
	<li>ソフトウェアの測定を開始をクリックします。</li>
	<li>0.2 mL のサンプルは、細胞密度の測定 4 h 炭素源を取得し、接種後枯渇 (決定手順 4.7) トリプリケートで。栽培メディア (最初の測定 1:5、第 2 測定 1:20) に適切なサンプルを希釈し、分光光度計で波長 600 nm の吸収を測定します。フラスコを削除する前に、シェーカーを停止する前にも、常にソフトウェアで計測を一時停止します。 注: 検出器定義された振動条件下でパラメーターを記録するためにキャリブレーションが、ナンセンスの測定を行えば、まだ文化を記録するとき。また、常に再度測定を開始する前に揺れの 5 分を待機することを確認します。細胞密度の測定は、検出器はバイオマスと本物ではない細胞密度のちょうどの値を提供するために不可欠です。外径600値間キャリブレーション機能 (x 値) オンライン測定システム (y の値) によって得られた値はオンカラム縦長のいくつかを測定することによって実現できます。値は、次の校正機能によると対数の関係は線形ではないです。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58589/58589eq2.jpg"> y: 分光光度計によって得られた外径600値 x: オンライン計測システムによって得られた値 k: 斜面 d: 軸切片 傾きと軸の切片は、対応する外径600値に任意の値を変換する使用できます。Excel で 1 つは同じ timepoint からオンライン システムからの値に対して得られた吸収スペクトルの測定外径600値をプロットできます。対数近似曲線と対応する方程式の追加は上記校正機能を与えます。</li>
	<li>炭素源がほぼ枯渇した (約 12-20 h) までを栽培してください。そのため、酸素濃度がゼロに近づいているとセルが指数関数的成長段階にソフトウェア図で見ることができるまで、成長する文化をしましょう。 注: これはこのプロトコルで使われる炭素ソース濃度のためのケースです。それにあるとおり exemplarily 代表結果セクションで図 1酸素レベルがゼロに近づくし、急激な成長にあるセルは、オンライン監視システムと炭素源の枯渇の timepoint を定めることが相。</li>
</ol>5. 解消抑圧による発現
<ol><li>ステップ 4.6 で説明している timepoint に達したら、無菌条件下でフラスコあたり 4 つのフィード ディスクの追加によって文化を供給を開始します。 注: 記載されている条件の下で 4 つのグリセロール フィード ディスク解放、メーカーによると 2 mg/h グリセリン。</li>
	<li>サンプル選択法によるタンパク質の発現を監視するすべての 24 h をしながら 60-90 h の栽培を続ける (e.g。、ブラッドフォードの試金15, SDS ページの16または活動のアッセイ) と細胞密度測定。</li>
</ol>6. 文化収穫
<ol><li>栽培の 60-90 h 後、50 mL 遠沈管 4,000 x g, 10 min. の 4 ° C での遠心分離によって収穫するために文化を記入します。 注: (分泌蛋白質) の培養上清または (細胞内タンパク質発現) のセルは 4,000 x g, 10 min. の 4 ° C での遠心分離によって収穫できる、さらに解析を行うことができます。</li>
	<li>さらに分析のソフトウェアからスプレッドシート ファイルとしてオンライン測定データをエクスポートします。</li>
	<li>5-10 mL の蒸留水にすべてのフラスコと残りの細胞を不活化するオートクレーブをご記入ください。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bill, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Playing+catch-up+with+escherichia+coli:+Using+yeast+to+increase+success+rates+in+recombinant+protein+production+experiments.">Playing catch-up with escherichia coli: Using yeast to increase success rates in recombinant protein production experiments.</a> Frontiers in Microbiology. 5 (MAR), 1-5 (2005).</li><li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Protein+Expression+in+Pichia+pastoris).">Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris).</a> Molecular Biotechnology. 16, 23-52 (2000).</li><li>Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+source+dependent+promoters+in+yeasts.">Carbon source dependent promoters in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).</li><li>Vogl, T., Kickenweiz, T., Sturmberger, L., Glieder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+Promoter.">Bidirectional Promoter.</a> US patent. , (2005).</li><li>Vogl, T., Glieder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Pichia+pastoris+promoters+and+its+consequences+for+protein+production.">Regulation of Pichia pastoris promoters and its consequences for protein production.</a> New Biotechnology. 30 (4), 385-404 (2013).</li><li>Ru&#223;mayer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-level+organization+of+yeast+methylotrophic+lifestyle.">Systems-level organization of yeast methylotrophic lifestyle.</a> BMC Biology. 13 (1), 80 (2015).</li><li>Sakai, Y., Yurimoto, H., Matsuo, H., Kato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+peroxisomal+proteins+and+organelle+proliferation+by+multiple+carbon+sources+in+the+methylotrophic+yeast,+Candida+boidinii.">Regulation of peroxisomal proteins and organelle proliferation by multiple carbon sources in the methylotrophic yeast, Candida boidinii.</a> Yeast. 14 (13), 1175-1187 (1998).</li><li>Hartner, F. S., Glieder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+methanol+utilisation+pathway+genes+in+yeasts.">Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 5, 39 (2006).</li><li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Toolbox+of+Diverse+Promoters+Related+to+Methanol+Utilization:+Functionally+Verified+Parts+for+Heterologous+Pathway+Expression+in+Pichia+pastoris.">A Toolbox of Diverse Promoters Related to Methanol Utilization: Functionally Verified Parts for Heterologous Pathway Expression in Pichia pastoris.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (2), 172-186 (2016).</li><li>Mellitzer, A., Weis, R., Glieder, A., Flicker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+lignocellulolytic+enzymes+in+Pichia+pastoris.">Expression of lignocellulolytic enzymes in Pichia pastoris.</a> Microbial Cell Factories. 11 (1), 61 (2012).</li><li>Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+protein+production+using+the+Pichia+pastoris+expression+system.">Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system.</a> Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).</li><li>Weis, R., Luiten, R., Skranc, W., Schwab, H., Wubbolts, M., Glieder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+high-throughput+screening+with+Pichia+pastoris+by+limiting+yeast+cell+death+phenomena.">Reliable high-throughput screening with Pichia pastoris by limiting yeast cell death phenomena.</a> FEMS Yeast Research. 5 (2), 179-189 (2004).</li><li>Ukkonen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Improvement of Recombinant Protein Production in Shaken Cultures. , (2014).</li><li>Jeude, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fed-batch+mode+in+shake+flasks+by+slow-release+technique.">Fed-batch mode in shake flasks by slow-release technique.</a> Biotechnology and Bioengineering. 95, 433-445 (2006).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Smith, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+of+Proteins.">SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins.</a> Methods in molecular biology. 1, 41-55 (1984).</li><li>Hartner, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+Library+Designed+for+Fine-Tuned+Gene+Expression+in+Pichia+Pastoris.">Promoter Library Designed for Fine-Tuned Gene Expression in Pichia Pastoris.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), e76 (2008).</li><li>Panula-Per&#228;l&#228;, J., Vasala, A., Karhunen, J., Ojamo, H., Neubauer, P., Mursula, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+slow+glucose+feed+cultivation+of+Pichia+pastoris+without+repression+of+AOX1+promoter:+towards+high+throughput+cultivations.">Small-scale slow glucose feed cultivation of Pichia pastoris without repression of AOX1 promoter: towards high throughput cultivations.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 37 (7), 1261-1269 (2014).</li></ol>

提案するプロトコルは栽培と derepressed の条件の下で誘導に一般的に適用されるが、本研究で使用される新しい derepressed プロモーターの実用化に興味を持ち bisy e.U. を宣言します。

このメソッドは、 PAOX112によって駆動される古典的なメタノール誘導蛋白質の表現の代わりにp. 分析による効率メタノール独立した誘導式の信頼性の高いプロトコルを提示します。PDC、PDF前述変異PAOX1亜種17などの脱抑制型プロモーターは、この新しいタンパク質生産コンセプトの分子基盤を構築します。典型的な結果を示す有用性と非抑圧されたプロモーターと簡単なオンライン監視と小規模なスクリーニングによるp. 分析の組換え蛋白質の表現の実用性に下線を引きます。一方で、栽培からAOX1プロモーターの誘導に使用される通常有害で有毒なメタノールを除去ことができます。その一方で、成長とタンパク質生産相が共役9構成蛋白質の表現、例えばと対照をなして。、一般的に使用されるPのギャップ。これは、細胞はそれらの負担を表示する有毒な又は有害なタンパク質を表現しなければならない場合に特に有益です。
種々 の炭素源濃度で栽培を開始する可能性ができます蛋白質生産フェーズの前に得るためにしたいどのくらいのバイオマスを開始の決定。バッチで低炭素ソース濃度の選択が、一方、高い細胞密度も高いタンパク質抗体なるも高い細胞密度に起因する酸素転送制限を削減できます。図 1に示すようバイオマス発電と酸素濃度の面での文化の開発を監視することによって供給バッチ開始の最適な時間ポイント簡単に決定できます。
これらの栽培パラメーターのオンライン監視、適切な測定システムを適用してください。測定装置 (例えば、SFR バリオ) バイオマスは単純な文化の監視するため経済オンライン測定システムはフラスコを振る。光リーダーは散乱光検出によりフラスコの細胞の成長を決定し、フラスコ内で統合された酸素センサーの信号を読み出します。バイオマス計測のための光学系は、培養液中の粒子 (細胞) による散乱、フォト ダイオードで検出された光信号を発する LED で構成されます。光センサーは、特定の波長の光で励起されると蛍光を出力します。試料分子の量、に応じてこの蛍光信号の変化、あるリーダー光学系によって検出され、濃度値に変換します。しかし、細胞密度測定校正は測定システムは実際の外径600の値を測定していないので、あらかじめ確立しています。リーダー ソフトウェアと酸素曲線の傾きから酸素吸収速度を計算でき、温度と回転数は継続的にその他のパラメーターと共に記録されます。このシステムの監視を有効にするには、目的のパラメーターの適切なセンサーが装備される以前にシェイク フラスコがあります。
4 のリリースが遅い高分子添加による培養液にグリセリンの一定量を提供するディスク バイオマス蓄積はほぼ停止し、組換えタンパク質の生産を続けた。フィード ディスク追加時点の決定は、この実験の重要なステップではありませんが、時に式が開始されると、急激な成長フェーズの前に時期尚早のフィードのスタートでしたプロモーター活性化に抑制することを考慮すべき炭素源の枯渇。さらに、授乳時間高分子容量制限のため合計を減少するかもしれません、飢えにつながるかもしれない細胞が静止した段階に到達した後、フィードを遅らせることとすでに生産してタンパク質の分解に対し。このプロトコルで使用されるフィードのディスクの量はバイオマス発電低 (データは示されていない) を押しながら逆に抑圧されたプロモーターを保つために最適な炭素ソース リリースの実験的に決定されました。この方法で栽培することができます設定しなくても簡単に以上 160 180 h を実行します。
この新しいプロトコルの主な用途は、発現クローンのスクリーニング、酵素の進化と発見、評価、十分に監視条件でのメタノール フリー栽培プロトコルを用いた新しいプロモーター エンジニア リングになります。原則として、同じプロトコルはメタノールとパヌラ Peräläらによって記述されたように限られた発酵炭素源の供給を用いた混合飼料戦略の適用されるべき。201418。

収量と細菌や酵母などの微生物による組換えタンパク質生産の大規模で信頼性の高い栽培条件の改善はの主要な今日のバイオ1と産業の商業的成功のニーズアプリケーション。による簡単な栽培手順とメディア、高収率とよく特徴付けられてツール2 ・組成分析 (Komagataella phaffii)は組換えタンパク質の生産に広く使用されている非従来のイースト菌。その他の革新的なツールは常に、広く使われているPAOX1アルコール 1 酸化酵素遺伝子3,のプロモーター領域の代替として新しいプロモーターを含む新しい表現のベクトルのようなこの種の開発4,5。500 bp 長い DNA シーケンス上流CAT1 (CTA1) 遺伝子は、 p. 分析の新しい無料のメタノール、汎用性の高い表現戦略を可能にするプロモーター領域として識別されました。CAT1遺伝子は、 p. 分析の唯一のカタラーゼ遺伝子とタンパク質は、ペルオキシソームに位置します。カタラーゼが生じる、例えば活性酸素の解毒に重要な役割を果たしている。、メタノール酸化ペルオキシソームの MUT 経路や脂肪酸6、7のベータ酸化から。CAT1遺伝子の発現はグルコースやグリセロール栽培中の prescence で抑圧された、これらの炭素源8の枯渇時に derepressed。さらに、メタノールとオレイン酸、一見されてもととして同じような式のレベルに達してオレイン酸を誘起することp. 分析MUT 経路の遺伝子だけでも remarkebly とカタラーゼ遺伝子の発現を誘起することメタノール誘導9。
PDC (時々 また省略 PCAT1 500) と呼ばれる、このp. 分析 CAT1プロモーターの 500 bp のフラグメント、細胞内発現および分泌蛋白質の生産のために既にテストされ、それがあることを証明します。古典的な 2 に代わる魅力的なp. 分析プロモーター-強力な構成 Pギャップとメタノール誘導性 PAOX1、20 年以上も前に開発されました。PDC 21% (CalB)、砂糖豊富な媒体で Pのギャップと比較して体積活動の 35% (HRP) に到達することができた。メタノール誘導 PDCのみ PAOX1より速く応答しませんでしたが、CalB9の最終価の高い 2.8 倍でも明らかにそれを上回る可能性があります。
PDC以外にも同様の規制プロファイルを示すオーソログ プロモーター (PDF) が特定されました。ただし、PDC未満 derepressed し同様に条件 (に備えて原稿)3メタノール誘導下より大幅に強いです。
強い構成 Pギャップが生理学的問題や細胞傷害性タンパク質10,11のため失敗した場合、PDCと PDFは、理想的な選択肢を表します。初期炭素源の枯渇後にこれらのプロモーターによって駆動式マイクロ スケール実験の開始 (e.g、グルコースやグリセロール)、バイオマス生産の過剰発現細胞に負担をかけることなく容易にする。右の初めから組換え蛋白質。P を用いた式と比較して preinduction 相の追加の使用これらのプロモーターの両方はまだメタノール誘導性、抑制が解除による活性化は、AOX1.また、PDCと PDFは、大規模な工業プロセス12のための望ましい目標であるメタノール由来無細胞タンパク質生産に使用できます。
該当する生産菌株と式の構成の開発の開発にいくつかの手順が多数の形質転換体からスケール アップの最寄りの候補を絞り込むために渡されるあります。通常上映はウェル プレートで高スループットで実行 (マイクロ スケール: 0.5 mL 未満) 可能な限り大量のクローンの範囲をキャプチャするために。その後再スクリーニングと re-re-screening はシェイク フラスコに続いて、次のステップ (小規模: 50 250 mL) または (マイクロ) バイオリアクター上映12。しかし、それはよく管理された無料のメタノール生産の後でスケール アップまでシェイク フラスコの数ミリリットルまでディープ ウェル プレートで microlitres の何百もの異なるスケール間最も似ているメソッドを持ちすることが望ましいバイオリアクター。シェイク フラスコは、小さなバイオリアクターとして既に同じようなボリュームを提供できますが、定数供給、通気および成長のオンライン監視13など大規模な蛋白質の生産の関連性の高いいくつかの制限があり、酸素供給。シェイク フラスコを適応光学監視を採用し、振動デバイスなど主要な文化パラメーターに関する一定のオンライン情報を提供しながら並列の耕作のためのより洗練された機器をコスト効果の高い代替手段を提供します。バイオマスと溶存酸素濃度。複雑な技術的なソリューションと、以前に適用された単純なフルよりもバイオリアクターのより同様の条件をシミュレートするデバイスに依存せず一定と制御フィードを保護する高分子キャリアから炭素源の遅い解放を適用ことができます。10,,炭素ソース9の枯渇を制限する継続的な蛋白質の表現のためのエネルギーになります。
次のメソッドを説明します小さな中規模メタノール フリー制御タンパク質発現するp. 分析のシステムに基づいて新しいプロモーター PDCと PDf.抑制が解除による誘導には、2 つのフェーズが含まれます。小さいながらも一定の濃度で炭素源を供給するプロモーターとターゲット蛋白質の生産の第 2 フェーズを鎮圧する炭素源を使用して興味の蛋白質の生産なしバイオマス蓄積の最初の短いフェーズderepressed プロモーターを維持します。最も重要な耕作パラメーターのオンライン監視、全栽培期間中に適用されます。目標は、 p. 分析のメタノール無料、信頼性が高く、スケーラブルな栽培システムを提供することでした。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="641">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacto Yeast Extract</td>
			<td style="width:139px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">212720</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Baffled Flask 250 mL</td>
			<td style="width:139px;">DWK Life Science</td>
			<td style="width:119px;">212833655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BBL Phytone Peptone</td>
			<td style="width:139px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">298147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BioPhotometer</td>
			<td style="width:139px;">Eppendorf AG</td>
			<td style="width:119px;">5500-200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Certoclav-EL</td>
			<td style="width:139px;">CertoClav GmbH</td>
			<td style="width:119px;">9.842 014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Difco Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
			<td style="width:139px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">291920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Feed discs glycerol</td>
			<td style="width:139px;">Adolf Kuhner AG</td>
			<td style="width:119px;">315060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glucose-monohydrate</td>
			<td style="width:139px;">Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td style="width:119px;">6887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glycerol &#8805;98 %</td>
			<td style="width:139px;">Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">K2HPO4</td>
			<td style="width:139px;">Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>6875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:139px;">Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multitron Standard&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Infors AG</td>
			<td style="width:119px;">444-4226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SFR Vario v2</td>
			<td style="width:139px;">PreSens GmbH</td>
			<td style="width:119px;">200001689</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methanol independent expression by pichia pastoris employing de-repression technologies

メタノールは老舗の炭素源とマイクロ、ラボ、産業規模でホストとして・組成分析(P. 分析) を用いた高効率タンパク質生産のための誘導です。しかし、毒性と可燃性のためP. 分析の高い生産性を維持しながらメタノールを避けるために願望があります。小規模なバイオリアクター耕作 (0.5-5 L 作業量) マイクロ ディープ ウェル プレートでほとんど制御することができますや高価な機器に依存しているので緊張とそのタンパク質の生産特性の評価に使われています。さらに、栽培とp. 分析の誘導のための従来のプロトコル確立された構成式またはメタノール誘導のため、これまでのところ、画面P. 分析式に記述されていた信頼できるプロトコルがありません。系統 (管理して監視された) のパラレル耕作の derepressible のプロモーター。メタノール バイオリアクター等フィード定数遅いグリセロールをシミュレートする表現の自由に対する単純なシェイク フラスコ栽培システムを設けてを特徴付ける新しいタンパク質生産系統を比較してこのような初期の耕作を簡素化するにはそしてオンライン監視、それにより適用小規模バッチ耕作主に比べてバイオリアクターの実際の条件に近い来ています。P. 分析の組換え蛋白質の表現の炭素源をドライブするには、 PDCとPDFが適用されたプロモーターを抑圧しました。高分子ディスク埋め込まれた炭素源、グリセロール、バイオマス発電を抑えながらアクティブなプロモーターを維持するために必要なエネルギーを提供する送り速度を保証の一定量を放出します。

プロトコル セクションで説明されているソフトウェアは全体の栽培上重要な耕作パラメーターを記録します。図 1は、バイオマスの開発と酸素濃度 0.5% (図 1 a) にディスクをフィード グリセリンを添加したバッチで 0.3% (図 1 b) 炭素源を始めた栽培中の可視化を示しています。バッチを丁度定めることが後、オンライン監視システムは、炭素源の枯渇の timepoint としてデ抑圧された耕作のため便利です。それは、図 1に見られるように、媒体中の酸素濃度は急速に低下して、特にバッチ (図 1 a)、バイオマスはこの時点で指数関数的に増加している中で 0.5% のグリセロールのためのゼロに近づいています。ここでは、セルが指数関数的成長段階におよびプロトコルで記述されている炭素ソース リリースの最適の使用をするためには、文化は静止した段階に達する直前にするためにフィードのディスクを追加します。酸素濃度がゼロになる前に、フィードのディスクの追加は、酸素制限から細胞を防ぐためデ抑圧された蛋白質の表現のために重要です。グリセロール濃度は図 1 bに見られるデ抑圧された蛋白質の表現に適しているため、短期的な酸素制限の効果を減らします。
-説明プロトコルと図 1に示すように監視システムを用いた-実験が記載されている 2 つの異なる栽培の結果、次の最初の実験では、PDCと 2 番目の制御の下でコウジカビ ニジェール(A. ニジェール) からブドウ糖酸化酵素を生産するひと成長ホルモンを生産P. 分析株P. 分析ひずみPDFの制御下では示されています。
この実験ではPDCの制御の下でグルコース酸化酵素の産生を調べた。したがって、異なる栽培戦略を比較した: グリセロール パルス、フィードのフィード ・ ディスクおよび任意のフィードまたはパルスなし栽培の添加による一定のグリセリン。栽培は、250 mL シェイク フラスコ (表 1) で唯一の炭素源として 0.5% ブドウ糖 50 mL バッファー最小メディアで行われていた。
160 h 栽培、バイオマスの最高濃度が得られた、バイオマス (38 h) とグリセリン パルス (38 h、61 h 86 h 栽培後 0.25 %w/v グリセロール) グルコース バッチを使用して摂食戦略の頃 (0.21 グラム/L の合計分泌を採用タンパク質には、8.4 U/mL)。バイオマス濃度および分泌タンパク質の総量の 2 倍の削減が得られた 38 h グルコース バッチ後にフィードのディスクが追加されたとき、体積の活動だったも 1 U/mL 高いグリセロール パルスを用いた栽培と比較して.これは、分泌された蛋白質の相当な量清体積活動に寄与しない、不活性形で分泌されることがありますを示します。したがって、グリセロール パルスから高いグリセロール濃度は一見ターゲット蛋白質の生産と 2 倍より高い特定の生産性につながった一定低グリセロール リリースの代わりにバイオマスの形成を支持します。
PDFの制御の下でひと成長ホルモン (hGH) を表現することによって解除抑圧された表現方法を用いた別の実験が行われました。構造安定P. 分析系統 BSYBG11 のゲノムに統合されていた。ここでは、BYPG、50 mL バッファー豊富な媒体、250 mL で困惑してシェイク フラスコは 0.3% (w/v) グリセロールとバッチ内の炭素源として使われました。グリセロール枯渇時にフィードの定数のグリセロールと蛋白質の表現は 4 フラスコ当たりディスクを送りし、比較 (図 2) をフィードないグリセリンの添加により保障されました。
図 2は、hGH 式と栽培フィード定数グリセロールと同じ系統のバイオマスの開発の比較を示しています。HRP を融合した二次抗体と使用された ELISA アッセイ サンドイッチとして、 3, 3′, 5, 5 '-テトラメチルベンチジン (TMB) 基板としての検出を行った。特にこの蛋白質のようである任意の供給なしセルに開始すること (水色の四角)、約 30 時間後作り出された蛋白質が低下する一方、供給することでこの劣化がある可能性がありますケースを防止 (暗い青い三角形) とも、バイオマスあたり蛋白質の集中はまだ栽培の 150 h 後上昇しました。すでにやわらかくする14の観測、としては、この結果は、シェイク フラスコ スケール、フェッド バッチ モードには通常使用されるよう、バッチからの切り替えは、 P. 分析耕作を最適化する方法を示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58589/58589fig1.jpg"> 図 1: オンラインでの可視化バッチで異なるグリセロール濃度の 2 耕作中のパラメーターを記録した。0.5 w/v (A) と細胞がフラスコあたり 4 フィード ディスクを適用する給電解消抑圧相続くバッチで 0.3 %w/v (B) グリセロール栽培が開始された (0.5 mg/h の速度/ディスクの製造元によると)。破線は、連続線を示す細胞密度 (外径600) に対し、中で酸素濃度を表示します。誤差範囲を示す六つの標準偏差 (2 生物、3 技術) がレプリケートされます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58589/58589fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58589/58589fig2.jpg"> 図 2: バッチおよび供給バッチ モードでひと成長ホルモン (hGH) 式の比較。hGH コンテンツは 405 で吸収値によって示される 2nd抗体は HRP 融合、TMB は検出基板として使用された ELISA によって nm。2 つの異なる文化の結果を示す: 細胞密度と hGH 濃度グリセロールがディスクをフィード、文化と比較して、バッチ後フィードがない文化のセルの密度によって正規化された青色の線、正方形ディスプレイの光(濃い青色の線と三角形) を適用します。誤差範囲を示す六つの標準偏差 (2 生物、3 技術) がレプリケートされます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58589/58589fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">栽培時 160 h PDCGOX</td>
			<td colspan="2">外径 φ600</td>
			<td colspan="2">集活動 [U/mL]</td>
			<td colspan="2">分泌タンパク質 [mg/mL] の合計額</td>
			<td>細胞密度あたりの体積の活動</td>
		</tr>
<tr>
<td>意味</td>
			<td>SD</td>
			<td>意味</td>
			<td>SD</td>
			<td>意味</td>
			<td>SD</td>
			<td>意味</td>
		</tr>
<tr>
<td>BMD1% バッチ + グリセリン パルス</td>
			<td>74.6</td>
			<td>2</td>
			<td>8.4</td>
			<td>2.4</td>
			<td>0.21</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>BMD1% バッチ + 定数グリセロール フィード</td>
			<td>32.5</td>
			<td>0.3</td>
			<td>9.4</td>
			<td>0.7</td>
			<td>0.09</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.29</td>
		</tr>
<tr>
<td>BMD1% バッチ</td>
			<td>18.8</td>
			<td>0.6</td>
			<td>3.7</td>
			<td>0.7</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: メタノール独立した GOX 式デ抑圧されたプロモーターの制御下の結果 PDC .

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Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

メタノール・組成分析解消抑圧技術の採用によって独立式

初めてのこのメソッドは、 ・組成分析 (Komagataella phaffii)、炭素規制ソース プロモーター Pを用いた効率的な誘導メタノール無料組換えタンパク質生産の信頼性の高い実験手順を説明しますDCと PDF栽培中小規模な実験では、パラメーターはオンラインでに監視できます、定数グリセロール フィードが適用されます。

Methanol is a well-established carbon source and inducer for efficient protein production employing Pichia pastoris (P. pastoris) as a host on micro-, lab ...

この方法は、ピキア牧歌によってクローン染色体の事前選択を助けることができるピキア牧歌株は、スケールアップ前に単純なシェイクフラスコ培養によって抑圧されていない条件下で組換えタンパク質を発現する。この技術の主な利点は、重要な栽培パラメータの正確なオンラインモニタリングによってサポートされているピキアパストリスを使用して、高レベルのメタノールフリータンパク質発現を達成できることです。一般的に、この方法に新しい個人は、特定の生産株の成長特性に合わせてガラス成長飼料を開始するためのタイムポイントを必要とするため、苦労する可能性があります。主な培養を設定する前に、50 mlの円錐チューブで5mlの酵母ペプトおよびデキストロースブロスに目的の発現株の単一の新鮮なコロニーを播種する。適切な吸入を可能にするために蓋を少し開いたままにしておきます。より、一晩で摂氏28度、湿度80%、100〜130RPMでシェーカーに培養を入れます。接続が成功すると、制御画面が表示されます。実験を設定するには、[測定開始]をクリックします。実験に名前を付け、監視に必要なすべてのパラメーターが有効になっているかどうかを確認します。間隔を 3 分に設定し、平均測定ポイントを 11 に設定します。サンプルの名前を入力し、角度の調整をスキップします。分光光度計で600ナノメートルの波長で1~20分の1の割合で希釈した一晩培養物の細胞密度を測定する。培地の50mlを一晩培養して05のOD600に接種する。は、フラスコを28°C、130 RPM、湿度80%の検出器に5分間置きます。ソフトウェアで測定開始をクリックします。接種の4時間後、ちょうど実証したように細胞密度測定用に2mlサンプルを使用する。酸素濃度がゼロに近づき、細胞が指数成長期にあるとき、滅菌条件下で各フラスコに4つのグリセロール供給ディスクを追加します。より、フラスコを更に60〜90時間振る培養器に戻す。24時間ごとにサンプルを採取し、選択したアッセイにより細胞密度とタンパク質発現を監視します。培養終了時に、培養物を50mlの円錐チューブに移して遠心分離を行う。さらに分析するために、ソフトウェアからオンライン測定データをスプレッドシートファイルとしてエクスポートします。本代表的な栽培では、バイオマスが指数関数的に増加した際に原料となるグリセロール濃度が5%であったが、酸素はほぼゼロに減少した。低いグリセロール濃度は、短期的な酸素制限の効果を減少させ、したがって、抑圧を緩和したタンパク質発現に推奨される。この代表的な実験では、グリセロール枯渇時に抑制された促進剤を抑制した炭素源の制御下で発現したこの代表的な実験では、フラスコ当たり4つのフィードディスクを添加することにより、タンパク質発現を抑制して確認した。予想通り、グリセロール供給ディスクの存在下でのヒト成長ホルモン発現とバイオマスの開発は時間の経過とともに増加し、一方で、グリセロールサプリメントがない場合にはタンパク質発現が減少し、バイオマスは一定のままでした。この手順を試みる際には、最適な発現開始時間を決定するために、栽培パラメータを注意深く観察することが重要です。この手順に従って、タンパク質濃度判定ウェスタンブロット分析や活性アッセイなどの他の方法は、タンパク質収率評価および小規模バイオリアクター実験のために、個々の株の性能に関する追加の質問に大きなスケールで答えるために行うことができる。その開発後、この技術は、メタノールフリー組換えタンパク質発現の分野の研究者が、ピキア牧歌に一般的に使用されるメタノール依存性AOX1プロモーターに代わる有望な代替手段を探求する道を開いた。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

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The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

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