Name: methanol independent expression by pichia pastoris employing de-repression technologies
Uploaded: 2019-01-23T14:45:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies at JoVE.com

ROBOX получил финансирование от Европейского союза (ЕС) проекта ROBOX (Грант соглашение n ° 635734) под горизонтом 2020 Программа исследований и инноваций ЕС действия H2020-LEIT био-2014-1. Взгляды и мнения, высказанные здесь являются только те автора(ов) и не обязательно отражают исследовательского агентства Европейского союза. Европейский союз не несет ответственность за любое использование, которые могут быть сделаны из содержащейся здесь информации.
Кандидатскую диссертацию J. Fischer финансируется совместно Грант для «Industrienahe диссертацию «австрийский финансирование агентства FFG.
Мы благодарим Gernot Джон (Подарочные GmbH) за полезные обсуждения и ценным вкладом для проекта рукопись.

1. средства массовой информации подготовка
<ol><li>Буферизованный минимальный СМИ (BMG с глицерином, BMD с декстроза как источник углерода) подготовка (1 Л)<ol>
<li>Автоклав 650 мл дистиллированной воды в стеклянной бутылке колпачок 1 Л. После охлаждения, полный носитель, добавив 100 мл из газобетона 10 x YNB (134 г/Л дрожжи азота базы аминокислот), 200 мл буфера фосфат калия (1 М, pH 6), 30-100 мл 10% w/v глюкозы или глицерина (в зависимости от желаемого сгенерированный биомассы во время партии) 2 мл стерильного 500 x биотин (10 мг/мл) раствора и заполнить до 1 L с стерильной дистиллированной воды. Примечание: Все ингредиенты должны быть газобетона в отдельных контейнерах. Биотин разрушается, когда газобетона и поэтому должен быть фильтр, стерилизованное с 0,2 мкм мембранные фильтры.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Буферизованный богатые средства массовой информации (BYPG) (1 Л)<ol>
<li>Автоклав 700 мл дистиллированной воды с 1% w/v дрожжевой экстракт и 2% w/v Пептон в бутылке колпачок 1 Л. После охлаждения, добавить 30-100 мл отдельно газобетона глицерина 10% w/v, 200 мл буфера фосфат калия (1 M, рН 6) и наполните стерильной дистиллированной водой до 1 Л.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Встряхните колбы подготовка
<ol><li>Добавьте 5 мл дистиллированной воды в 250 мл озадачен встряхнуть флакон, покрывают двумя слоями хлопчатобумажной ткани и исправить ее на месте с резинками. Обложка ткань кусок алюминиевой фольги.</li>
	<li>Автоклав фляги при 121 ° C 20 мин для полной стерилизации.</li>
	<li>Удалите остатки воды из фляги и аликвота 50 мл ранее подготовленных средствами массовой информации для каждого колбу.</li>
</ol>3. ночь культуры прививка
<ol><li>Начните ночь культуры (ONC) с одной свежей колонии штамма нужное выражение в 5 мл YPD (экстракт дрожжей 1% w/v, 2% w/v Пептон, 2% w/v глюкозы) в 50 мл пластиковых пробирок оставляя крышку слегка открытой возможность надлежащей аэрации.</li>
	<li>Пусть растут в ночь на 28 ° C, влажность 80%, в шейкере на 100-130 об/мин (пожимая диаметром 2,5 см).</li>
</ol>4. Измерение установки и основные культуры выращивания
<ol><li>Для создания онлайн мониторинга системы, следуйте инструкциям производителя для соответствующей калибровки устройств.</li>
	<li>Разместите компьютер, где соответствующее программное обеспечение для мониторинга устанавливается в диапазоне для соединения Bluetooth для измерительных станций. Запустите программное обеспечение для подключения устройства через Bluetooth.<ol>
<li>Включите Bluetooth соединение на биомассе измерительного устройства, нажав кнопку серебро на фронте.</li>
		<li>В программном обеспечении щелкните устройства , а затем Найти устройства. Примечание: Устройства должен появиться как список в окне ниже линии задачи. Если они не делают, желательно проверить если батареи заряжены, и компьютер находится в пределах досягаемости для соединения Bluetooth.</li>
		<li>Перетащите и поместите найденные устройства для квадратов на правой стороне экрана Измерения лоток.</li>
		<li>Нажмите кнопку подключить. Примечание: Если соединение прошло успешно, появится экран управления.</li>
		<li>Чтобы запустить тестовый запуск для соединения Bluetooth, нажмите кнопку измерения.</li>
		<li>Настройка эксперимента.<ol>
<li>Нажмите Начать измерение, название эксперимента и включить все параметры, необходимые для мониторинга. Примечание: Лицензии необходимы для каждого из возможных измеряемых параметров.</li>
			<li>Задать интервал в 3 мин. Примечание: Интервал определяет, как часто принимаются точек измерения и каждая точка измерения приводит значение потом. Измерения каждую минуту является очень точным, но много данных создаются которых делает его более трудоемким для оценки.</li>
			<li>Набор Точек измерения среднего до 11. Примечание: Этот параметр определяет, сколько точек измерения фактически принимаются каждые 3 мин. Таким образом, выводится среднее значение 11 точек измерения свыше 11 s.</li>
			<li>Введите имена для образцов.</li>
			<li>Пропустите следующий экран, как угол уже был откалиброван перед (шаг 4.1). Примечание: Тестовый запуск для соединения Bluetooth до прививки основных культур рекомендуется обеспечить стабильные соединения и соответствующее расположение подключенного компьютера. Кроме того батареи должны оплачиваться.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Измерьте плотность ячеек ONC (шаг 3.1) разводят в выращивании СМИ (1:20) в спектрофотометре при длине волны 600 Нм. 50 мл средства прививок (рекомендовано концентрация источника углерода 0,3-1%, возможности различных средств массовой информации, как описано в шаге 1.) с ONC ОД600 0,05, используя следующие вычисления. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58589/58589eq1.jpg">
</li>
	<li>Фляги в детекторы и поколебать на 28 ° C, 130 об/мин и 80% влажности. Примечание: Очень важно дать культуры 5 мин тряски до начала измерения, чтобы избежать клетки прилипания к нижней части колбы и приносит неправильные значения.</li>
	<li>Нажмите кнопку Начать измерения в программном обеспечении.</li>
	<li>Возьмите 0,2 мл образцы для измерения плотности клеток 4 h после прививки и когда получает источника углерода в исчерпаны (определение, описанный в шаге 4.7) в triplicates. Развести образцы надлежащим образом в выращивании СМИ (первый измерения 1:5, второй измерений 1:20) и измерять поглощение на длине волны 600 Нм в спектрофотометре. Перед удалением колбы и даже перед остановкой шейкер всегда пауза измерения в программном обеспечении. Примечание: Детекторы откалиброваны для записи параметров при определенных условиях тряски и принесет нонсенс измерений при записи еще культур. Кроме того убедитесь, что всегда подождать 5 мин, пожимая перед началом измерения снова. Измерения плотности клетки необходимы, потому что детектор поставляет только значения для биомассы и плотность не реальные клеток. Функция калибровки между значениями600 OD (x значения) и значения, полученные в системе онлайн измерения (y значения) может быть достигнуто путем измерения несколько timepoints спектрофотометрически. Значения, не в линейной, но в логарифмические отношения согласно следующей функции калибровки: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58589/58589eq2.jpg"> y: од600 значения, полученные на спектрофотометре x: значения, полученные системой онлайн измерения k: склона d: оси перехвата Наклон и пересечение оси затем может использоваться для преобразования любого значения в соответствующее значение600 ОД. В Excel один можно участок спектрофотометрически полученные значения600 ОД против значения из онлайн системы от же timepoint. Добавление Логарифмическая аппроксимация и соответствующее уравнение даст функция калибровки, показано выше.</li>
	<li>Культивируйте до тех пор, пока источник углерода является почти истощены (примерно 12-20 ч). Для этой цели пусть расти до тех пор, пока его можно увидеть в диаграмм программного обеспечения, что концентрация кислорода приближается к нулю, и клетки находятся в стадии экспоненциальный рост культур. Примечание: Это в случае концентрации источника углерода, используемые в настоящем Протоколе. Timepoint истощение источника углерода могут быть определены с онлайн системы мониторинга, как это образцово показано на рис. 1 в разделе представитель результаты, когда уровень кислорода к нулю и клетки находятся в экспоненциальный рост фаза.</li>
</ol>5. белков де репрессий
<ol><li>Когда достигается timepoint, описанной в 4.6 шаг, Начните кормить культур путем добавления четырех каналов дисков за флакон в стерильных условиях. Примечание: В описанных условиях, четыре канала диски Глицерин выпуска глицерин 2 мг/ч, по словам производителя.</li>
	<li>Продолжать культивирования для 60-90 h принимая образцов каждые 24 часа, для наблюдения за выражение протеина в assay выбора (например., Брэдфорд пробирного15,16 или деятельность анализов страницы SDS) и клеточной измерения плотности.</li>
</ol>6. Культура сбора урожая
<ol><li>После 60-90 h культивирования заполните культур в 50 мл пробирок для уборки центрифугированием в 4000 x g, 4 ° C на 10 мин. Примечание: Супернатант (для секретируемые белки) или клетки (для внутриклеточных белков) могут быть собраны путем центрифугирования в 4000 x g, 4 ° C на 10 мин и дальнейшего анализа может быть сделано.</li>
	<li>Экспорт данных онлайн измерений в формате электронной таблицы из программного обеспечения для дальнейшего анализа.</li>
	<li>Заполните 5-10 мл дистиллированной воды в колбах и автоклав для инактивации оставшиеся ячейки.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bill, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Playing+catch-up+with+escherichia+coli:+Using+yeast+to+increase+success+rates+in+recombinant+protein+production+experiments.">Playing catch-up with escherichia coli: Using yeast to increase success rates in recombinant protein production experiments.</a> Frontiers in Microbiology. 5 (MAR), 1-5 (2005).</li><li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Protein+Expression+in+Pichia+pastoris).">Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris).</a> Molecular Biotechnology. 16, 23-52 (2000).</li><li>Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+source+dependent+promoters+in+yeasts.">Carbon source dependent promoters in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).</li><li>Vogl, T., Kickenweiz, T., Sturmberger, L., Glieder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+Promoter.">Bidirectional Promoter.</a> US patent. , (2005).</li><li>Vogl, T., Glieder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Pichia+pastoris+promoters+and+its+consequences+for+protein+production.">Regulation of Pichia pastoris promoters and its consequences for protein production.</a> New Biotechnology. 30 (4), 385-404 (2013).</li><li>Ru&#223;mayer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-level+organization+of+yeast+methylotrophic+lifestyle.">Systems-level organization of yeast methylotrophic lifestyle.</a> BMC Biology. 13 (1), 80 (2015).</li><li>Sakai, Y., Yurimoto, H., Matsuo, H., Kato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+peroxisomal+proteins+and+organelle+proliferation+by+multiple+carbon+sources+in+the+methylotrophic+yeast,+Candida+boidinii.">Regulation of peroxisomal proteins and organelle proliferation by multiple carbon sources in the methylotrophic yeast, Candida boidinii.</a> Yeast. 14 (13), 1175-1187 (1998).</li><li>Hartner, F. S., Glieder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+methanol+utilisation+pathway+genes+in+yeasts.">Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 5, 39 (2006).</li><li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Toolbox+of+Diverse+Promoters+Related+to+Methanol+Utilization:+Functionally+Verified+Parts+for+Heterologous+Pathway+Expression+in+Pichia+pastoris.">A Toolbox of Diverse Promoters Related to Methanol Utilization: Functionally Verified Parts for Heterologous Pathway Expression in Pichia pastoris.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (2), 172-186 (2016).</li><li>Mellitzer, A., Weis, R., Glieder, A., Flicker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+lignocellulolytic+enzymes+in+Pichia+pastoris.">Expression of lignocellulolytic enzymes in Pichia pastoris.</a> Microbial Cell Factories. 11 (1), 61 (2012).</li><li>Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+protein+production+using+the+Pichia+pastoris+expression+system.">Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system.</a> Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).</li><li>Weis, R., Luiten, R., Skranc, W., Schwab, H., Wubbolts, M., Glieder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+high-throughput+screening+with+Pichia+pastoris+by+limiting+yeast+cell+death+phenomena.">Reliable high-throughput screening with Pichia pastoris by limiting yeast cell death phenomena.</a> FEMS Yeast Research. 5 (2), 179-189 (2004).</li><li>Ukkonen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Improvement of Recombinant Protein Production in Shaken Cultures. , (2014).</li><li>Jeude, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fed-batch+mode+in+shake+flasks+by+slow-release+technique.">Fed-batch mode in shake flasks by slow-release technique.</a> Biotechnology and Bioengineering. 95, 433-445 (2006).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Smith, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+of+Proteins.">SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins.</a> Methods in molecular biology. 1, 41-55 (1984).</li><li>Hartner, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+Library+Designed+for+Fine-Tuned+Gene+Expression+in+Pichia+Pastoris.">Promoter Library Designed for Fine-Tuned Gene Expression in Pichia Pastoris.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), e76 (2008).</li><li>Panula-Per&#228;l&#228;, J., Vasala, A., Karhunen, J., Ojamo, H., Neubauer, P., Mursula, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+slow+glucose+feed+cultivation+of+Pichia+pastoris+without+repression+of+AOX1+promoter:+towards+high+throughput+cultivations.">Small-scale slow glucose feed cultivation of Pichia pastoris without repression of AOX1 promoter: towards high throughput cultivations.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 37 (7), 1261-1269 (2014).</li></ol>

Хотя представленные протокол обычно применяется для культивирования и индукции при derepressed условиях, bisy e.U. объявляет иметь интерес в коммерциализации новых derepressed промоутеров, используемые в данном исследовании.

Этот метод представляет надежный протокол для эффективного метанола независимых индуцибельной выражение P. сумка как альтернативу классической метанола индуцированной выражение протеина, движимый PAOX112. Де repressible промоутеров, как PDC, PDF или ранее описанных мутировавших PAOX1 варианты17, построить молекулярные основы для этой новой концепции производства белка. Показано представитель результаты подчеркивают полезность и целесообразность экспрессии рекомбинантных белков в P. сумка де репрессированных промоутеров и мелких скрининга с простой онлайн мониторинг. С одной стороны вредных и токсичных метанола, который обычно используется для индукции AOX1 промоутер могут быть устранены от выращивания. С другой стороны, рост и этапа производства белка являются центровку9 в отличие от учредительных белков, например., с часто используемым Pразрыв. Это особенно полезно, когда клетки следует выразить токсичных или вредных белков, которые отображают бременем для них.
Возможность запуска культивирования с различными углерода источником концентрации позволяет решение начинается сколько биомассы, хотелось бы получить до этапа производства белка. При выборе более низкой концентрации источника углерода в пакете, ограничения передачи кислорода из-за слишком высокой ячейке плотности может быть уменьшена, а с другой стороны более высокой плотности клеток может также привести к более высокие титры белка. Путем мониторинга развития культуры с точки зрения биомассы и концентрации кислорода, оптимальный момент для инициации ФРС партии могут быть определены легко как это показано на рисунке 1.
Для онлайн мониторинг этих параметров выращивания, должны применяться соответствующие измерения системы. Измерительные устройства (например, SFR Vario) биомасса представляет собой простой и экономического измерения онлайн система мониторинга культуры в встряхнуть колбы. Оптико-электронный читатель определяет рост клеток в колбу через рассеянного света обнаружения и считывает сигнал датчика кислорода, интегрированных в колбу. Оптика для биомассы измерения состоят из светодиод, который излучает световой сигнал, который рассеяны частицы (клетки) в культуре бульон и обнаружены с фотодиод. Датчики фотооптические излучают флуоресценции при возбуждении светом определенной длины волны. В зависимости от количества аналита молекул в настоящее время этот сигнал флуоресценции изменения, которая определяется читателя Оптика и переведена на значения концентрации. Однако калибровка измерений плотности клетки должен быть создан заранее, так как система измерений не измерения фактических значений600 ОД. Наклон кривой кислорода с программным обеспечением чтения можно рассчитать скорость поглощения кислорода, и температуры, а также об/мин, непрерывно записываются вместе с другими параметрами. Чтобы включить мониторинг с этой системой, встряхните флакон должны быть ранее оснащены надлежащими датчиками для желаемых параметров.
Путем добавления четырех полимер медленно релиз дисков, обеспечивая постоянное количество глицерина в культуре бульон, накопление биомассы почти остановился и производство рекомбинантных белков продолжается. Определение точки время подачи диска дополнение не является важнейшим шагом в этом эксперименте, но его следует рассматривать, что преждевременно корма начала до фазы экспоненциального роста может ингибирующих промоутер активации как выражение начинается после истощение источника углерода. Кроме того общее время из-за ограничений емкости полимерные кормления может быть уменьшена, тогда как задержки канала после того, как клетки достигли стационарной фазы может привести к голодали и деградации уже произведены протеина. Количество корма диски, используемые в настоящем Протоколе определяли экспериментально для оптимального углерода исходного выпуска держать промоутер де репрессированных удерживая биомассы низкого (данные не показаны). Таким образом, может быть культивирования выполнены легко свыше 160-180 h без какого-либо вмешательства.
Основные области применения этого нового протокола будет в выражение клон скрининг, фермент эволюции и открытия, характеристика и инженерии новых промоутеров, используя протокол метанола бесплатно культивирования в хорошо контролируемых условиях. В принципе тот же протокол должен быть применимым для смешанного корма стратегий использования метанола и ограниченной ферментативным углерода источник каналы, такие как описанные Панула-Perälä и др. в 2014 году18.

Улучшение доходности и условия надежной культивирования на больших масштабах для производство рекомбинантных белков микроорганизмов, таких как бактерии или дрожжей является одной из основных потребностей сегодняшних биотехнологии1 и коммерческого успеха промышленной приложения. Благодаря простой культивирования процедуры и СМИ, высокая урожайность и хорошо характеризуется инструменты2 Pichia сумка (Komagataella phaffii) является широко используемым нетрадиционных дрожжей для производства рекомбинантного белка. Дополнительные новаторские инструменты постоянно разрабатываются для этого вида, как новые векторы выражения, включая новые промоутеров в качестве альтернативы широко используемым PAOX1, промоутер региона алкоголя оксидазы 1 ген3, 4,5. Как промоутер регион, который позволяет новой стратегии бесплатно метанола и универсальный выражение в P. сумкабыла определена 500 bp длинные последовательности ДНК вверх по течению CAT1 (CTA1) гена. Ген CAT1 является единственным каталазы ген P. сумка и белок расположен в пероксисомы. Каталаза играет важную роль в детоксикации реактивнооксигенных видов, которые возникают, например., от окисления метанола в пероксисомальной пути MUT или во время бета окисления жирных кислот6,7. Экспрессия гена CAT1 репрессированных в prescence глюкозы или глицерина в среде культивирования и derepressed после истощения этих источников углерода8. Кроме того выражение гена каталазы может быть наведено с метанолом и remarkebly также с олеиновой кислоты, казалось бы только геном P. сумка MUT путь, который может быть наведено с олеиновой кислоты, даже достигнув аналогичные уровни выражения как с метанол индукции9.
Для производства внутриклеточно выразил и секретируемые белки уже протестирована 500 bp фрагмент этого P. сумка CAT1 промоутер, который называется PDC (иногда сокращенно PCAT1-500), и он оказался привлекательной альтернативой два классических P. сумка промоутеров – сильный учредительный Pразрыв и метанола индуцибельной PAOX1, которые были разработаны более чем 20 лет назад. PDC смогла достичь 21% (CalB) и 35% (ПХ) объемные деятельности по сравнению с Pразрыв в богатой среде сахар. После индукции метанола PDC не только ответили быстрее, чем PAOX1, но может также явно превосходят его в 2,8 раза выше окончательный титр CalB9.
Помимо PDCorthologous промоутер (DFP) были выявлены экспонируется аналогичный профиль регулирования. Однако это значительно сильнее, чем PDC под derepressed, а также в метанол индуцированной условиях (рукопись в подготовке)3.
В случаях, когда сильный учредительный Pразрыв связи физиологически проблематично или цитотоксические белков10,11PDC и PDF представляют идеальной альтернативой. В микро масштаб экспериментов, выражение, движимый эти промоутеры начинается после истощения источника первоначального углерода (например., глюкоза или глицерин), которая облегчает производство биомассы без обременения клетки с гиперэкспрессия Рекомбинантный белок с самого начала. Хотя оба этих промоутеров еще индуцибельной метанолом, активации, derepression делает дополнительное использование этапа отказников по сравнению с выражения, используя PAOX1. Кроме того,DC P и PDF может использоваться для производства метанола бесплатно белка, который является желательной целью для12крупных промышленных процессов.
Для разработки применимых производства штаммов и выражение конструкций несколько шагов в развитии должны передаваться для того чтобы сужать вниз от большого числа трансформантов предпочтение кандидату для масштабирования. Показы обычно выполняются в высокой пропускной способности в нескольких хорошо пластины (микро масштаб: менее 0,5 мл) для того, чтобы захватить ряд клоны, как можно. Последующие повторно скрининг и re-re-screening это следующий шаг, а затем встряхните флакон (малого масштаба: 50-250 мл) или (микро-) биореактор показы12. Однако это желательным иметь метод, который наиболее похож между различными шкалами из сотни microlitres в глубокой скважины пластины до несколько миллилитров в колбах сотрясения до более поздних масштабов производства метанола бесплатно в хорошо контролируемых биореакторы. Хотя встряхнуть флакон может предоставить уже аналогичные объемы как малых биореакторах, существует несколько ограничений, которые весьма актуальны для крупномасштабного производства белка как постоянное кормление, аэрации и онлайн мониторинг13 роста и снабжение кислородом. Оптического мониторинга применения адаптированных встряхните флакон и встряхивания устройства обеспечивают экономически эффективные альтернативы более сложного оборудования для параллельных культивирования по-прежнему обеспечивая постоянный онлайн информацию о параметрах основных культуры такие как Биомасса и концентрации растворенного кислорода. Медленное освобождение источника углерода из полимерных носителей может быть применен к обеспечить постоянный и контролируемый канал не полагаясь на сложные технические решения и устройства, имитируя более аналогичных условиях чем ранее примененные простой полный биореакторов истощение источника углерода9,10, где энергия для текущих белков становится ограничение.
Следующий метод описывает малого среднего масштаба метанола свободного управляемым белков в P. сумка системы на основе новых промоутеровDC P и PDF. Индукции, derepression включает в себя два этапа. Первый короткий этап накопления биомассы без производства протеина интереса, с использованием источника углерода, который подавляет промоутеров и второй этап целевого белка производства, где источник углерода поставляется в небольшой, но постоянный концентрации поддержание derepressed промоутер. Онлайн мониторинг важнейших параметров выращивания применяется в период всей культивирования. Целью было обеспечить свободный метанола, культивирования надежной и масштабируемой системы для P. сумка.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="641">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacto Yeast Extract</td>
			<td style="width:139px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">212720</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Baffled Flask 250 mL</td>
			<td style="width:139px;">DWK Life Science</td>
			<td style="width:119px;">212833655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BBL Phytone Peptone</td>
			<td style="width:139px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">298147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BioPhotometer</td>
			<td style="width:139px;">Eppendorf AG</td>
			<td style="width:119px;">5500-200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Certoclav-EL</td>
			<td style="width:139px;">CertoClav GmbH</td>
			<td style="width:119px;">9.842 014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Difco Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
			<td style="width:139px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">291920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Feed discs glycerol</td>
			<td style="width:139px;">Adolf Kuhner AG</td>
			<td style="width:119px;">315060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glucose-monohydrate</td>
			<td style="width:139px;">Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td style="width:119px;">6887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glycerol &#8805;98 %</td>
			<td style="width:139px;">Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">K2HPO4</td>
			<td style="width:139px;">Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>6875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:139px;">Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multitron Standard&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Infors AG</td>
			<td style="width:119px;">444-4226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SFR Vario v2</td>
			<td style="width:139px;">PreSens GmbH</td>
			<td style="width:119px;">200001689</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methanol independent expression by pichia pastoris employing de-repression technologies

Метанол является источником устоявшихся углерода и индуктором для производства эффективного белков, используя Pichia сумка обыкновенная (P. сумка) как хозяин на микро-, лаборатории и промышленного масштаба. Однако из-за своей токсичности и воспламеняемости, есть желание избежать метанола при сохранении высокой производительности P. сумка. Малых масштабах культивирования биореактора (0,5-5 L Рабочий объем) широко используются для оценки штамм и его характеристики производства белка, поскольку микромасштабной культивирования в глубоких скважин пластины вряд ли может управляться или опирается на дорогостоящее оборудование. Кроме того традиционные протоколы для культивирования и индукции P. сумка были созданы для составных выражений или метанола индукции и до настоящего времени без надежных протоколов были описаны на экране P. сумка выражение штаммы с derepressible промоутеров в (управляемой и контролируемой) параллельных культивирования. Для упрощения таких первоначальных культивирования характеризуют и сравнить новые штаммы производства белка, мы создали систему выращивания простого сотрясения колбу для метанола свободное выражение, которая имитирует биореактор условий, включая постоянное медленно глицерин кормить и онлайн мониторинг, таким образом ближе к реальным условиям в биореакторах, по сравнению с главным образом прикладной мелкие партии культивирования. Водить рекомбинантных белков в P. сумка, источника углерода репрессированных промоутеров, которые были применены DC P и PDF . Полимерные диски с источником встраиваемых углерода, выпустив постоянное количество глицерина, заверил скорость подачи доставки энергии, необходимой для поддержания активных промоутеров при сохранении низких биомассы.

Как описано в разделе протокол, программное обеспечение записи параметров важных выращивания над всей культивирования. На рисунке 1 показана визуализация биомассы развития и концентрации кислорода во время выращивания, начал с 0,5% (рис. 1A) или источника углерода 0,3% (рис. 1B) в пакете с последующим добавлением глицерина, кормить дисков. Онлайн система мониторинга особенно полезна для де репрессированных культивирования как timepoint истощение источника углерода после того, как пакет может быть определен точно. Как видно на рисунке 1, концентрация кислорода в среде быстро снижается и приближается к нулю, особенно для 0,5% глицерина в пакете (.Рисунок 1A) в то время как биомасса растет экспоненциально в этот момент. Здесь клетки находятся в фазе экспоненциального роста и для оптимального использования выхода источника углерода, незадолго до культуры достигает стационарной фазы, корма диски должны быть добавлены как это описано в протоколе. Добавление канала диски, прежде, чем концентрация кислорода достигает нуля имеет важное значение для исключения из репрессированных белков предотвратить клетки кислород ограничения. Более низкие концентрации глицерина снижают эффект краткосрочные ограничения кислорода, как это можно увидеть на рисунке 1B и поэтому рекомендуется для снятия репрессированных белков.
В следующем, результаты двух различных культивирования, которые описаны эксперименты – применяя описанных протокол и системы мониторинга, показано на рисунке 1 –. В первом эксперименте, P. сумка штамм производит глюкозооксидазы Aspergillus niger (а. Нигер) от под контролем PDC и во втором штамм P. сумка , производство человеческого гормона роста под контролем PDF показано.
В этом эксперименте глюкоза оксидаза производства под контролем PDC был исследован. Таким образом, были сопоставлены различные культивирования стратегии: глицерин пульсирует, постоянное глицерин, кормить, кормить дисков и выращивания без каких-либо корма или пульсирующей. Культивирование было сделано в 50 мл буферизации минимальный СМИ с 0,5% глюкозы как источника единственного углерода в 250 мл дрожания колбы (Таблица 1).
После 160 ч культивирования самая высокая концентрация биомассы были получены, когда работал кормления стратегию, используя пакет глюкозы для производства биомассы (38 h) и глицерин пульсирует (0,25% w/v глицерола после 38 h, 61 h и 86 h культивирования) (0,21 г/Л всего секреторного белок, 8.4 ед/мл). Хотя два раза сокращение биомассы концентрацию и общее количество выделяется белка были получены, когда корма диски были добавлены после 38 h глюкозы партии, объемная активность был даже 1 ед/мл выше по сравнению с выращивания с использованием импульсной глицерина . Это означает, что значительное количество выделяется белка не способствуют объемной активности в надосадке и может быть выделяется в неактивной форме. Таким образом более высокие концентрации глицерина от глицерина импульсов казалось бы пользу формирования биомассы вместо целевого белка производства и постоянной низкой Глицерин выпуска, привели к более чем в два раза выше конкретных производительности.
Еще один эксперимент, используя метод де репрессированных выражение было сделано выражением человеческого гормона роста (hGH) под контролем PDF. Конструкция была стабильно интегрирована в геном штамм P. сумка BSYBG11. Здесь 50 мл BYPG, буферизуются богатые среднего, в 250 мл озадачен встряхнуть флакон был использован с глицерол 0,3% (w/v) как источника углерода в пакете. После истощения глицерина выражение протеина с постоянным глицерин кормить было обеспечено путем добавления 4 канала диски за флакон и по сравнению с не глицерин, канал (рис. 2).
Рисунок 2 показывает сравнение между hGH выражения и развития биомассы же штамма, культивируемых с и без постоянной глицерин канала. Как assay сэндвич ELISA был использован с вторичного антитела, сливается с ПХ и обнаружения осуществлялась с 3,3′, 5, 5 ' тетраметилбензидина (ТМБ) как субстрат. Специально для этого белка, казалось бы, дело, что без каких-либо кормление, клетки начинают деградировать производства белка после примерно 30 ч (светло синие квадраты), тогда как кормления, эта деградация может быть предотвращены (темный синий треугольник) и даже концентрацию белка в биомассы по-прежнему возросли после 150 ч культивирования. Как уже отмечалось, для Hansenula polymorpha14этот результат показывает, как переход от партии, как он обычно используется в встряхнуть флакон масштаба, кормили пакетный режим может оптимизировать P. сумка культивирования.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58589/58589fig1.jpg"> Рисунок 1: Визуализация онлайн записаны параметры во время двух культивирования с концентрациями различных глицерина в пакете. Культивирования были начаты с 0,5% w/v (A) и глицерол 0,3% w/v (B) в пакете последовал этап де репрессий где клетки были поданы применения 4 канала диски за флакон (релиз 0.5 мг/ч/диск по данным производителя). Пунктирные линии показывают концентрацию кислорода в среде, тогда как непрерывные линии показывают, плотность клеток (600OD). Планки погрешностей показывают, что стандартное отклонение шести реплицирует (2 биологического, три технических каждый). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58589/58589fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58589/58589fig2.jpg"> Рисунок 2: сравнение человеческого гормона роста (hGH) выражение в режиме пакетной и кормили пакетного. указывается содержание гормона роста значения поглощения на 405 нм по ELISA, где антитела 2nd HRP фьюжн и TMB была использована как субстрат для обнаружения. Приведены результаты для двух различных культур: светло-голубой линии и площадей отображения, плотность клеток и концентрации гормона роста, нормирование по плотности клетки культуры без каких-либо корма после партии, по сравнению с культуры, где глицерин кормить диски были применяется (темно синие линии и треугольники). Планки погрешностей показывают, что стандартное отклонение шести реплицирует (2 биологического, три технических каждый). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58589/58589fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">PDC- GOX во время выращивания 160 h</td>
			<td colspan="2">OD600</td>
			<td colspan="2">Vol. деятельность [U/mL]</td>
			<td colspan="2">Общая сумма выделяется белка [мг/мл]</td>
			<td>объемная активность на плотность клеток</td>
		</tr>
<tr>
<td>Среднее</td>
			<td>SD</td>
			<td>Среднее</td>
			<td>SD</td>
			<td>Среднее</td>
			<td>SD</td>
			<td>Среднее</td>
		</tr>
<tr>
<td>BMD1% пакета + глицерин пульсирующий</td>
			<td>74,6</td>
			<td>2</td>
			<td>8.4</td>
			<td>2.4</td>
			<td>0,21</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0,11</td>
		</tr>
<tr>
<td>BMD1% пакета + постоянное глицерина корма</td>
			<td>32.5</td>
			<td>0,3</td>
			<td>9.4</td>
			<td>0,7</td>
			<td>0,09</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.29</td>
		</tr>
<tr>
<td>BMD1% пакета</td>
			<td>18.8</td>
			<td>0.6</td>
			<td>3.7</td>
			<td>0,7</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: результаты независимого выражения GOX метанола под контролем промотора де репрессированных PDC .

Watch this Scientific Journal Video about Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies at JoVE.com

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

Независимых выражений метанола, Сумка Pichia де репрессий технологии

Этот метод впервые описывает надежные экспериментальные процедуры для эффективного индуцибельной производства метанола бесплатно рекомбинантных белков в Pichia сумка (Komagataella phaffii), используя промоутеров регулируется источника углерода P DCи PDF в небольших масштабах эксперименты во время выращивания параметры могут контролироваться онлайн, и применяется поток постоянно глицерина.

Methanol is a well-established carbon source and inducer for efficient protein production employing Pichia pastoris (P. pastoris) as a host on micro-, lab ...

Этот метод может помочь в предварительном отборе клонов хромосом штаммами Pichia pastoris, выражают рекомбинантные белки в условиях де-репрессированных простыми культивированиями колбы встряхивания до масштабирования. Основным преимуществом этого метода является то, что высокий уровень метанола свободного выражения белка может быть достигнуто с помощью Pichia pastoris, который поддерживается точный онлайн мониторинг важных параметров культивирования. Как правило, лица, новые для этого метода может бороться, потому что точка времени для начала стекла растут корма должна быть адаптирована к характеристикам роста конкретного штамма производства.Прежде чем создать основную культуру, семя одной свежей колонии экспрессии штамма интереса в 5 мл дрожжевого пепто и бульона декстрозы в 50 мл конической трубки. Оставьте крышку слегка открытой, чтобы обеспечить надлежащее аэрации. Чем, поместите культуру в шейкер при 28 градусов по Цельсию, 80% влажности и от 100 до 130 об /мин ночь.На следующее утро запустите программное обеспечение для подключения устройств через Bluetooth. Затем нажмите серебряную кнопку на передней части измерительного устройства биомассы, чтобы включить bluetooth-соединение с устройством и нажмите кнопку найти устройства в программном обеспечении мониторинга компьютера. Перетащите и опустите найденные устройства на квадраты в лотке измерения и нажмите кнопку подключения.При успешном подключении появится экран управления. Чтобы настроить эксперимент, нажмите кнопку «Начать измерение». Назовите эксперимент и проверьте, включены ли все параметры, необходимые для мониторинга.Установите интервал до трех минут, а средние точки измерения до 11. Введите имена для образцов и пропустите калибровку угла. Измерьте плотность клеток ночной культуры, разбавленной соотношением один-двадцать в среде культивирования в спектрофотометре на длине волны 600 нанометров.Прививка 50 мл среды с ночной культуры до OD 600 из 05. Кроме того, поместите колбы в детекторах при 28 градусах по Цельсию, 130 об/мин и 80% влажности в течение пяти минут. Нажмите кнопку начать измерение в программном обеспечении.Через четыре часа после прививки используйте образец 2 мл для измерения плотности клеток, как это было продемонстрировано. Когда концентрация кислорода приближается к нулю и клетки находятся на экспоненциальной фазе роста добавить четыре глицерола корма дисков для каждой колбы в стерильных условиях. Чем, вернуть колбы в трясусь инкубатор в течение дополнительных 60 до 90 часов.Возьмите образцы каждые 24 часа, чтобы контролировать плотность клеток и экспрессию белка по анализу выбора. В конце культивирования перенесите культуры в 50 мл конических трубок для центрифугации. Экспорт данных онлайн-измерений в качестве файла электронной таблицы из программного обеспечения для дальнейшего анализа.В этом репрезентативном культивировании начальная концентрация глицерола составила 5%, хотя кормовые диски были добавлены, когда биомасса увеличивается в геометрической прогрессии, кислород снизился почти до нуля. Более низкие концентрации глицерола уменьшили влияние краткосрочных ограничений кислорода и поэтому рекомендуются для де-репрессированного экспрессии белка. В этом репрезентативном эксперименте, в котором гормон роста человека был выражен под контролем источника углерода репрессированных промоутер при истощении глицерола выражение белка путем де-репрессии было обеспечено добавлением четырех дисков корма на колбу.Как и ожидалось, экспрессия гормона роста человека и развитие биомассы увеличились с течением времени в присутствии дисков глицерола корма, в то время как экспрессия белка уменьшилась с течением времени и биомасса оставалась постоянной при отсутствии глицерола дополнения. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы тщательно наблюдать параметры выращивания, чтобы определить оптимальное время начала выражения. После этой процедуры другие методы, такие как определение концентрации белка западного анализа помарки или анализа активности могут быть выполнены для оценки урожайности белка, а также мелкомасштабных экспериментов биореактора, чтобы ответить на дополнительные вопросы о производительности индивидуальной нагрузки в более широком масштабе.После его развития, этот метод проложил путь для исследователей в области метанола свободного рекомбинантного выражения белка, чтобы исследовать перспективную альтернативу широко используемому метанолу зависимого промоутера AOX1 на Pichia pastoris.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Биомолекулярных Обнаружение использованием интерферометрических датчиков изображения отражения (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Lensfree On-чип томографический микроскопии Используя Multi-угол освещения и Pixel супер-разрешение

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

The Portable Chemical Sterilizer (PCS), D-FENS, and D-FEND ALL: Novel Chlorine Dioxide Decontamination Technologies for the Military

The Portable Chemical Sterilizer PCS, D-FENS, and D-FEND ALL: Novel Chlorine Dioxide Decontamination Technologies for the Military

Портативный химический стерилизатор (PCS), D-болота, и D-Fend ВСЕ: Роман диоксида хлора Обеззараживание технологии для военных

There is a stated Army need for a field-portable, non-steam sterilizer technology that can be used by Forward Surgical Teams, Dental Companies, Veterinary ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Измерение Ослабление натяжения в процессе лазерного поражения Индуцированные Axon для оценки аксонов адгезию к основанию и Piconewton в миллисекундах

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

Изучение белка функции и роль Altered экспрессии белка с помощью интерференции антител и трехмерных реконструкций

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

Rapid Mix Preparation of Bioinspired Nanoscale Hydroxyapatite for Biomedical Applications

Rapid Mix Приготовление биоинспирированных наноразмерных гидроксилапатита для биомедицинских применений

Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a medical ceramic due to its good biocompatibility and osteoconductivity. Recently there has been interest ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Обнаружения эндотоксинов в нано составов с помощью анализов Lysate (Лал) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Долговечный чтения последовательности для анализа всей геномной ДНК

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Высокопроходичная идентификация сопротивления Pseudomonas syringae pv. Помидор в томате с использованием рассеять рассаду наводнение

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Employing Aeroponic Systems for the Clonal Propagation of Cannabis

Использование аэропонных систем для клонального распространения каннабиса

This protocol describes the standardization of an efficient clonal propagation technique of hemp by utilizing aeroponic systems. Primary shoot cuttings ...