Name: huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis
Uploaded: 2019-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis at JoVE.com

Dette arbejde er blevet finansieret af Fondi di Ateneo til Luca Colucci-D'Amato og VALERE program midler til Maria Teresa Gentile og AIRC fund IG18999 til Maurizio Bifulco.

1. RGWE-forberedelse
<ol><li>Saml R. olens blade fra planter i løbet af foråret/sommermånederne under tilsyn af en botaniker. Bemærk: I dette tilfælde blev bladene indsamlet på den eksperimentelle del af medicinske planter i botanisk have i Napoli, Italien5. Planten er spontan, flerårig og er til stede i Middelhavsområderne (figur 1).</li>
	<li>Vejer 250 g blade og hak dem fint med en saks.</li>
	<li>Læg bladene i en konisk kolb...

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li><li>Ferrara, N., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+as+a+therapeutic+target.">Angiogenesis as a therapeutic target.</a> Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).</li><li>Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids+as+prospective+compounds+for+anti-cancer+therapy.">Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).</li><li>Gentile, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruta+graveolens+water+extract+inhibits+cell-cell+network+formation+in+human+umbilical+endothelial+cells+via+MEK-ERK1/2+pathway.">Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway.</a> Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).</li><li>Butler, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+to+drugs:+natural+product-derived+compounds+in+clinical+trials.">Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials.</a> Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).</li><li>Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+product+inhibitors+of+ocular+angiogenesis.">Natural product inhibitors of ocular angiogenesis.</a> Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Trung, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+angiogenesis.">In vitro models for angiogenesis.</a> Journal of Science &amp; Development. 13 (4), 850-858 (2015).</li><li>Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Angiogenesis.">In vitro Models of Angiogenesis.</a> World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).</li><li>Simons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Heart+Association+Council+on+Basic+Cardiovascular+Sciences+and+Council+on+Cardiovascular+Surgery+and+Anaesthesia.+State-of-the-Art+Methods+for+Evaluation+of+Angiogenesis+and+Tissue+Vascularisation:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).</li><li>DeCicco-Skinner, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+tube+formation+assay+for+the+in+vitro+study+of+angiogenesis.">Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).</li></ol>

Naturlige forbindelser er karakteriseret ved en høj kemisk diversitet og biokemisk specificitet og repræsenterer en kilde til potentielt terapeutiske molekyler. Her viser vi hvordan man kan få vand ekstrakt fra planten R. olens og foreslå tube formation assay som en let at udføre, pålidelig og kvantitativ metode nyttig til at undersøge rgwe virkninger på angiogenese. Det er vigtigt at koge R. olens blade for 1 h at være sikker på at opnå den komplette vand ekstrakt. Kogning for mindre end 1 t...

Angiogenese er en fysiologisk proces, der fører til dannelsen af nye blodkar fra allerede eksisterende og opstår under embryogenese og organ vækst. I voksenalderen, angiogenese aktiveres kun i cykling æggestokkene, i placenta under graviditet, og under sårheling og reparation. Angiogenese afhænger af evnen af endotelceller til at formere, differentiere og migrere til dannelse af et intakt vaskulære netværk1. Men, i flere lidelser, såsom inflammatoriske, metaboliske, og reumatiske sygdomme, angiogen processer er ændret og angiogenese bliver overdreven. Desuden, ukontrollerede angiogen processer stimulerer også tumorprogression og metastase1. Af disse grunde, i det sidste årti, forskningsundersøgelser er fokuseret på udviklingen af nye terapeutiske strategier rettet mod hæmning af overdreven angiogenese i kræft, okulære, fælles, eller hudlidelser2,3.
Vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) repræsenterer det vigtigste mål for nuværende antiangiogeniske terapier4, og flere anti-VEGF monoklonale antistoffer er blevet udviklet og syntetiseret for at forhindre overdreven angiogenese. Men, disse syntetiske stoffer viser alvorlige bivirkninger og har en ugunstig cost-to-benefit-forhold5,6. Derfor, det er bydende nødvendigt at finde nye terapeutiske strategier til at begrænse overdreven angiogenese med minimale bivirkninger til at supplere og kombinere med aktuelt anvendte stoffer. Disse nye lægemidler kan findes blandt naturlige produkter, der er karakteriseret ved en høj kemisk diversitet og biokemiske specificitet.
I denne artikel foreslår vi en simpel metode til at evaluere virkningen af RGWE på evnen af HUVECs at danne tubuler på en Gerede kælder matrix in vitro5. Faktisk er RGWE en blanding af sekundære metabolitter såsom flavonoider og polyphenoler, blandt hvilke rutin er den vigtigste komponent5. Mange af dem er allerede blevet testet som anti-inflammatoriske og vasoprottive agenter7,8,9,10,11. Desuden har vi for nylig demonstreret, at RGWE, men ikke rutin, er i stand til at hæmme HUVEC evne til at danne tubuler på en Gerede kælder matrix, og at dette fænomen er medieret af MEK-ERK pathway, hvilket indikerer RGWE som et potentielt terapeutisk værktøj i stand til at undgå overdreven ny dannelse af blodkar5.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HUVEC cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>C2519A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>cc3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single quot kit- supplemets and growth factors</td>
			<td>clontech</td>
			<td>cc4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20-200 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70,760,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Fortuna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blu stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mill-ex 0.22 um filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>VirTis-SP Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>AirCos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>v79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine-2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rutin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5143-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 25 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmScope MD500 camera</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>D4818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab heater</td>
			<td>Falc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ParaFilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis

Angiogenesis er et fænomen, der omfatter forskellige processer, såsom endotelcelleproliferation, differentiering og migration, der fører til dannelsen af nye blodkar og involverer flere signal transduktionsveje. Her viser vi, at røret formation assay er en simpel in vitro -metode til at evaluere virkningen af naturlige produkter på angiogenese og til at undersøge de molekylære mekanismer involveret. I nærværelse af vand ekstrakten fra Ruta olens (rgwe) er endotelceller ikke længere i stand til at danne et celle celle netværk, og at rgwe-effekten på den humane navle formede vene endotelcelle (HUVEC)-rørdannelse afskaffes ved konstitutiv aktivering af MEK.

For at evaluere indflydelsen af RGWE på angiogenesis, vi gennemført en tube formation assay på en geleret kælder matrix. Når de dyrkes på det, danner HUVECs rørlignende strukturer, der stammer fra celler, der vises aflange, og som forbinder hinanden for at danne et celle celle netværk (figur 2). I figur 3viser vi, at antallet af filialer i HUVECs, der blev behandlet med rgwe, var betydeligt lavere sammenlignet med kontrol...

Watch this Scientific Journal Video about HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis at JoVE.com

HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

HUVEC tube-formation assay til at evaluere virkningen af naturlige produkter på angiogenese

Her evaluerer vi virkningerne af vand ekstraktet af Ruta olens på skibets netværksdannelse ved hjælp af en rørdannelses analyse på en geleret kælder matrix.

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

Tube-formation Assay er en in vitro-test for at studere de molekylære mekanismer, der ligger til grund for flere trin, der fører til dannelsen af nye blodkar. Denne analyse gør det muligt at identificere forbindelser og signalering kaskader forbundet med angiogenese. Med en test, vi er i stand til at vise, at en naturlig forbindelse som RGWE reducerer muligheden for endotelceller til at danne rør-lignende struktur, påvirker ikke celle levedygtighed, og at denne effekt afhænger af aktivering af MEK / ERK vej. Det er vigtigt at udføre testen med det rigtige antal celler. Faktisk kunne for få eller for mange celler ikke tillade den rigtige dannelse af rør. Af denne grund er det tilrådeligt at udføre en indledende test for at finde ud af det korrekte antal af cellerne. Luca Olga Pastorino, ph.d.-studerende i mit laboratorium, vil vise procedurerne. Først skal du indsamle Ruta graveolens blade i løbet af foråret og sommermånederne. Sæt 250 gram hakkede blade i en konisk kolbe, og tilsæt en liter destilleret vand, kog og filter, som beskrevet i manuskriptet. Den næste dag, bruge en lyophilizer at lyophilize bladet ekstrakt. Efter at have fået pulveret, vejer det, og opdele det i aliquots. Kultur HUVECs i endotel celle vækstmedium, i henhold til tekstprotokollen. Når cellerne når 80%sammenløb, passage cellerne i et forhold på en til tre. Brug de celler, der er opnået mellem passage to og passage fem. Når de passagede HUVECs nå 70%sammenløb, transvect dem med et mikrogram af vektoren indeholder genet af interesse.Kombiner et mikrogram DNA med tre mikroliter af fortyndet Lipofectamin 2000.Then fjerne mediet fra HUVECs, og erstatte det med en milliliter frisk komplet medium. Tilsæt transvecting opløsning til cellerne, og inkubere cellerne ved 37 grader Celsius, og fem procent kuldioxid. Tre timer efter transvection tilsættes syv milliliter frisk komplet medium, og inkubere cellerne i yderligere 24 til 48 timer. Umiddelbart før kælderen forberedelse, sætte en forkølet, 96-brønd plade på is, og tilsæt 50-mikroliter af kold matrix til hver brønd. Mens pladen inkuberer, vaskes HUVECs med en milliliter PBS/EDTA-opløsning. Derefter tilsættes en milliliter Trypsin-EDTA opløsning til cellerne, og inkubere i fem minutter ved 37 grader Celsius.Saml mediet, der indeholder de suspenderede celler, og høst cellerne via centrifugering. Derefter resuspenderede cellerne i en milliliter PBS. Overfør 0,2 milliliter af cellesuspensionen til 0,5 milliliter PBS med trypanblå opløsning. Når suspensionen er holdt ved stuetemperatur i fem minutter, skal du tælle cellerne i en

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Alginat Indkapsling af pluripotente stamceller Ved hjælp af en Co-aksial dyse

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Udvikling af et<em&gt; In vitro</em&gt; Assay til Evaluer kontraktionsfunktion af mesenchvmal-celler der undergik Epithelial-Mesenchymal Overgangseffekter

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

Konkurrencedygtige Transplantationer at vurdere hæmatopoietisk stamcelletransplantation Fitness

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Akutte og kroniske modeller af hyperglykæmi i zebrafisk: En metode til vurdering af virkningen af ​​hyperglykæmi på neurogenese og biodistribution af radiomærkede molekyler

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

En 5-mC prikkeblot-analyse, der kvantificerer DNA-methyleringsniveauet for chondrocyt-differentiering<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering og kvantitativ analyse af embryonisk angiogenese i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Metoder til at analysere virkningerne af naturligt uran på In vitro- Osteoclastogenesis

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Celle sammenlægning Assays til at evaluere bindingen af Drosophila Notch med Trans-ligander og dens hæmning af Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetic analyse af Vasculogenesis kvantificerer dynamikken i Vasculogenesis og angiogenese In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

I in vitro-Assays at evaluere Migration, Invasion og spredning af udødeliggjort menneskers første trimester trofoblast cellelinjer

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...