Name: huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis
Uploaded: 2019-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door Fondi di Ateneo aan Luca Colucci-D'Amato en VALERE Program funds aan Maria Teresa Gentile en AIRC Fund IG18999 aan Maurizio Bifulco.

1. RGWE voorbereiding
<ol><li>Verzamel R. graveolens bladeren van planten tijdens de lente/zomermaanden onder toezicht van een botanicus. Opmerking: In dit geval werden de bladeren verzameld in de experimentele sectie van medicinale planten in de botanische tuin van Napels, Italië5. De plant is spontaan, blijvend en is aanwezig in de mediterrane regio's (Figuur 1).</li>
	<li>Weeg 250 g bladeren af en hak ze fijn met een schaar.</li>
	<l...

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li><li>Ferrara, N., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+as+a+therapeutic+target.">Angiogenesis as a therapeutic target.</a> Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).</li><li>Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids+as+prospective+compounds+for+anti-cancer+therapy.">Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).</li><li>Gentile, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruta+graveolens+water+extract+inhibits+cell-cell+network+formation+in+human+umbilical+endothelial+cells+via+MEK-ERK1/2+pathway.">Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway.</a> Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).</li><li>Butler, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+to+drugs:+natural+product-derived+compounds+in+clinical+trials.">Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials.</a> Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).</li><li>Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+product+inhibitors+of+ocular+angiogenesis.">Natural product inhibitors of ocular angiogenesis.</a> Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Trung, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+angiogenesis.">In vitro models for angiogenesis.</a> Journal of Science &amp; Development. 13 (4), 850-858 (2015).</li><li>Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Angiogenesis.">In vitro Models of Angiogenesis.</a> World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).</li><li>Simons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Heart+Association+Council+on+Basic+Cardiovascular+Sciences+and+Council+on+Cardiovascular+Surgery+and+Anaesthesia.+State-of-the-Art+Methods+for+Evaluation+of+Angiogenesis+and+Tissue+Vascularisation:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).</li><li>DeCicco-Skinner, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+tube+formation+assay+for+the+in+vitro+study+of+angiogenesis.">Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).</li></ol>

Natuurlijke verbindingen worden gekenmerkt door een hoge chemische diversiteit en biochemische specificiteit en vertegenwoordigen een bron van potentieel therapeutische moleculen. Hier laten we zien hoe we water extract van de plant R. graveolens kunnen verkrijgen en de buis vormings test voorstellen als een eenvoudig te vervullen, betrouwbare en kwantitatieve methode die nuttig is om de effecten van rgwe op angiogenese te onderzoeken. Het is belangrijk om de R. graveolens bladeren te koken voor 1 uur o...

Angiogenese is een fysiologisch proces dat leidt tot de vorming van nieuwe bloedvaten van bestaande en treedt op tijdens embryogenese en orgel groei. In de volwassenheid wordt angiogenese alleen geactiveerd in de fiets-eierstok, in de placenta tijdens de zwangerschap en tijdens wondgenezing en-herstel. Angiogenese is afhankelijk van het vermogen van endotheel cellen om te vermenigvuldigen, te differentiëren en migreren naar een intact vasculaire netwerk vormen1. Echter, in verschillende aandoeningen, zoals inflammatoire, metabole, en reumatische aandoeningen, angiogene processen worden gewijzigd en angiogenese wordt overmatig. Bovendien stimuleren ongecontroleerde angiogene processen ook de progressie van de tumor en metastasen1. Om deze redenen, in de afgelopen tien jaar, onderzoeken zijn gericht op de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën gericht op de remming van overmatige angiogenese in Cancer, oculaire, gewricht, of huidaandoeningen2,3.
Vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) vertegenwoordigt het belangrijkste doelwit van huidige antiangiogenic therapieën4, en verschillende anti-VEGF monoklonale antilichamen zijn ontwikkeld en gesynthetiseerd om overmatige angiogenese te voorkomen. Echter, deze synthetische drugs vertonen ernstige bijwerkingen en hebben een ongunstige kosten/batenverhouding5,6. Daarom is het noodzakelijk om nieuwe therapeutische strategieën te vinden om buitensporige angiogenese met minimale bijwerkingen te vullen en te combineren met momenteel gebruikte drugs. Deze nieuwe geneesmiddelen kunnen worden gevonden onder natuurlijke producten die worden gekenmerkt door een hoge chemische diversiteit en biochemische specificiteit.
In dit artikel stellen we een eenvoudige methode voor om de impact van de rgwe te evalueren op het vermogen van huvecs om tubuli te vormen op een opgestijfde-kelder matrix in vitro5. Inderdaad, RGWE is een mengsel van secundaire metabolieten zoals flavonoïden en polyfenolen, waaronder rutine is de belangrijkste component5. Velen van hen zijn al getest als anti-inflammatoire en vasoprotective agenten7,8,9,10,11. Bovendien hebben we onlangs aangetoond dat rgwe, maar niet rutin, in staat is om het huvec-vermogen te remmen om tubuli te vormen op een opgestijfde-kelder matrix en dat dit fenomeen wordt gemedieerd door de MEK-ERK-route, wat rgwe aangeeft als een potentieel therapeutisch instrument dat in staat is om Voorkom overmatige nieuwe bloedvat vorming5.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HUVEC cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>C2519A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>cc3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single quot kit- supplemets and growth factors</td>
			<td>clontech</td>
			<td>cc4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20-200 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70,760,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Fortuna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blu stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mill-ex 0.22 um filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>VirTis-SP Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>AirCos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>v79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine-2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rutin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5143-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 25 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmScope MD500 camera</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>D4818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab heater</td>
			<td>Falc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ParaFilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis

Angiogenese is een fenomeen dat verschillende processen omvat, zoals de proliferatie van endotheliale cellen, differentiatie en migratie, die leiden tot de vorming van nieuwe bloedvaten en betrekking hebben op verschillende signaaltransductie trajecten. Hier tonen we aan dat de buis vormings test een eenvoudige in vitro methode is om de impact van natuurlijke producten op angiogenese te evalueren en om de betrokken moleculaire mechanismen te onderzoeken. In het bijzonder, in de aanwezigheid van het water extract van Ruta graveolens (rgwe), zijn endotheelcellen niet langer in staat om een cel-celnetwerk te vormen en dat de rgwe-effecten op menselijke navelstreng ader endotheliale cel (huvec) buis vorming wordt afgeschaft door de constitutieve activering van MEK.

Om de invloed van rgwe op angiogenese te evalueren, hebben we een buis vormings test uitgevoerd op een opgestijfde-kelder matrix. Bij het kweken op het, HUVECs vormen buis-achtige structuren die afkomstig zijn van cellen die langwerpig lijken en die elkaar verbinden om een cel-celnetwerk te vormen (Figuur 2). In Figuur 3tonen we aan dat het aantal vertakkingen in HUVECs die behandeld werden met rgwe significant lager was in verge...

Watch this Scientific Journal Video about HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis at JoVE.com

HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

HUVEC-buis-formatie test om de impact van natuurlijke producten op angiogenese te evalueren

Hier evalueren we de effecten van het water extract van Ruta graveolens op de vorming van een vat netwerk door gebruik te maken van een buis vormings test op een opgestijfde kelder matrix.

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

Buisvorming Assay is een in vitro test om de moleculaire mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan verschillende stappen die leiden tot de vorming van nieuwe bloedvaten. Deze test maakt het mogelijk om verbindingen en signalering cascades in verband met angiogenese te identificeren. Met één test kunnen we aantonen dat een natuurlijke verbinding als RGWE het vermogen van endotheelcellen vermindert om buisachtige structuur te vormen, de levensvatbaarheid van de cel niet beïnvloedt en dat dit effect afhangt van de activering van het MEK/ERK-traject. Het is belangrijk om de test uit te voeren met het juiste aantal cellen. In feite konden te weinig of te veel cellen de juiste vorming van buizen niet toestaan. Om deze reden is het raadzaam om een voorlopige test uit te voeren om het juiste aantal cellen te achterhalen. Luca Olga Pastorino, promovendus in mijn lab, zal de procedures laten zien. Verzamel eerst Ruta graveolens bladeren tijdens de lente en de zomermaanden. Doe 250 gram gehakte bladeren in een conische kolf en voeg een liter gedestilleerd water, kook en filter toe, zoals beschreven in het manuscript. De volgende dag, gebruik een lyophilizer om het bladextract lyophilize. Na het verkrijgen van het poeder, wegen, en verdeel het in aliquots. Cultuur de HUVECs in endotheelcel groeimedium, volgens het tekstprotocol. Wanneer de cellen 80% samenvloeiing bereiken, doorsnee de cellen met een verhouding van één tot drie. Gebruik de cellen verkregen tussen passage twee en passage vijf. Zodra de doorgang HUVECs bereiken 70%confluency, transvect ze met een microgram van de vector met het gen van belang.Combineer een microgram DNA met drie microliters van verdunde Lipofectamine 2000.Then, verwijder het medium uit de HUVECs, en vervang het door een milliliter van vers compleet medium. Voeg de transvecting oplossing aan de cellen, en incubeer de cellen op 37 graden Celsius, en vijf procent kooldioxide. Drie uur na de overslag, voeg zeven milliliter vers compleet medium, en incubeer de cellen voor een extra 24 tot 48 uur. Onmiddellijk voor de voorbereiding van de kelder, zet een voorgekoelde, 96-put plaat op ijs, en voeg 50-microliter koude matrix aan elke put. Terwijl de plaat uitbroedt, was de HUVECs met een milliliter PBS / EDTA oplossing. Voeg vervolgens een milliliter Trypsin-EDTA-oplossing toe aan de cellen en broed gedurende vijf minuten uit op 37 graden Celsius.Verzamel het medium met de zwevende cellen en oogst de cellen via centrifugatie. Vervolgens, resuspend de cellen in een milliliter pbs. Breng 0,2 milliliter van de celsuspensie over naar 0,5 milliliter PBS met trypanblauwe oplossing. Nadat u de suspensie vijf minuten op kamertemperatuur hebt gehouden, telt u de cellen in een B

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Alginaat inkapseling van pluripotente stamcellen Met behulp van een co-axiale Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Ontwikkeling van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay om contractiele functie van mesenchymale Cellen die Onderging-mesenchymale transitie Evalueer

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

Concurrerende Transplantaties om hematopoietische stamcellen Fitness Evalueer

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Acute en chronische modellen van hyperglycemie bij zebravis: een methode om de impact van hyperglycemie op neurogenese te beoordelen en de biodistributie van radiolabelde moleculen

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

Een 5-m-dot-blot-analyse die het DNA-methyleringsniveau van chondrocytedifferentiatie quantificeert<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Methoden voor het analyseren van de gevolgen van natuurlijk Uranium op In Vitro Osteoclastogenesis

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cel aggregatie testen om te evalueren van de Binding van de Drosophila inkeping met Trans-liganden en haar remming door Cis-liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetische analyse van vasculogenese kwantificeert dynamiek van Vasculogenese en angiogenese In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

In Vitro testen om te evalueren van de migratie, invasie en proliferatie van vereeuwigd menselijke eerste-trimester Trophoblast cellijnen

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...