Name: huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis
Uploaded: 2019-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis at JoVE.com

Ces travaux ont été financés par Fondi di Ateneo à Luca Colucci-D'Amato et les fonds du programme VALERE à Maria Teresa Gentile et le fonds AIRC IG18999 à Maurizio Bifulco.

1. Préparation RGWE
<ol><li>Recueillir les feuilles de R. graveolens des plantes pendant les mois de printemps/été sous la supervision d'un botaniste. REMARQUE: Dans ce cas, les feuilles ont été recueillies à la Section expérimentale des plantes médicinales dans le Jardin botanique de Naples, Italie5. La plante est spontanée, vivace et est présente dans les régions méditerranéennes (figure 1).</li>
	<li>Peser 250 g de feuill...

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li><li>Ferrara, N., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+as+a+therapeutic+target.">Angiogenesis as a therapeutic target.</a> Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).</li><li>Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids+as+prospective+compounds+for+anti-cancer+therapy.">Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).</li><li>Gentile, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruta+graveolens+water+extract+inhibits+cell-cell+network+formation+in+human+umbilical+endothelial+cells+via+MEK-ERK1/2+pathway.">Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway.</a> Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).</li><li>Butler, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+to+drugs:+natural+product-derived+compounds+in+clinical+trials.">Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials.</a> Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).</li><li>Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+product+inhibitors+of+ocular+angiogenesis.">Natural product inhibitors of ocular angiogenesis.</a> Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Trung, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+angiogenesis.">In vitro models for angiogenesis.</a> Journal of Science &amp; Development. 13 (4), 850-858 (2015).</li><li>Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Angiogenesis.">In vitro Models of Angiogenesis.</a> World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).</li><li>Simons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Heart+Association+Council+on+Basic+Cardiovascular+Sciences+and+Council+on+Cardiovascular+Surgery+and+Anaesthesia.+State-of-the-Art+Methods+for+Evaluation+of+Angiogenesis+and+Tissue+Vascularisation:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).</li><li>DeCicco-Skinner, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+tube+formation+assay+for+the+in+vitro+study+of+angiogenesis.">Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).</li></ol>

Les composés naturels sont caractérisés par une grande diversité chimique et spécificité biochimique et représentent une source de molécules potentiellement thérapeutiques. Ici, nous montrons comment obtenir l'extrait d'eau de la plante R. graveolens et proposons l'essai de formation de tube comme méthode facile à exécuter, fiable, et quantitative utile pour étudier les effets de RGWE sur l'angiogenèse. Il est important de faire bouillir les feuilles de R. graveolens pendant 1 h pour être...

L'angiogenèse est un processus physiologique qui conduit à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de ceux préexistants et se produit pendant l'embryogenèse et la croissance des organes. À l'âge adulte, l'angiogenèse n'est activée que dans l'ovaire cycliste, dans le placenta pendant la grossesse, et pendant la cicatrisation et la réparation des plaies. L'angiogenèse dépend de la capacité des cellules endothéliales à proliférer, différencier et migrer pour former un réseau vasculaire intact1. Cependant, dans plusieurs désordres, tels que les maladies inflammatoires, métaboliques, et rhumatismales, les processus angiogéniques sont modifiés et l'angiogenèse devient excessive. En outre, les processus angiogéniques incontrôlés stimulent également la progression de tumeur et la métastasie1. Pour ces raisons, au cours de la dernière décennie, les études de recherche sont axées sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à l'inhibition de l'angiogenèse excessive dans le cancer, oculaire, articulaire, ou les troubles de la peau2,3.
Le facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) représente lacible principale des thérapies antiangiogenic actuelles 4, et plusieurs anticorps monoclonaux anti-VEGF ont été développés et synthétisés pour empêcher l'angiogenèse excessive. Cependant, ces drogues synthétiques montrent des effets secondaires graves et ont un rapport coût-bénéfice défavorable5,6. Par conséquent, il est impératif de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques pour limiter l'angiogenèse excessive avec des effets secondaires minimes pour compléter et combiner avec les médicaments actuellement utilisés. Ces nouveaux médicaments peuvent être trouvés parmi les produits naturels qui sont caractérisés par une grande diversité chimique et la spécificité biochimique.
Dans cet article, nous proposons une méthode simple pour évaluer l'impact de la RGWE sur la capacité des HUVECs à former des tubules sur une matrice de sous-sol gélifiée in vitro5. En effet, RGWE est un mélange de métabolites secondaires tels que les flavonoïdes et les polyphénols parmi lesquels la rutine est la principale composante5. Beaucoup d'entre eux ont déjà été testés comme agents anti-inflammatoires et vasoprotecteurs7,8,9,10,11. En outre, nous avons récemment démontré que RGWE, mais pas rutin, est capable d'inhiber la capacité HUVEC de former des tubules sur une matrice de sous-sol gélifiéet et que ce phénomène est médié par la voie MEK-ERK, indiquant RGWE comme un outil thérapeutique potentiel capable de prévenir la formation excessive de nouveaux vaisseaux sanguins5.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HUVEC cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>C2519A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>cc3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single quot kit- supplemets and growth factors</td>
			<td>clontech</td>
			<td>cc4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20-200 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70,760,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Fortuna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blu stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mill-ex 0.22 um filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>VirTis-SP Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>AirCos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>v79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine-2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rutin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5143-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 25 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmScope MD500 camera</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>D4818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab heater</td>
			<td>Falc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ParaFilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis

L'angiogenèse est un phénomène qui comprend différents processus, tels que la prolifération des cellules endothéliales, la différenciation et la migration, qui conduisent à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et impliquent plusieurs voies de transduction du signal. Ici, nous montrons que l'essai de formation de tube est une méthode in vitro simple pour évaluer l'impact des produits naturels sur l'angiogenèse et pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués. En particulier, en présence de l'extrait d'eau de Ruta graveolens (RGWE), les cellules endothéliales ne sont plus en mesure de former un réseau cellulaire et que les effets RGWE sur la formation de tubes de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) sont abolis par le l'activation constitutive de MEK.

Pour évaluer l'influence de RGWE sur l'angiogenèse, nous avons effectué un essai de formation de tube sur une matrice gélifiée de sous-sol. Lorsqu'ils sont cultivés sur elle, huVECs forment des structures tubulaires qui proviennent de cellules qui semblent allongées et qui se connectent les uns les autres pour former un réseau cellulaire -cellule (Figure 2). Dans la figure 3, nous montrons que le nombre de branches dans l...

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HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

HuVEC Tube-formation D'essai pour évaluer l'impact des produits naturels sur l'angiogenèse

Ici, nous évaluons les effets de l'extrait d'eau de Ruta graveolens sur la formation du réseau de navires en utilisant un essai de formation de tube sur une matrice de sous-sol gélifiée.

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

Tube-formation Assay est un test in vitro pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à plusieurs étapes qui conduisent à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins. Cet essai permet d’identifier les composés et les cascades de signalisation associés à l’angiogenèse. Avec un seul test, nous sommes en mesure de montrer qu’un composé naturel comme RGWE réduit la capacité des cellules endothéliales à former une structure tube-like, n’affectent pas la viabilité cellulaire, et que cet effet dépend de l’activation de la voie MEK / ERK. Il est important d’effectuer le test avec le bon nombre de cellules. En fait, trop peu ou trop de cellules ne pouvaient pas permettre la bonne formation de tubes. Pour cette raison, il est conseillé d’effectuer un test préliminaire pour savoir le bon nombre de cellules. Luca Olga Pastorino, doctorant dans mon laboratoire, montrera les procédures. Tout d’abord, recueillir les feuilles de Ruta graveolens pendant les mois de printemps et d’été. Mettre 250 grammes de feuilles hachées dans un flacon conique, et ajouter un litre d’eau distillée, faire bouillir et filtrer, tel que décrit dans le manuscrit. Le lendemain, utilisez un lyophilisateur pour lyophiliser l’extrait de feuille. Après avoir obtenu la poudre, pesez-la et divisez-la en aliquots. Culture des HUVECs dans le milieu de croissance des cellules endothéliales, selon le protocole de texte. Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence, passer les cellules à un rapport de un à trois. Utilisez les cellules obtenues entre le passage deux et le passage cinq. Une fois que les HUVECs passages atteignent 70% confluency, les transvectent avec un microgramme du vecteur contenant le gène d’intérêt.Combinez un microgramme d’ADN avec trois microlitres de Lipofectamine diluée 2000.Then, retirez le milieu des HUVECs, et remplacez-le par un millilitre de milieu complet frais. Ajoutez la solution transvecting aux cellules, et incuber les cellules à 37 degrés Celsius, et cinq pour cent de dioxyde de carbone. Trois heures après la transvection, ajouter sept millilitres de milieu complet frais et incuber les cellules pendant 24 à 48 heures supplémentaires. Immédiatement avant la préparation du sous-sol, mettre une plaque pré-réfrigérée de 96 puits sur la glace et ajouter 50 microlitres de matrice froide à chaque puits. Pendant que la plaque couve, lavez les HUVECs avec un millilitre de solution PBS/EDTA. Ensuite, ajouter un millilitre de trypsine-EDTA solution aux cellules, et incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.Recueillir le milieu contenant les cellules suspendues, et récolter les cellules par centrifugation. Ensuite, resuspendez les cellules en un millilitre de PBS. Transférer 0,2 millilitres de la suspension cellulaire à 0,5 millilitres de PBS avec la solution bleu trypan. Après avoir tenu la suspension à température ambiante pendant cinq minutes, comptez les cellules dans un

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