Name: huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis
Uploaded: 2019-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von Fondi di Ateneo an Luca Colucci-D'Amato und VALERE Programmfonds an Maria Teresa Gentile und AIRC Fonds IG18999 an Maurizio Bifulco finanziert.

1. RGWE Vorbereitung
<ol><li>Sammeln Sie R. graveolens Blätter von Pflanzen während der Frühlings-/Sommermonate unter der Aufsicht eines Botanikers. HINWEIS: In diesem Fall wurden Die Blätter in der Experimentellen Abteilung für Heilpflanzen im Botanischen Garten von Neapel, Italien5gesammelt. Die Pflanze ist spontan, mehrjährige, und ist in den Mittelmeerregionen vorhanden (Abbildung 1).</li>
	<li>250 g Blätter wiegen und mit ein...

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li><li>Ferrara, N., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+as+a+therapeutic+target.">Angiogenesis as a therapeutic target.</a> Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).</li><li>Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids+as+prospective+compounds+for+anti-cancer+therapy.">Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).</li><li>Gentile, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruta+graveolens+water+extract+inhibits+cell-cell+network+formation+in+human+umbilical+endothelial+cells+via+MEK-ERK1/2+pathway.">Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway.</a> Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).</li><li>Butler, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+to+drugs:+natural+product-derived+compounds+in+clinical+trials.">Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials.</a> Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).</li><li>Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+product+inhibitors+of+ocular+angiogenesis.">Natural product inhibitors of ocular angiogenesis.</a> Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Trung, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+angiogenesis.">In vitro models for angiogenesis.</a> Journal of Science &amp; Development. 13 (4), 850-858 (2015).</li><li>Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Angiogenesis.">In vitro Models of Angiogenesis.</a> World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).</li><li>Simons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Heart+Association+Council+on+Basic+Cardiovascular+Sciences+and+Council+on+Cardiovascular+Surgery+and+Anaesthesia.+State-of-the-Art+Methods+for+Evaluation+of+Angiogenesis+and+Tissue+Vascularisation:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).</li><li>DeCicco-Skinner, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+tube+formation+assay+for+the+in+vitro+study+of+angiogenesis.">Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).</li></ol>

Natürliche Verbindungen zeichnen sich durch eine hohe chemische Vielfalt und biochemische Spezifität aus und stellen eine Quelle potenziell therapeutischer Moleküle dar. Hier zeigen wir, wie man Wasserextrakt aus der Pflanze R. graveolens erhält und schlagen den Rohrbildungstest als einfach durchzuführende, zuverlässige und quantitative Methode vor, die nützlich ist, um die Auswirkungen von RGWE auf die Angiogenese zu untersuchen. Es ist wichtig, die R. graveolens Blätter für 1 h zu kochen, um ...

Angiogenese ist ein physiologischer Prozess, der zur Bildung neuer Blutgefäße aus bereits bestehenden führt und während der Embryogenese und des Organwachstums auftritt. Im Erwachsenenalter wird die Angiogenese nur im Radfahren des Eierstocks, in der Plazenta während der Schwangerschaft und während der Wundheilung und -reparatur aktiviert. Die Angiogenese hängt von der Fähigkeit der Endothelzellen ab, sich zu vermehren, zu differenzieren und zu einem intakten Gefäßnetz zu migrieren1. Bei mehreren Erkrankungen, wie entzündlichen, metabolischen und rheumatischen Erkrankungen, werden angiogene Prozesse jedoch verändert und die Angiogenese wird exzessiv. Darüber hinaus stimulieren unkontrollierte angiogene Prozesse auch die Tumorprogression und Metastasierung1. Aus diesen Gründen konzentrieren sich die Forschungsstudien in den letzten zehn Jahren auf die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Hemmung übermäßiger Angiogenese bei Krebs-, Augen-, Gelenk- oder Hauterkrankungen2,3.
Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) stellt das Hauptziel der aktuellen antiangiogenen Therapien4dar, und mehrere monoklonale Antikörper gegen VEGF wurden entwickelt und synthetisiert, um eine übermäßige Angiogenese zu verhindern. Jedoch, Diese synthetischen Drogen zeigen schwere Nebenwirkungen und haben ein ungünstiges Kosten-Nutzen-Verhältnis5,6. Daher ist es unerlässlich, neue therapeutische Strategien zu finden, um übermäßige Angiogenese mit minimalen Nebenwirkungen zu begrenzen, um mit derzeit verwendeten Medikamenten zu ergänzen und zu kombinieren. Diese neuen Medikamente finden sich unter natürlichen Produkten, die sich durch eine hohe chemische Vielfalt und biochemische Spezifität auszeichnen.
In diesem Artikel schlagen wir eine einfache Methode vor, um die Auswirkungen der RGWE auf die Fähigkeit von HUVECs zu bewerten, Tubuli auf einer gegelten Kellermatrix in vitro5zu bilden. In der Tat ist RGWE eine Mischung aus sekundären Metaboliten wie Flavonoiden und Polyphenolen, unter denen Rutin die Hauptkomponente ist5. Viele von ihnen wurden bereits als entzündungshemmende und vasoprotektive Mittel7,8,9,10,11getestet. Darüber hinaus haben wir vor kurzem gezeigt, dass RGWE, aber nicht Rutin, in der Lage ist, die HUVEC-Fähigkeit, Tubulen auf einer gegelten Kellermatrix zu bilden, zu hemmen und dass dieses Phänomen durch den MEK-ERK-Weg vermittelt wird, was darauf hindeutet, dass RGWE ein mögliches therapeutisches Werkzeug ist, das in der Lage ist, übermäßige Bildung neuer Blutgefäße zu verhindern5.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HUVEC cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>C2519A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>cc3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single quot kit- supplemets and growth factors</td>
			<td>clontech</td>
			<td>cc4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20-200 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70,760,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Fortuna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blu stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mill-ex 0.22 um filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>VirTis-SP Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>AirCos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>v79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine-2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rutin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5143-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 25 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmScope MD500 camera</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>D4818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab heater</td>
			<td>Falc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ParaFilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis

Angiogenese ist ein Phänomen, das verschiedene Prozesse umfasst, wie endotheliale Zellproliferation, Differenzierung und Migration, die zur Bildung neuer Blutgefäße führen und mehrere Signaltransduktionswege beinhalten. Hier zeigen wir, dass der Rohrbildungstest eine einfache In-vitro-Methode ist, um die Auswirkungen natürlicher Produkte auf die Angiogenese zu bewerten und die beteiligten molekularen Mechanismen zu untersuchen. Insbesondere sind Endothelzellen in Gegenwart des Wasserextrakts von Ruta graveolens (RGWE) nicht mehr in der Lage, ein Zellzellnetz zu bilden, und dass die RGWE-Wirkungen auf die Endothelzellbildung der menschlichen Nabelvene (HUVEC) durch die konstitutive Aktivierung von MEK.

Um den Einfluss von RGWE auf die Angiogenese zu bewerten, führten wir einen Rohrbildungstest auf eine gegelte Kellermatrix durch. Wenn sie darauf kultiviert werden, bilden HUVECs röhrenartige Strukturen, die aus Zellen stammen, die länsam erscheinen und sich zu einem Zell-Zell-Netzwerk verbinden (Abbildung 2). In Abbildung 3zeigen wir, dass die Anzahl der mit RGWE behandelten Filialen in HUVECs im Vergleich zu den Kontrollbedi...

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HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

HUVEC Tube-Formation Assay zur Bewertung der Auswirkungen natürlicher Produkte auf die Angiogenese

Hier evaluieren wir die Auswirkungen des Wasserextrakts von Ruta-Grabolen auf die Gefäßnetzbildung, indem wir einen Rohrbildungstest auf eine gegelte Kellermatrix verwenden.

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

Tube-Formation Assay ist ein In-vitro-Test, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die mehreren Schritten zugrunde liegen, die zur Bildung neuer Blutgefäße führen. Dieser Test ermöglicht es, Verbindungen und Signalkaskaden im Zusammenhang mit Angiogenese zu identifizieren. Mit einem Test können wir zeigen, dass eine natürliche Verbindung wie RGWE die Fähigkeit von Endothelzellen reduziert, röhrenartige Strukturen zu bilden, die Zelllebensfähigkeit nicht zu beeinträchtigen, und dass dieser Effekt von der Aktivierung des MEK/ERK-Signalwegs abhängt. Es ist wichtig, den Test mit der richtigen Anzahl von Zellen durchzuführen. Tatsächlich konnten zu wenige oder zu viele Zellen die richtige Bildung von Röhren nicht zulassen. Aus diesem Grund ist es ratsam, einen Vortest durchzuführen, um die richtige Anzahl der Zellen herauszufinden. Luca Olga Pastorino, Doktorand in meinem Labor, wird die Verfahren zeigen. Zuerst sammeln Ruta graveolens Blätter während der Frühlings- und Sommermonate. 250 Gramm gehackte Blätter in einen konischen Kolben geben und einen Liter destilliertes Wasser, Kochen und Filtern hinzufügen, wie im Manuskript beschrieben. Verwenden Sie am nächsten Tag einen Lyophilisator, um den Blattextrakt zu lyophilisieren. Nach Erhalt des Pulvers, wiegen Sie es, und teilen Sie es in Aliquots. Kultur die HUVECs in endotheliale Zellwachstum Medium, nach dem Textprotokoll. Wenn die Zellen 80% Konfluenz erreichen, durchdurchfahren Sie die Zellen im Verhältnis eins zu drei. Verwenden Sie die Zellen, die zwischen Durchgang zwei und Durchgang fünf erhalten wurden. Sobald die durchzogenen HUVECs 70% Konfluenz erreichen, transvect sie mit einem Mikrogramm des Vektors, der das Gen von Interesse enthält. Kombinieren Sie ein Mikrogramm DNA mit drei Mikrolitern verdünntem Lipofectamin 2000. Dann entfernen Sie das Medium aus den HUVECs und ersetzen Sie es durch einen Milliliter frisches komplettes Medium. Fügen Sie die Transvecting-Lösung zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Drei Stunden nach der Transvtion sieben Milliliter frisches komplettes Medium hinzufügen und die Zellen für weitere 24 bis 48 Stunden inkubieren. Unmittelbar vor der Kellervorbereitung eine vorgekühlte 96-Well-Platte auf Eis legen und jedem Brunnen 50 Mikroliter Kaltmatrix hinzufügen. Während die Platte inkubiert, waschen Sie die HUVECs mit einem Milliliter PBS/EDTA-Lösung. Dann fügen Sie einen Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung zu den Zellen hinzu und brüten für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Sammeln Sie das Medium, das die suspendierten Zellen enthält, und ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation. Setzen Sie dann die Zellen in einem Milliliter PBS wieder aus. 0,2 Milliliter der Zellsuspension mit Trypanblaulösung auf 0,5 Milliliter PBS übertragen. Nachdem Sie die Suspension fünf Minuten bei Raumtemperatur gehalten haben, zählen Sie die Zellen in einem B

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