Name: huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis
Uploaded: 2019-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis at JoVE.com

עבודה זו ממומנת על ידי Fondi di Ateneo כדי לוקה קולוצ-דאמאטו ו VALERE תוכניות קרנות למריה תרזה גויים ו AIRC קרן IG18999 למיאוריציו Bifulco.

1. הכנת RGWE
<ol><li>במהלך חודשי האביב/הקיץ בפיקוחו של בוטניקאי יש לאסוף את העלים מצמחים. הערה: במקרה זה, העלים נאספו בסעיף ניסיוני של צמחי מרפא בגן הבוטני של נאפולי, איטליה5. המפעל הוא ספונטני, רב שנתי, והוא נוכח באזורים הים התיכון (איור 1).</li>
	<li>שוקלים...

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li><li>Ferrara, N., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+as+a+therapeutic+target.">Angiogenesis as a therapeutic target.</a> Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).</li><li>Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids+as+prospective+compounds+for+anti-cancer+therapy.">Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).</li><li>Gentile, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruta+graveolens+water+extract+inhibits+cell-cell+network+formation+in+human+umbilical+endothelial+cells+via+MEK-ERK1/2+pathway.">Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway.</a> Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).</li><li>Butler, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+to+drugs:+natural+product-derived+compounds+in+clinical+trials.">Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials.</a> Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).</li><li>Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+product+inhibitors+of+ocular+angiogenesis.">Natural product inhibitors of ocular angiogenesis.</a> Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Trung, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+angiogenesis.">In vitro models for angiogenesis.</a> Journal of Science &amp; Development. 13 (4), 850-858 (2015).</li><li>Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Angiogenesis.">In vitro Models of Angiogenesis.</a> World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).</li><li>Simons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Heart+Association+Council+on+Basic+Cardiovascular+Sciences+and+Council+on+Cardiovascular+Surgery+and+Anaesthesia.+State-of-the-Art+Methods+for+Evaluation+of+Angiogenesis+and+Tissue+Vascularisation:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).</li><li>DeCicco-Skinner, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+tube+formation+assay+for+the+in+vitro+study+of+angiogenesis.">Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).</li></ol>

תרכובות טבעיות מתאפיינות בגיוון כימי גבוה ובחומרים ביוכימיים ומייצגים מקור למולקולות טיפוליות בפוטנציה. כאן, אנו מראים כיצד להשיג תמצית מים מהמפעל R. קברות ולהציע את שיטת היווצרות הצינור כשיטה קלה לביצוע, אמין, כמותית שימושי כדי לחקור את ההשפעות של rgwe על אנגיוגנזה. חשוב להרתיח את העל?...

אנגיוגנזה הוא תהליך פיזיולוגי המוביל להיווצרות כלי דם חדשים מקיימים ומתרחש במהלך צמיחת embryogenesis ואיברים. בבגרות, אנגיוגנזה מופעל רק בשחלה רכיבה על אופניים, השליה במהלך ההריון, במהלך ריפוי פצעים ותיקון. אנגיוגנזה תלוי ביכולת של תאי האנדותל להתרבות, להבדיל ולהגר ליצירת רשת כלי דם מלאה1. עם זאת, במספר הפרעות, כגון מחלות דלקתיות, מטבולית ושגרונית, תהליכי אנגיוגנטיים משתנים ואנגיוגנזה הופך להיות מוגזם. יתר על כן, תהליכים אנגיוגנטית מבוקרת גם לעורר התקדמות הגידול גרורות1. מסיבות אלה, בעשור האחרון, לימודי מחקר מתמקדים בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות שמטרתן עיכוב של אנגיוגנזה מוגזם בסרטן, בעינית, במפרק, או בהפרעות בעור2,3.
גורם הגדילה של כלי הדם (מהווה את המטרה העיקרית של הטיפולים הקיימים אנטי-אנגיוגנטיים4, ומספר נוגדנים אנטי-וסקולריים שפותחו ומסונתז כדי למנוע אנגיוגנזה מוגזם. עם זאת, תרופות סינתטי אלה להראות תופעות לוואי חמורות יש יחס שלילי לתועלת הרווח5,6. לכן, זה הכרחי למצוא אסטרטגיות טיפוליות חדשות כדי להגביל אנגיוגנזה מוגזם עם תופעות לוואי מינימליות כדי להשלים ולשלב עם סמים המשמשים כיום. תרופות חדשות אלה ניתן למצוא בין מוצרים טבעיים המאופיינת מגוון כימי גבוה וספציפיות הביוכימי.
במאמר זה, אנו מציעים שיטה פשוטה כדי להעריך את ההשפעה של RGWE על היכולת של HUVECs ליצור tubules על מטריצה מרתף g, מבחנה5. אכן, rgwe הוא תערובת של מטבוליטים משני כגון פלאונואידים ו פוליפנולים ביניהם רוטין הוא המרכיב העיקרי5. רבים מהם נבדקו כבר כסוכנים אנטי דלקתיים ובעלי מצבר7,8,9,10,11. יתר על כן, לאחרונה הדגמנו כי rgwe, אבל לא rutin, הוא מסוגל לעכב את היכולת huvec ליצור tubules על מטריצה מרתף g, כי תופעה זו מתווכת על ידי מסלול מק-טיפשה, המציין rgwe ככלי טיפולי פוטנציאלי מסוגל ל למנוע היווצרות כלי דם חדש מוגזמת5.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HUVEC cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>C2519A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>cc3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single quot kit- supplemets and growth factors</td>
			<td>clontech</td>
			<td>cc4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20-200 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70,760,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Fortuna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blu stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mill-ex 0.22 um filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>VirTis-SP Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>AirCos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>v79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine-2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rutin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5143-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 25 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmScope MD500 camera</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>D4818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab heater</td>
			<td>Falc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ParaFilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis

אנגיוגנזה היא תופעה הכוללת תהליכים שונים, כגון הפצת תאים אנדותל, בידול והגירה, המובילה להקמת כלי דם חדשים ומערבת מספר מסלולים של אותות התמרה. כאן אנו מראים ששיטת היווצרות הצינורות היא דרך פשוטה להעריך את ההשפעה של מוצרים טבעיים על אנגיוגנזה ולחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים. בפרט, בנוכחות תמצית המים של רוטה האלגני (rgwe), תאי האנדותל אינם מסוגלים עוד ליצור רשת תא תא וכי השפעות rgwe על תא הטבור האנושי (huvec) היווצרות שפופרת בוטלה על ידי ה הפעלה חוקתית של מק.

כדי להעריך את ההשפעה של RGWE על אנגיוגנזה, בוצע שיטת היווצרות שפופרת על מטריצת מרתף מגולב. כאשר מטפחים אותו, HUVECs טופס מבנים כמו צינור שמקורם תאים המופיעים מוארך והמחברים זה את זה כדי ליצור רשת תא תא (איור 2). באיור 3, אנו מראים כי מספר הסניפים ב H...

Watch this Scientific Journal Video about HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis at JoVE.com

HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

מערכת שפופרת HUVEC להערכת השפעת מוצרים טבעיים על אנגיוגנזה

כאן, אנו להעריך את ההשפעות של תמצית המים של רוטה הקבר על היווצרות הרשת באמצעות שימוש בשיטת היווצרות צינור על מטריצה מרתף ג.

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

Assay היווצרות צינור הוא מבחן במבחנה ללמוד את המנגנונים המולקולריים שבבסיס מספר צעדים שמובילים להיווצרות של כלי דם חדשים. חקירה זו מאפשרת לזהות תרכובות ואיתות מפלים הקשורים אנגיוגנזה. עם בדיקה אחת, אנו מסוגלים להראות כי תרכובת טבעית כמו RGWE מפחיתה את היכולת של תאים אנדותל ליצור מבנה דמוי צינור, אינם משפיעים על הכדאיות של התא, כי השפעה זו תלויה בהפעלת מסלול MEK / ERK. חשוב לבצע את הבדיקה עם המספר הנכון של תאים. למעשה, מעט מדי או תאים רבים מדי לא יכלו לאפשר היווצרות נכונה של צינורות. מסיבה זו, מומלץ לבצע בדיקה ראשונית כדי לגלות את המספר הנכון של התאים. לוקה אולגה פסטורמינו, דוקטורנטית במעבדה שלי, תראה את הנהלים. ראשית, לאסוף עלי רוטה graveolens במהלך חודשי האביב והקיץ. שים 250 גרם של עלים קצוצים בבקבוק חרוט, ולהוסיף ליטר אחד של מים מזוקקים, להרתיח, ולסנן, כמתואר בכתב היד. למחרת, להשתמש lyophilizer כדי lyophilize תמצית עלה. לאחר קבלת האבקה, שוקלים אותה ומחלקים אותה לאליקוטים. תרבות HUVECs במדיום צמיחת תא אנדותל, על פי פרוטוקול הטקסט. כאשר התאים מגיעים ל- 80%confluency, מעבר התאים ביחס של אחד עד שלושה. השתמש בתאים המתקבלים בין מעבר 2 למעבר חמש. לאחר HUVECs מעבר להגיע 70%confluency, לבצע חציית אותם עם מיקרוגרם אחד של הווקטור המכיל את הגן של עניין.לשלב מיקרוגרם אחד של DNA עם שלושה microliters של Lipofectamine מדולל 2000.Then, להסיר את המדיום מן HUVECs, ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד של מדיום שלם טרי. מוסיפים את פתרון ההצטלפות לתאים, ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני. שלוש שעות לאחר טרנסווט, מוסיפים שבעה מיליליטר של מדיום שלם טרי, ו דגירה התאים במשך 24 עד 48 שעות נוספות. מיד לפני הכנת המרתף, הניחו צלחת מצוננת מראש של 96 בארות על קרח, והוסיפו 50 מיקרוליטרים של מטריצה קרה לכל באר. בעוד הצלחת דגירה, לשטוף את HUVECs עם מיליליטר אחד של פתרון PBS / EDTA. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של פתרון טריפסין-EDTA לתאים, ו דגירה במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס.לאסוף את המדיום המכיל את התאים התלויים, לקצור את התאים באמצעות צנטריפוגה. לאחר מכן, בצע שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של PBS. העבר 0.2 מיליליטר של ההשעיה התא ל 0.5 מיליליטר של PBS עם פתרון כחול trypan. לאחר החזקת ההשעיה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, לספור את התאים B

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Encapsulation אלגינט של תאי גזע pluripotent שימוש נחיר Co-הצירית

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

פיתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay לאבחון תפקוד התכווצות של תאי mesenchymal שעבר אפיתל-mesenchymal מעבר

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

השתלות תחרותיות להערכת כושר תאי גזע Hematopoietic

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

מודלים חריפים כרוניים של היפרגליקמיה דג הזברה: שיטה להעריך את ההשפעה של היפרגליקמיה על נוירוגנזה ועל ביודיסטריבוצי של מולקולות Radiolabeled

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

5-mc נקודה כתם Assay לכמת את מתילציה DNA רמת Chondrocyte Dedifiationiation<em&gt; במבחנה</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

שיטות ניתוח ההשפעות של אורניום טבעי על במבחנה Osteoclastogenesis

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

תא מבחני צבירה כדי להעריך את הכריכה של החריץ דרוזופילה עם טרנס-ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים-ליגנדים

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

ניתוח קינטי של Vasculogenesis מכמתת את הדינמיקה של Vasculogenesis ואנגיוגנזה במבחנה

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

במבחני חוץ גופית כדי להעריך את ההעברה הפלישה, התפשטות של שורות תאים מונצחים Trophoblast בטרימסטר הראשון אנושי

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...