Name: huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis
Uploaded: 2019-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato da Fondi di Ateneo ai fondi di Luca Colucci-D'Amato e ValeRE Program a Maria Teresa Gentile e al fondo AIRC IG18999 a Maurizio Bifulco.

1. Preparazione RGWE
<ol><li>Raccogliere le foglie di R. graveolens dalle piante durante i mesi primaverili / estivi sotto la supervisione di un botanico. NOT:</</c1> In questo caso, le foglie sono state raccolte presso la Sezione Sperimentale di Piante Medicinali nell'Oro Botanico di Napoli, Italia5. La pianta è spontanea, perenne ed è presente nelle regioni mediterranee (Figura1).</li>
	<li>Pesare 250 g di foglie e tritarle finement...

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li><li>Ferrara, N., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+as+a+therapeutic+target.">Angiogenesis as a therapeutic target.</a> Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).</li><li>Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids+as+prospective+compounds+for+anti-cancer+therapy.">Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).</li><li>Gentile, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruta+graveolens+water+extract+inhibits+cell-cell+network+formation+in+human+umbilical+endothelial+cells+via+MEK-ERK1/2+pathway.">Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway.</a> Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).</li><li>Butler, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+to+drugs:+natural+product-derived+compounds+in+clinical+trials.">Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials.</a> Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).</li><li>Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+product+inhibitors+of+ocular+angiogenesis.">Natural product inhibitors of ocular angiogenesis.</a> Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Trung, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+angiogenesis.">In vitro models for angiogenesis.</a> Journal of Science &amp; Development. 13 (4), 850-858 (2015).</li><li>Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Angiogenesis.">In vitro Models of Angiogenesis.</a> World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).</li><li>Simons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Heart+Association+Council+on+Basic+Cardiovascular+Sciences+and+Council+on+Cardiovascular+Surgery+and+Anaesthesia.+State-of-the-Art+Methods+for+Evaluation+of+Angiogenesis+and+Tissue+Vascularisation:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).</li><li>DeCicco-Skinner, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+tube+formation+assay+for+the+in+vitro+study+of+angiogenesis.">Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).</li></ol>

I composti naturali sono caratterizzati da un'elevata diversità chimica e specificità biochimica e rappresentano una fonte di molecole potenzialmente terapeutiche. Qui, mostriamo come ottenere l'estratto d'acqua dalla pianta R. graveolens e proponiamo il saggio di formazione dei tubi come un metodo facile da eseguire, affidabile e quantitativo utile per studiare gli effetti di RGWE sull'angiogenesi. È importante far bollire le foglie di R. graveolens per 1 h per essere sicuri di ottenere l'estratto d...

L'angiogenesi è un processo fisiologico che porta alla formazione di nuovi vasi sanguigni da quelli preesistenti e si verifica durante l'embriogenesi e la crescita degli organi. In età adulta, l'angiogenesi si attiva solo nell'ovaia ciclistica, nella placenta durante la gravidanza e durante la guarigione e la riparazione della ferita. L'angiogenesi dipende dalla capacità delle cellule endoteliali di proliferare, differenziare e migrare per formare una rete vascolare intatta1. Tuttavia, in diversi disturbi, come le malattie infiammatorie, metaboliche e reumatiche, i processi angiogenici sono alterati e l'angiogenesi diventa eccessiva. Inoltre, i processi angiogenici incontrollati stimolano anche la progressione del tumore e la metastasi1. Per questi motivi, nell'ultimo decennio, gli studi di ricerca si concentrano sullo sviluppo di nuove strategie terapeutiche volte all'inibizione dell'eccessiva angiogenesi nei disturbi del cancro, oculare, articolare o della pelle2,3.
Il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) rappresenta l'obiettivo principale delle attuali terapie antiangiogeniche4e sono stati sviluppati e sintetizzati diversi anticorpi monoclonali anti-VEGF per prevenire l'eccessiva angiogenesi. Tuttavia, queste droghe sintetiche mostrano gravi effetti collaterali e hanno un rapporto costo-beneficio sfavorevole5,6. Pertanto, è imperativo trovare nuove strategie terapeutiche per limitare l'angiogenesi eccessiva con effetti collaterali minimi per integrare e combinare con farmaci attualmente utilizzati. Questi nuovi farmaci possono essere trovati tra i prodotti naturali che sono caratterizzati da un'elevata diversità chimica e specificità biochimica.
In questo articolo, proponiamo un metodo semplice per valutare l'impatto del RGWE sulla capacità degli HUVEC di formare tubuli su una matrice sotterranea gelata in vitro5. Infatti, RGWE è una miscela di metaboliti secondari come flavonoidi e polifenoli tra i quali la rutina è il componente principale5. Molti di loro sono già stati testati come agenti anti-infiammatori e vasoprotettivi7,8,9,10,11. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che RGWE, ma non la rutina, è in grado di inibire la capacità HUVEC di formare tubuli su una matrice sotterranea gelata e che questo fenomeno è mediato dal percorso MEK-ERK, indicando RGWE come un potenziale strumento terapeutico in grado di prevenire l'eccessiva formazione di nuovi vasi sanguigni5.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HUVEC cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>C2519A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>cc3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single quot kit- supplemets and growth factors</td>
			<td>clontech</td>
			<td>cc4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20-200 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70,760,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Fortuna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blu stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mill-ex 0.22 um filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>VirTis-SP Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>AirCos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>v79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine-2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rutin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5143-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 25 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmScope MD500 camera</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>D4818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab heater</td>
			<td>Falc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ParaFilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis

L'angiogenesi è un fenomeno che comprende diversi processi, come la proliferazione delle cellule endoteliali, la differenziazione e la migrazione, che portano alla formazione di nuovi vasi sanguigni e coinvolgono diversi percorsi di trasduzione del segnale. Qui dimostriamo che il test di formazione dei tubi è un semplice metodo in vitro per valutare l'impatto dei prodotti naturali sull'angiogenesi e per studiare i meccanismi molecolari coinvolti. In particolare, in presenza dell'estratto d'acqua di Ruta graveolens (RGWE), le cellule endoteliali non sono più in grado di formare una rete cellulare e che gli effetti di RGWE sulla formazione di tubi endoteliali delle cellule ombelicali umane (HUVEC) sono aboliti attivazione coniugale di MEK.

Per valutare l'influenza di RGWE sull'angiogenesi, abbiamo eseguito un test di formazione di tubi su una matrice del seminterrato gelata. Quando vengono coltivati su di esso, gli HUVEC formano strutture simili a tubi che provengono da cellule che appaiono allungate e che si collegano tra loro per formare una rete cellulare (Figura 2). Nella Figura 3, si mostra che il numero di filiali in HUVEC trattati con RGWE è stato significa...

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HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

HuVEC Analisi della formazione di tubi per valutare l'impatto dei prodotti naturali sull'angiogenesi

Qui, valutiamo gli effetti dell'estratto d'acqua dei tombolens di Ruta sulla formazione della rete navale utilizzando un saggio di formazione del tubo su una matrice sotterranea gelata.

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

Il saggio di formazione del tubo è un test in vitro per studiare i meccanismi molecolari alla base di diversi passaggi che portano alla formazione di nuovi vasi sanguigni. Questo saggio consente di identificare composti e segnalare cascate associate all'angiogenesi. Con un test, siamo in grado di dimostrare che un composto naturale come RGWE riduce la capacità delle cellule endoteliali di formare una struttura simile a un tubo, non influisce sulla vitalità cellulare e che questo effetto dipende dall'attivazione della via MEK / ERK. È importante eseguire il test con il giusto numero di celle. In effetti, troppe poche o troppe cellule non potevano consentire la giusta formazione di tubi. Per questo motivo, è consigliabile eseguire un test preliminare per scoprire il numero corretto delle cellule. Luca Olga Pastorino, dottorando nel mio laboratorio, mostrerà le procedure. In primo luogo, raccogliere le foglie di Ruta graveolens durante i mesi primaverili ed estivi. Metti 250 grammi di foglie tritate in un pallone conico e aggiungi un litro di acqua distillata, far bollire e filtrare, come descritto nel manoscritto. Il giorno dopo, usa un liofilizzatore per liofilizzare l'estratto fogliare. Dopo aver ottenuto la polvere, pesarla e dividerla in aliquote. Cultura gli HUVEC nel mezzo di crescita delle cellule endoteliali, secondo il protocollo di testo. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, passare le cellule con un rapporto da uno a tre. Utilizzare le cellule ottenute tra il passaggio due e il passaggio cinque. Una volta che gli HUVEC passaggi raggiungono il 70% di confluenza, traslitterarli con un microgrammo del vettore contenente il gene di interesse.Combinare un microgrammo di DNA con tre microlitri di lipofectamina diluita 2000.Quindi, rimuovere il mezzo dagli HUVEC e sostituirlo con un millilitro di mezzo fresco completo. Aggiungere la soluzione transvettive alle cellule e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Tre ore dopo la trasvezione, aggiungere sette millilitri di mezzo fresco completo e incubare le cellule per altre 24-48 ore. Immediatamente prima della preparazione del seminterrato, mettere una piastra pre-refrigerata da 96 po 'sul ghiaccio e aggiungere 50 microlitri di matrice fredda ad ogni pozzo. Mentre la piastra incuba, lavare gli HUVEC con un millilitro di soluzione PBS/EDTA. Quindi, aggiungere un millilitro di soluzione di tripina-EDTA alle cellule e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius.Raccogliere il mezzo contenente le cellule sospese e raccogliere le cellule tramite centrifugazione. Quindi, rimospend le cellule in un millilitro di PBS. Trasferire 0,2 millilitri della sospensione cellulare a 0,5 millilitri di PBS con soluzione blu tripano. Dopo aver tenuto la sospensione a temperatura ambiente per cinque minuti, contare le cellule in un

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