Name: huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis
Uploaded: 2019-06-24T13:00:00
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この作品は、フォンディ・ディ・アテネオからルカ・コルッチ・ダマト、ヴァレ・プログラムの資金をマリア・テレサ・ジェンタイルとAIRCファンドIG18999からマウリツィオ・ビフルコに資金提供しました。

1. RGWE準備
<ol><li>植物学者の監督の下、春/夏の間に植物からR.グラボレンズの葉を収集します。 注:この場合、葉はナポリの植物園の薬用植物の実験セクションで収集されました, イタリア5.植物は自発的で多年生であり、地中海地域に存在する(図1)。</li>
	<li>250gの葉の重量を量り、細かくはさみでそれらを刻みます。</li>
	<li>葉を...

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li><li>Ferrara, N., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+as+a+therapeutic+target.">Angiogenesis as a therapeutic target.</a> Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).</li><li>Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids+as+prospective+compounds+for+anti-cancer+therapy.">Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).</li><li>Gentile, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruta+graveolens+water+extract+inhibits+cell-cell+network+formation+in+human+umbilical+endothelial+cells+via+MEK-ERK1/2+pathway.">Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway.</a> Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).</li><li>Butler, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+to+drugs:+natural+product-derived+compounds+in+clinical+trials.">Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials.</a> Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).</li><li>Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+product+inhibitors+of+ocular+angiogenesis.">Natural product inhibitors of ocular angiogenesis.</a> Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Trung, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+angiogenesis.">In vitro models for angiogenesis.</a> Journal of Science &amp; Development. 13 (4), 850-858 (2015).</li><li>Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Angiogenesis.">In vitro Models of Angiogenesis.</a> World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).</li><li>Simons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Heart+Association+Council+on+Basic+Cardiovascular+Sciences+and+Council+on+Cardiovascular+Surgery+and+Anaesthesia.+State-of-the-Art+Methods+for+Evaluation+of+Angiogenesis+and+Tissue+Vascularisation:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).</li><li>DeCicco-Skinner, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+tube+formation+assay+for+the+in+vitro+study+of+angiogenesis.">Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).</li></ol>

天然化合物は、高い化学的多様性と生化学的特異性によって特徴付けられており、潜在的に治療的分子の供給源を表します。ここでは、植物R.graveolensから水抽出物を得る方法を示し、血管新生に対するRGWEの効果を調べるために有用な、実行しやすい、信頼性が高く、定量的な方法としてチューブ形成アッセイを提案する。完全な水抽出物を得るためには、R.グラボレンズの葉を1...

血管新生は、既存のものから新しい血管の形成につながり、胚形成および臓器の成長中に起こる生理学的プロセスである。成人期には、血管新生は、サイクリング卵巣、妊娠中の胎盤、および創傷治癒および修復中にのみ活性化される。血管新生は、内皮細胞が増殖し、分化し、無傷の血管ネットワーク1を形成するために移行する能力に依存する。しかし、炎症性、代謝性疾患、リウマチ性疾患などのいくつかの疾患では、血管新生プロセスが変化し、血管新生が過剰になる。さらに、制御されていない血管新生プロセスはまた、腫瘍の進行および転移1を刺激する。これらの理由から、過去10年間の研究研究は、癌、眼、関節、または皮膚疾患2、3における過剰な血管新生の阻害を目的とした新しい治療戦略の開発に焦点を当てている。
血管内皮増殖因子(VEGF)は、現在の抗血管新生療法4の主な標的を表し、およびいくつかの抗VEGFモノクローナル抗体が開発され、過剰な血管新生を防ぐために合成されている。しかし、これらの合成薬物は重篤な副作用を示し、不利な費用対利益比5、6を有する。したがって、現在使用されている薬剤を補完し、組み合わせるために最小限の副作用で過剰な血管新生を制限する新しい治療戦略を見つけることが不可欠です。これらの新薬は、高い化学的多様性と生化学的特異性を特徴とする天然物の中で見つけることができます。
本論文では,RGWEがインビトロ5のゲル化基マトリックス上で管状を形成する能力に対するRGWEの影響を評価する簡単な方法を提案する.実際、RGWEは、ルチンが主要成分5であるフラボノイドおよびポリフェノールなどの二次代謝産物の混合物である。それらの多くは、すでに抗炎症および血管保護剤7、8、9、10、11としてテストされています。さらに、最近では、ルチンではなくRGWEがゲル化基基マトリックス上で管状を形成するHUVEC能力を阻害し、この現象がMEK-ERK経路によって媒介され、RGWEが潜在的な治療ツールとしてできることを示している。過度の新しい血管形成を防ぐ 5.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HUVEC cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>C2519A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>cc3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single quot kit- supplemets and growth factors</td>
			<td>clontech</td>
			<td>cc4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20-200 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70,760,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Fortuna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blu stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mill-ex 0.22 um filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>VirTis-SP Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>AirCos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>v79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine-2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rutin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5143-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 25 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmScope MD500 camera</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>D4818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab heater</td>
			<td>Falc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ParaFilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis

血管新生は、内皮細胞増殖、分化、移動などの異なるプロセスを含む現象であり、新しい血管の形成につながり、いくつかのシグナル伝達経路を伴う。ここでは、管形成アッセイが血管新生に対する天然物の影響を評価し、関連する分子機構を調べるための単純なインビトロ法であることを示す。特に、ルタ・グラボレン(RGWE)の水抽出物の存在下では、内皮細胞は細胞ネットワークを形成することができなくなり、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)管形成に対するRGWE効果が廃止される。MEKの構成的活性化。

血管新生に対するRGWEの影響を評価するために、ゲル化基基マトリックス上のチューブ形成アッセイを行った。その上で培養すると、HUVECは細長く見える細胞に由来し、互いに接続して細胞ネットワークを形成するチューブ状の構造を形成する(図2)。図3では、RGWEで処理したHUVECの分岐数が、制御条件と比較して有意に少なく...

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HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

血管新生に対する天然物の影響を評価するHUVECチューブ形成アッセイ

ここでは、ゲル化基マトリックス上のチューブ形成アッセイを用いて、ルタ・グラボレンズの水抽出物が血管ネットワーク形成に及ぼす影響を評価する。

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

チューブ形成アッセイは、新しい血管の形成につながるいくつかのステップの根底にある分子メカニズムを研究するためのインビトロテストです。このアッセイは、血管新生に関連する化合物およびシグナル伝達カスケードを同定することを可能にする。1つのテストでは、RGWEのような天然化合物が内皮細胞がチューブ状の構造を形成する能力を低下させ、細胞の生存率に影響を与えないことを示し、この効果はMEK/ERK経路の活性化に依存することを示すことができる。正しい数のセルでテストを行うことが重要です。実際には,細胞が少なすぎるか、または多すぎる細胞は、チューブの正しい形成を許しませんでした。このため、正しい数のセルを見つけるために予備テストを行うことをお勧めします。ルカ・オルガ・パストリーノ博士(私の研究室の博士課程の学生)が手順を紹介します。まず、春と夏の間にRutaの砂利の葉を収集します。250グラムのみじん切り葉を円錐形のフラスコに入れ、原稿に記載されているように、蒸留水、沸騰、フィルターを1リットル加えます。翌日、凍結乾燥剤を使用して葉エキスを凍結乾燥させる。粉末を得た後、それを計量し、アリコートに分割します。テキストプロトコルに従って、内皮細胞増殖培地中のHUVECを培養する。細胞が80%の合流度に達すると、細胞を1〜3の割合で通過させる。通過2と通路5の間に得られた細胞を使用する。通過したHUVECが70%の合流度に達したら、目的の遺伝子を含むベクターの1マイクログラムでそれらをトランスベクトします。細胞にトランスベーション溶液を加え、摂氏37度、二酸化炭素5%で細胞をインキュベートします。トランスベクションの3時間後、新鮮な完全培地を7ミリリットル加え、さらに24〜48時間培養します。地下準備の直前に、冷やした96ウェルプレートを氷の上に置き、各井戸に50マイクロリットルの冷たいマトリックスを加えます。プレートがインキュベートしている間、1ミリリットルのPBS/EDTA溶液でHUVECを洗います。その後、細胞に1ミリリットルのトリプシン-EDTA溶液を加え、摂氏37度で5分間インキュベートし、浮遊細胞を含む培地を回収し、遠心分離を介して細胞を収穫する。次いで、細胞をPBSの1ミリリットルで再懸濁する。細胞懸濁液の0.2ミリリットルをトリパンブルー溶液で0.5ミリリットルのPBSに移します。懸濁液を室温で5分間保持した後、B内の細胞を数える

Research

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