Name: huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis
Uploaded: 2019-06-24T13:00:00
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이 작품은 마리아 테레사 이방인과 AIRC 펀드 IG18999 마우리치오 비풀코에 루카 콜루치 - 다마토와 발레 프로그램 기금에 폰디 디 아테네에 의해 투자되었다.

1. RGWE 준비
<ol><li>식물학자의 감독 하에 봄/여름 철에 식물에서 R. graveolens 잎을 수집합니다. 참고: 이 경우, 잎은 나폴리 식물원에서 약용 식물의 실험 섹션에서 수집되었다, 이탈리아5. 식물은 자발적이고 다년생이며 지중해 지역에 존재합니다(그림1).</li>
	<li>잎 250g의 무게와 가위로 잘게 자릅니다.</li>
	<li>원추형 플라스크에 잎을 넣...

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li><li>Ferrara, N., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+as+a+therapeutic+target.">Angiogenesis as a therapeutic target.</a> Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).</li><li>Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids+as+prospective+compounds+for+anti-cancer+therapy.">Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).</li><li>Gentile, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruta+graveolens+water+extract+inhibits+cell-cell+network+formation+in+human+umbilical+endothelial+cells+via+MEK-ERK1/2+pathway.">Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway.</a> Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).</li><li>Butler, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+to+drugs:+natural+product-derived+compounds+in+clinical+trials.">Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials.</a> Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).</li><li>Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+product+inhibitors+of+ocular+angiogenesis.">Natural product inhibitors of ocular angiogenesis.</a> Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Trung, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+angiogenesis.">In vitro models for angiogenesis.</a> Journal of Science &amp; Development. 13 (4), 850-858 (2015).</li><li>Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Angiogenesis.">In vitro Models of Angiogenesis.</a> World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).</li><li>Simons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Heart+Association+Council+on+Basic+Cardiovascular+Sciences+and+Council+on+Cardiovascular+Surgery+and+Anaesthesia.+State-of-the-Art+Methods+for+Evaluation+of+Angiogenesis+and+Tissue+Vascularisation:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).</li><li>DeCicco-Skinner, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+tube+formation+assay+for+the+in+vitro+study+of+angiogenesis.">Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).</li></ol>

천연 화합물은 높은 화학적 다양성 및 생화학적 특이성을 특징으로 하며 잠재적으로 치료 분자의 공급원을 나타낸다. 여기서, 우리는 식물 R. graveolens에서 물 추출물을 얻는 방법을 보여주고 혈관 형성 분석법을 수행하기 쉽고 신뢰할 수 있으며 혈관 신생에 대한 RGWE의 효과를 조사하는 데 유용한 정량적 방법으로 제안합니다. 완전한 물 추출물을 얻으려면 R. graveolens 잎을 1 시간 동안...

혈관 신생은 기존의 혈관에서 새로운 혈관의 형성으로 이끌어 내고 배아 발생 및 기관 성장 도중 생기는 생리적인 프로세스입니다. 성인기에서 혈관 신생은 사이클링 난소, 임신 중 태반, 상처 치유 및 수리 중에만 활성화됩니다. 혈관 신생은 내피 세포가 증식, 분화 및 이동하는 능력에 따라 달라지며 그대로 혈관네트워크를 형성합니다 1. 그러나 염증성, 대사 성 및 류마티스 질환과 같은 여러 장애에서 혈관 신생 과정이 변경되고 혈관 신생이 과도해집니다. 더욱이, 통제되지 않는 혈관신생 프로세스는 또한 종양진행 및 전이를 자극합니다 1. 이러한 이유로, 지난 10년간, 연구연구는 암, 안구, 관절 또는 피부 질환에서 과도한 혈관신생의 억제를 목표로 하는 새로운 치료 전략의 개발에 초점을 맞추고있다2,3.
혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 현재 항혈관신생 요법 4의 주요표적을 나타내며, 과도한 혈관신생을 방지하기 위해 여러 개의 항-VEGF 단일클론 항체가 개발 및 합성되고 있다. 그러나, 이러한 합성 약물은 심각한 부작용을 보이고 불리한 비용대 이익 비율을 가지고 5,6. 따라서, 보완하고 현재 사용되는 약물과 결합하는 최소한의 부작용으로 과도한 혈관 신생을 제한하는 새로운 치료 전략을 찾는 것이 필수적이다. 이러한 새로운 약물은 높은 화학적 다양성과 생화학적 특이성을 특징으로하는 천연 제품 중에서 찾을 수 있습니다.
이 문서에서는, 우리는 시험관에서 겔화 된 지하 매트릭스에 튜브를 형성하는 HUVECs의 능력에 RGWE의영향을 평가하는 간단한 방법을 제안한다 5. 실제로, RGWE는 루틴이 주요성분인가운데 플라보노이드 및 폴리페놀과 같은 이차 대사산물의 혼합물이다. 그들 중 많은 사람들이 이미 항 염증 및 혈관 보호 제 7,8,9,10,11로테스트되었습니다. 더욱이, 우리는 최근에 RGWE, 그러나 루틴이 아니라, 겔화된 지하 매트릭스에 관을 형성하는 HUVEC 능력을 억제할 수 있고 이 현상이 MEK-ERK 통로에 의해 중재된다는 것을, RGWE를 잠재적인 치료 도구로 나타낼 수 있다는 것을 증명했습니다 과도 한 새로운 혈관 형성을 방지5.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HUVEC cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>C2519A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>cc3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single quot kit- supplemets and growth factors</td>
			<td>clontech</td>
			<td>cc4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20-200 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70,760,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Fortuna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blu stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mill-ex 0.22 um filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>VirTis-SP Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>AirCos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>v79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine-2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rutin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5143-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 25 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmScope MD500 camera</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>D4818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab heater</td>
			<td>Falc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ParaFilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis

혈관 신생은 새로운 혈관의 형성으로 이끌어 내고 몇몇 신호 전광 통로를 관련시키는 내피 세포 증식, 분화 및 이동과 같은 다른 프로세스를 포함하는 현상입니다. 여기에서 우리는 관 형성 분석이 혈관 신생에 천연물의 충격을 평가하고 관련시킨 분자 기계장치를 조사하기 위하여 간단한 시험관 내 방법이다는 것을 보여줍니다. 특히, 루타 자갈렌즈(RGWE)의 물 추출물이 존재할 때, 내피 세포는 더 이상 세포 세포를 형성할 수 없으며 인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC) 튜브 형성에 대한 RGWE 효과가 폐지되는 데에는 MEK의 구성 활성화.

혈관 신생에 대한 RGWE의 영향을 평가하기 위해 겔화 된 지하 매트릭스에 튜브 형성 분석기를 실시했습니다. 그것에 경작될 때, HUVECs는 길쭉하게 보이고 세포 세포 네트워크를 형성하기 위하여 서로 연결되는 세포에서유래하는 관 같이 구조물을 형성합니다 (그림 2). 도3에서는 RGWE로 처리된 HUVECs의 분기 수가 대조군 조건에 비해...

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HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

HUVEC 튜브 형성 분석은 혈관 신생에 천연 물의 영향을 평가하기 위해

여기서, 우리는 겔화 된 지하 매트릭스에 튜브 형성 분석을 사용하여 혈관 네트워크 형성에 루타 graveolens의 물 추출물의 효과를 평가한다.

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

관 형성 분석은 새로운 혈관의 형성으로 이어지는 몇 가지 단계의 기본 분자 메커니즘을 연구하는 시험관 내 테스트입니다. 이 분석법은 혈관 신생에 관련된 화합물 및 신호 폭포를 식별 할 수 있습니다. 한 번의 테스트를 통해 RGWE와 같은 천연 화합물은 내피 세포가 튜브와 같은 구조를 형성하는 능력을 감소시키고, 세포 생존가능성에 영향을 미치지 않으며, 이 효과는 MEK/ERK 경로의 활성화에 달려 있음을 보여줄 수 있습니다. 적절한 수의 셀로 테스트를 수행하는 것이 중요합니다. 사실, 너무 많거나 너무 많은 세포는 튜브의 올바른 형성을 허용할 수 없었다. 이러한 이유로, 세포의 정확한 수를 알아내기 위해 예비 테스트를 수행하는 것이 좋습니다. 루카 올가 파스토리노, 내 실험실에서 박사 과정 학생, 절차를 보여줍니다. 먼저 봄과 여름철에는 루타 자갈렌즈 잎을 모으세요. 다진 잎 250그램을 원뿔 플라스크에 넣고 원고에 설명된 대로 증류수, 끓기 및 필터 1리터를 추가합니다. 다음 날, 잎 추출물을 lyophilize하기 위해 lyophilizer를 사용합니다. 분말을 얻은 후, 무게를 측정하고, 알리 쿼트로 분할. 텍스트 프로토콜에 따라 내피 세포 성장 배지에서 HUVECs를 배양합니다. 세포가 80%에 도달하면 세포를 1~3의 비율로 통과시합니다. 2번 통과5항 사이에 얻어진 세포를 사용한다. 일단 통과된 HUVECs가 70%의 수렴성에 도달하면, 관심 유전자를 포함하는 벡터의 1마이크로그램으로 변환합니다.희석된 리포펙타민 2000의 3개의 마이크로리터와 DNA의 1마이크로그램을 결합합니다.그런 다음 HUVECs에서 배지를 제거하고 신선한 완전한 매체의 1밀리리터로 대체하십시오. 세포에 변환 용액을 추가하고 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 트랜스포팅 후 3시간 후, 7밀리리터의 신선한 완전 배지를 추가하고, 24~48시간 동안 세포를 배양한다. 지하 준비 직전에, 얼음에 미리 차가운, 96 웰 접시를 넣고, 각 우물에 차가운 매트릭스의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 플레이트가 인큐베이션하는 동안, PBS/EDTA 용액 1밀리리터로 HUVEC를 세척합니다. 그런 다음, Trypsin-EDTA 용액의 1밀리리터를 세포에 추가하고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.중단된 세포를 함유하는 배지를 수집하고 원심분리를 통해 세포를 수확한다. 그런 다음 PBS의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 트라이판 블루 용액을 사용하여 세포 서스펜션의 0.2 밀리리터를 PBS의 0.5 밀리리터로 전송합니다. 실온에서 5분 동안 서스펜션을 유지한 후, 세포를 B로 세어

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

연구

발생학

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개발<em&gt; 체외</em&gt; 분석은 중간 엽 세포를 시행 한 상피 - 중간 엽 전환의 수축 기능을 평가하는

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

경쟁 이식은 조혈 줄기 세포의 체력을 평가하는

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

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제브라 피쉬의 고혈당의 급성 및 만성 모델 : 고혈당의 영향을 평가하는 방법 - 신경 세포 및 방사선 표지 된 분자의 생체 분포

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

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