Name: huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis
Uploaded: 2019-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis at JoVE.com

Dette arbeidet har vært finansiert av Fondi di Ateneo å Luca Colucci-d'Amato og VALERE program midler til Maria Teresa Gentile og AIRC fondet IG18999 til Maurizio Bifulco.

1. RGWE forberedelse
<ol><li>Samle R. graveolens blader fra planter i løpet av våren/sommeren under tilsyn av en botaniker. Merk: I dette tilfellet ble bladene samlet på eksperimentell § medisinske planter i botanisk hage i Napoli, Italia5. Anlegget er spontan, flerårig, og er til stede i middelhavs regionene (figur 1).</li>
	<li>Veie 250 g av løv og fint hogge dem med saks.</li>
	<li>Sett bladene i en konisk kolbe og tilsett 1 L d...

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li><li>Ferrara, N., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+as+a+therapeutic+target.">Angiogenesis as a therapeutic target.</a> Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).</li><li>Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids+as+prospective+compounds+for+anti-cancer+therapy.">Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).</li><li>Gentile, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruta+graveolens+water+extract+inhibits+cell-cell+network+formation+in+human+umbilical+endothelial+cells+via+MEK-ERK1/2+pathway.">Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway.</a> Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).</li><li>Butler, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+to+drugs:+natural+product-derived+compounds+in+clinical+trials.">Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials.</a> Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).</li><li>Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+product+inhibitors+of+ocular+angiogenesis.">Natural product inhibitors of ocular angiogenesis.</a> Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Trung, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+angiogenesis.">In vitro models for angiogenesis.</a> Journal of Science &amp; Development. 13 (4), 850-858 (2015).</li><li>Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Angiogenesis.">In vitro Models of Angiogenesis.</a> World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).</li><li>Simons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Heart+Association+Council+on+Basic+Cardiovascular+Sciences+and+Council+on+Cardiovascular+Surgery+and+Anaesthesia.+State-of-the-Art+Methods+for+Evaluation+of+Angiogenesis+and+Tissue+Vascularisation:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).</li><li>DeCicco-Skinner, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+tube+formation+assay+for+the+in+vitro+study+of+angiogenesis.">Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).</li></ol>

Naturlige forbindelser er preget av et høyt kjemisk mangfold og biokjemiske spesifisitet og representerer en kilde til potensielt terapeutiske molekyler. Her viser vi hvordan du skaffer vann ekstrakt fra anlegget R. graveolens og foreslå rør formasjon analysen som en lett-å-utføre, pålitelig og kvantitativ metode nyttig å undersøke RGWE ' s effekter på angiogenese. Det er viktig å koke R. graveolens blader for 1 time for å være sikker på å få den komplette vann ekstrakt. Koking for mindre...

Angiogenese er en fysiologisk prosess som fører til dannelsen av nye blodårer fra eksisterende og oppstår under embryogenesis og orgel vekst. I voksen alder, angiogenese aktiveres bare i sykling eggstokken, i morkaken under svangerskapet, og under såret healing og reparasjon. Angiogenese avhenger av evnen til endothelial celler til å spre, differensiere, og migrere til å danne en intakt vaskulær nettverk1. Imidlertid, inne adskillige uroer, som opphissende, metabolic, og revmatiske sykdommen, angiogenic prosesser er forandret og angiogenese blir overdreven. Dessuten, ukontrollert angiogenic prosesser stimulerer også tumorprogresjon og metastasering1. Av disse grunner, i det siste tiåret, Forskningsstudier er fokusert på utvikling av nye terapeutiske strategier rettet mot hemming av overdreven angiogenese i kreft, øye, joint, eller hud lidelser2,3.
Vaskulær endothelial vekstfaktor (VEGF) representerer Hovedmålet for dagens antiangiogen behandling4, og flere anti-VEGF monoklonale antistoffer har blitt utviklet og syntetisert for å hindre overdreven angiogenese. Men, disse syntetiske stoffene viser alvorlige bivirkninger og har en ugunstig kost-til-fordel ratio5,6. Derfor er det viktig å finne nye terapeutiske strategier for å begrense overdreven angiogenese med minimale bivirkninger å utfylle og kombinere med for tiden brukte legemidler. Disse nye stoffene kan bli funnet blant naturlige produkter som er preget av et høyt kjemisk mangfold og biokjemiske spesifisitet.
I denne artikkelen foreslår vi en enkel metode for å evaluere virkningen av RGWE på evnen til HUVECs å danne tubuli på en gelled kjeller matrise in vitro5. Faktisk er RGWE en blanding av sekundære metabolitter som flavonoider og polyfenoler blant som rutin er den viktigste komponenten5. Mange av dem har allerede blitt testet som anti-inflammatorisk og vasoprotective agenter7,8,9,10,11. Videre har vi nylig demonstrert at RGWE, men ikke rutin, er i stand til å hemme HUVEC evne til å danne tubuli på en gelled kjeller matrise og at dette fenomenet er formidlet av MEK-ERK veien, indikerer RGWE som en potensiell terapeutisk verktøy i stand til å hindre overdreven nye blodkar dannelse5.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HUVEC cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>C2519A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>cc3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single quot kit- supplemets and growth factors</td>
			<td>clontech</td>
			<td>cc4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20-200 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70,760,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Fortuna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blu stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mill-ex 0.22 um filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>VirTis-SP Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>AirCos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>v79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine-2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rutin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5143-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 25 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmScope MD500 camera</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>D4818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab heater</td>
			<td>Falc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ParaFilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis

Angiogenese er et fenomen som inkluderer ulike prosesser, slik som endothelial celle spredning, differensiering, og migrasjon, som fører til dannelsen av nye blodårer og involvere flere signal Transduction trasé. Her viser vi at rør formasjon analysen er en enkel in vitro -metode for å evaluere virkningen av naturlige produkter på angiogenese og undersøke de molekylære mekanismene som er involvert. Spesielt i nærvær av vann ekstrakt av Ruta graveolens (RGWE), endothelial celler er ikke lenger i stand til å danne en celle-cellenettverk og at RGWE effekter på menneskelig navle vene endothelial celle (HUVEC) tube formasjon er avskaffet av konstituerende aktivering av MEK.

For å evaluere påvirkning av RGWE på angiogenese, gjennomførte vi et rør formasjon analysen på en gelled kjeller matrise. Når dyrket på den, HUVECs form tube-lignende strukturer som kommer fra celler som vises langstrakt og som kobler hverandre for å danne en celle-cellenettverk (figur 2). I Figur 3viser vi at antall grener i HUVECs behandlet med RGWE var signifikant lavere sammenlignet med kontroll forholdene. Spesielt,...

Watch this Scientific Journal Video about HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis at JoVE.com

HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

HUVEC tube-formasjon analysen å evaluere virkningen av naturlige produkter på angiogenese

Her evaluerer vi virkningene av vann ekstrakt av Ruta graveolens på fartøyet nettverk formasjon ved hjelp av et rør formasjon analysen på en gelled kjeller matrise.

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

Rørdannelse Analysen er en in vitro test for å studere molekylære mekanismer som ligger til grunn for flere trinn som fører til dannelsen av nye blodkar. Denne analysen gjør det mulig å identifisere forbindelser og signalisere kaskader knyttet til angiogenese. Med en test kan vi vise at en naturlig forbindelse som RGWE reduserer evnen til endotelceller til å danne rørlignende struktur, påvirker ikke celle levedyktighet, og at denne effekten avhenger av aktiveringen av MEK / ERK-banen. Det er viktig å utføre testen med riktig antall celler. Faktisk, for få eller for mange celler kunne ikke tillate riktig dannelse av rør. Av denne grunn er det tilrådelig å utføre en foreløpig test for å finne ut riktig antall celler. Luca Olga Pastorino, ph.d.-student i laboratoriet mitt, vil vise prosedyrene. Først samle Ruta graveolens blader i løpet av våren og sommermånedene. Sett 250 gram hakkede blader i en konisk kolbe, og tilsett en liter destillert vann, kok og filtrer, som beskrevet i manuskriptet. Neste dag, bruk en lyofilisator for å lyofilisere bladekstraktet. Etter å ha fått pulveret, veie det, og dele det inn i aliquots. Kultur HUVECs i endotelcellevekstmedium, i henhold til tekstprotokollen. Når cellene når 80% samløpet, passasje cellene i et forhold på en til tre. Bruk cellene som er oppnådd mellom passasje to og passasje fem. Når de vedtatte HUVECs nå 70% samløpet, transvect dem med ett mikrogram av vektoren som inneholder genet av interesse.Kombiner ett mikrogram DNA med tre mikroliter av fortynnet Lipofectamine 2000.Deretter fjerne mediet fra HUVECs, og erstatte den med en milliliter frisk komplett medium. Tilsett transvektoppløsningen til cellene, og inkuber cellene ved 37 grader Celsius og fem prosent karbondioksid. Tre timer etter transveksjon, tilsett syv milliliter friskt komplett medium, og inkuber cellene i ytterligere 24 til 48 timer. Umiddelbart før kjellerforberedelsen, legg en forhåndskjølt, 96-brønns tallerken på is, og tilsett 50 mikroliter kald matrise til hver brønn. Mens platen inkuberer, vask HUVECs med en milliliter PBS / EDTA-oppløsning. Deretter legger du til en milliliter Trypsin-EDTA-løsning til cellene, og inkubere i fem minutter ved 37 grader Celsius.Samle mediet som inneholder de suspenderte cellene, og høst cellene via sentrifugering. Deretter gjenbruker cellene i en milliliter PBS. Overfør 0,2 ml cellefjæring til 0,5 milliliter PBS med trypanblå oppløsning. Etter å ha holdt suspensjonen ved romtemperatur i fem minutter, telle cellene i en B

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Alginat Innkapsling av Pluripotent stamceller ved hjelp av en Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Utvikling av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay å evaluere kontraktile funksjon av mesenchymalceller som gjennomgikk Epitelial-Mesenchymale Overgangs

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

Konkurransedyktige transplantasjoner skal vurdere stamcelle Fitness

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Akutte og kroniske modeller av hyperglykemi i sebrafisk: En metode for å vurdere virkningen av hyperglykemi på neurogenese og biodistribusjon av radiomerkede molekyler

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

En 5-mC prikkblot-analyse Kvantifisering av DNA-metyleringsnivået av kondrocyt-diffusjon<em&gt; I Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering og kvantitativ analyse av embryonisk angiogenese i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Metoder for å analysere konsekvensene av uran på In Vitro Osteoclastogenesis

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Celle aggregering analyser evaluere bindingen Drosophila hakket med Trans-ligander og dens hemming av Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetisk analyse av Vasculogenesis kvantifiserer dynamikken i Vasculogenesis og angiogenese In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

I Vitro analyser evaluere overføringen, invasjon og spredning av udødeliggjort menneskelige første trimester Trophoblast linjer

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...