Name: huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis
Uploaded: 2019-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por Fondi di Ateneo para Luca Colucci-d ' Amato e VALERE programa fundos para Maria Teresa Gentile e AIRC fundo IG18999 para Maurizio Bifulco.

1. preparação RGWE
<ol><li>Colete as folhas de R. graveolens das plantas durante os meses da mola/verão a supervisão de um botânico. Nota: Neste caso, as folhas foram coletadas na seção experimental de plantas medicinais no jardim botânico de Nápoles, Itália5. A planta é espontânea, perene, e está presente nas regiões mediterrânicas (Figura 1).</li>
	<li>Pesar 250 g de folhas e pique-os finamente com tesouras.</li>
	<li>Co...

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li><li>Ferrara, N., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+as+a+therapeutic+target.">Angiogenesis as a therapeutic target.</a> Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).</li><li>Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids+as+prospective+compounds+for+anti-cancer+therapy.">Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).</li><li>Gentile, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruta+graveolens+water+extract+inhibits+cell-cell+network+formation+in+human+umbilical+endothelial+cells+via+MEK-ERK1/2+pathway.">Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway.</a> Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).</li><li>Butler, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+to+drugs:+natural+product-derived+compounds+in+clinical+trials.">Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials.</a> Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).</li><li>Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+product+inhibitors+of+ocular+angiogenesis.">Natural product inhibitors of ocular angiogenesis.</a> Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Trung, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+angiogenesis.">In vitro models for angiogenesis.</a> Journal of Science &amp; Development. 13 (4), 850-858 (2015).</li><li>Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Angiogenesis.">In vitro Models of Angiogenesis.</a> World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).</li><li>Simons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Heart+Association+Council+on+Basic+Cardiovascular+Sciences+and+Council+on+Cardiovascular+Surgery+and+Anaesthesia.+State-of-the-Art+Methods+for+Evaluation+of+Angiogenesis+and+Tissue+Vascularisation:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).</li><li>DeCicco-Skinner, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+tube+formation+assay+for+the+in+vitro+study+of+angiogenesis.">Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).</li></ol>

Os compostos naturais são caracterizados por uma elevada diversidade química e especificidade bioquímica e representam uma fonte de moléculas potencialmente terapêuticas. Aqui, mostramos como obter o extrato de água da planta R. graveolens e propor o ensaio de formação de tubos como um método fácil de executar, confiável e quantitativo, útil para investigar os efeitos do rgwe na angiogênese. É importante ferver as folhas do R. graveolens para 1 h para ser certo obter o extrato completo da ...

A angiogênese é um processo fisiológico que leva à formação de novos vasos sanguíneos de preexistentes e ocorre durante a embriogênese e o crescimento de órgãos. Na idade adulta, a angiogênese é ativada apenas no ovário cicatricial, na placenta durante a gravidez, e durante a cicatrização e reparo da ferida. A angiogênese depende da capacidade das células endoteliais de proliferarem, diferenciar e migrar para formar uma rede vascular intacta1. No entanto, em vários distúrbios, como doenças inflamatórias, metabólicas e reumáticas, os processos angiogênicos são alterados e a angiogênese torna-se excessiva. Além disso, processos angiogênicos descontrolados também estimulam a progressão tumoral e a metástase1. Por estas razões, na última década, os estudos de pesquisa estão focados no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas voltadas para a inibição da angiogênese excessiva no câncer, ocular, articular ou distúrbios cutâneos2,3.
O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) representa o principal alvo das terapias antiangiogênicas atuais4, e vários anticorpos monoclonais anti-VEGF foram desenvolvidos e sintetizados para prevenir a angiogênese excessiva. No entanto, essas drogas sintéticas apresentam efeitos colaterais graves e têm uma relação custo-benefício desfavorável5,6. Portanto, é imperativo encontrar novas estratégias terapêuticas para limitar a angiogênese excessiva com efeitos colaterais mínimos para complementar e combinar com drogas atualmente usadas. Estes novos fármacos podem ser encontrados entre os produtos naturais que se caracterizam por uma elevada diversidade química e especificidade bioquímica.
Neste artigo, propomos um método simples para avaliar o impacto do RGWE na capacidade de HUVECs de formar túbulos em uma matriz basal gelada in vitro5. Na verdade, RGWE é uma mistura de metabólitos secundários, como flavonoides e polifenóis, entre os quais a rutina é o principal componente5. Muitos deles já foram testados como agentes anti-inflamatórios e vasoprotetores7,8,9,10,11. Além disso, temos demonstrado recentemente que RGWE, mas não rutina, é capaz de inibir a capacidade HUVEC para formar túbulos em uma matriz de porão gelada e que este fenômeno é mediado pela via MEK-ERK, indicando RGWE como uma ferramenta terapêutica potencial capaz de prevenir a formação excessiva de novos vasos sanguíneos5.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HUVEC cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>C2519A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>cc3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single quot kit- supplemets and growth factors</td>
			<td>clontech</td>
			<td>cc4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20-200 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70,760,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Fortuna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blu stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mill-ex 0.22 um filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>VirTis-SP Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>AirCos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>v79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine-2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rutin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5143-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 25 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmScope MD500 camera</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>D4818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab heater</td>
			<td>Falc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ParaFilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis

A angiogênese é um fenômeno que inclui diferentes processos, como proliferação de células endoteliais, diferenciação e migração, que levam à formação de novos vasos sanguíneos e envolvem várias vias de transdução de sinal. Aqui nós mostramos que o ensaio da formação do tubo é um método in vitro simples para avaliar o impacto de produtos naturais na angiogênese e para investigar os mecanismos moleculars envolvidos. Em particular, na presença do extrato de água de Ruta graveolens (rgwe), as células endoteliais já não são capazes de formar uma rede celular e que os efeitos rgwe na formação de tubos de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) são abolidos pela ativação constitutiva do MEK.

Para avaliar a influência de RGWE na angiogênese, realizou-se um ensaio de formação de tubos em uma matriz de porão gelada. Quando cultivada nele, HUVECs formam estruturas semelhantes a tubos que se originam de células que aparecem alongadas e que se conectam entre si para formar uma rede celular (Figura 2). Na Figura 3, mostramos que o número de filiais em HUVECs tratados com rgwe foi significativamente menor em relação...

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HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

Tubo HUVEC-ensaio de formação para avaliar o impacto dos produtos naturais na angiogênese

Aqui, nós avaliamos os efeitos do extrato da água de Ruta graveolens na formação da rede do vaso usando um ensaio da formação do tubo em uma matriz gelada do porão.

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

O Ensaio de formação de tubos é um teste in vitro para estudar os mecanismos moleculares subjacentes a vários passos que levam à formação de novos vasos sanguíneos. Este ensaio permite identificar compostos e sinalizar cascatas associadas à angiogênese. Com um teste, podemos mostrar que um composto natural como o RGWE reduz a capacidade das células endoteliais de formar estrutura semelhante a tubos, não afetam a viabilidade celular, e que esse efeito depende da ativação da via MEK/ERK. É importante realizar o teste com o número certo de células. Na verdade, poucas ou muitas células não poderiam permitir a formação correta de tubos. Por essa razão, é aconselhável realizar um teste preliminar para descobrir o número correto das células. Luca Olga Pastorino, doutoranda do meu laboratório, mostrará os procedimentos. Primeiro, coletar folhas de graves Ruta durante os meses de primavera e verão. Coloque 250 gramas de folhas picadas em um frasco cônico, e adicione um litro de água destilada, fervura e filtro, conforme descrito no manuscrito. No dia seguinte, use um liofilizador para liofilizar o extrato da folha. Depois de obter o pó, pese-o e divida-o em alíquotas. Cultura os HUVECs em meio de crescimento celular endotelial, de acordo com o protocolo de texto. Quando as células atingem 80% de confluência, passagem as células em uma proporção de um a três. Use as células obtidas entre a passagem dois e a passagem cinco. Uma vez que os HUVECs com passagem atinjam 70% de confluência, transfira-os com um micrograma do vetor contendo o gene de interesse.Combine um micrograma de DNA com três microlitadores de Lipofectamina diluída 2000.Em seguida, remova o meio dos HUVECs e substitua-o por um mililitro de meio completo fresco. Adicione a solução de transvecting às células, e incuba as células a 37 graus Celsius, e 5% dióxido de carbono. Três horas após a transvecção, adicione sete mililitros de meio completo fresco e incuba as células por mais 24 a 48 horas. Imediatamente antes da preparação do porão, coloque uma placa pré-refrigerada de 96 poços no gelo, e adicione 50 microliters de matriz fria a cada poço. Enquanto a placa incuba, lave os HUVECs com um mililitro de solução PBS/EDTA. Em seguida, adicione um mililitro da solução Trypsin-EDTA às células e incuba por cinco minutos a 37 graus Celsius.Colete o meio contendo as células suspensas e colme as células através da centrifugação. Então, resuspense as células em um mililitro de PBS. Transfira 0,2 mililitros da suspensão celular para 0,5 mililitros de PBS com solução azul trypan. Depois de segurar a suspensão em temperatura ambiente por cinco minutos, conte as células em um B

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