Name: huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis
Uploaded: 2019-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis at JoVE.com

Эта работа была профинансирована Fondi ди Ateneo Лука Колуччи-D'Amato и VALERE Программа средств Для Марии Терезы Джентиле и AIRC фонд IG18999 Маурицио Bifulco.

1. Подготовка РГВЕ
<ol><li>Соберите Листья R. graveolens из растений в течение весенне-летних месяцев под наблюдением ботаника. ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае, листья были собраны в экспериментальной секции лекарственных растений в Ботаническом саду Неаполя, Италия5. Рас?...

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li><li>Ferrara, N., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+as+a+therapeutic+target.">Angiogenesis as a therapeutic target.</a> Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).</li><li>Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids+as+prospective+compounds+for+anti-cancer+therapy.">Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).</li><li>Gentile, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruta+graveolens+water+extract+inhibits+cell-cell+network+formation+in+human+umbilical+endothelial+cells+via+MEK-ERK1/2+pathway.">Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway.</a> Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).</li><li>Butler, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+to+drugs:+natural+product-derived+compounds+in+clinical+trials.">Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials.</a> Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).</li><li>Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+product+inhibitors+of+ocular+angiogenesis.">Natural product inhibitors of ocular angiogenesis.</a> Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Trung, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+angiogenesis.">In vitro models for angiogenesis.</a> Journal of Science &amp; Development. 13 (4), 850-858 (2015).</li><li>Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Angiogenesis.">In vitro Models of Angiogenesis.</a> World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).</li><li>Simons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Heart+Association+Council+on+Basic+Cardiovascular+Sciences+and+Council+on+Cardiovascular+Surgery+and+Anaesthesia.+State-of-the-Art+Methods+for+Evaluation+of+Angiogenesis+and+Tissue+Vascularisation:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).</li><li>DeCicco-Skinner, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+tube+formation+assay+for+the+in+vitro+study+of+angiogenesis.">Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).</li></ol>

Природные соединения характеризуются высоким химическим разнообразием и биохимической специфичностью и представляют собой источник потенциально терапевтических молекул. Здесь мы покажем, как получить экстракт воды из завода R. graveolens и предлагаем исследование образования трубк...

Ангиогенез является физиологическим процессом, который приводит к образованию новых кровеносных сосудов из уже существующих и происходит во время эмбриогенеза и роста органов. В зрелом возрасте ангиогенез активируется только в велосипедных яичниках, в плаценте во время беременности, а также во время заживления ран и ремонта. Ангиогенез зависит от способности эндотелиальных клеток размножаться, дифференцироваться и мигрировать, образуя нетронутую сосудистую сеть1. Однако при некоторых нарушениях, таких как воспалительные, метаболические и ревматические заболевания, изменяются ангиогенные процессы и становится чрезмерным ангиогенез. Кроме того, неконтролируемые ангиогенные процессытакже стимулируют прогрессирование опухоли и метастазирование 1. По этим причинам, в последнее десятилетие, исследования сосредоточены на разработке новых терапевтических стратегий, направленных на ингибирование чрезмерного ангиогенеза при раке, глазной, суставной или кожных заболеваний2,3.
Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) представляет собой основную цельтекущей антиангиогенной терапии 4, и несколько анти-VEGF моноклональных антител были разработаны и синтезированы для предотвращения чрезмерного ангиогенеза. Тем не менее, эти синтетические наркотики показывают серьезные побочные эффекты и имеют неблагоприятное соотношение затрат на выгоду5,6. Поэтому крайне важно найти новые терапевтические стратегии, чтобы ограничить чрезмерный ангиогенез с минимальными побочными эффектами, чтобы дополнить и в сочетании с в настоящее время используется наркотиков. Эти новые препараты можно найти среди натуральных продуктов, которые характеризуются высоким химическим разнообразием и биохимической спецификой.
В этой статье мы предлагаем простой метод для оценки влияния RGWE на способность HUVECs формировать трубочки на гелеобразной матрице подвала in vitro5. Действительно, RGWE представляет собой смесь вторичных метаболитов, таких как флавоноиды и полифенолы, среди которых колея является основным компонентом5. Многие из них уже протестированы как противовоспалительные и вазопротекторные средства7,8,9,10,11. Кроме того, мы недавно показали, что RGWE, но не rutin, способен подавлять способность HUVEC формировать трубочки на гелеобразной матрице подвала и что это явление опосредовано meK-ERK путь, указывая RGWE в качестве потенциального терапевтического инструмента, способного предотвратить чрезмерное образование новых кровеносных сосудов5.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HUVEC cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>C2519A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>cc3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single quot kit- supplemets and growth factors</td>
			<td>clontech</td>
			<td>cc4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20-200 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70,760,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Fortuna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blu stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mill-ex 0.22 um filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>VirTis-SP Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>AirCos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>v79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine-2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rutin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5143-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 25 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmScope MD500 camera</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>D4818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab heater</td>
			<td>Falc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ParaFilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis

Ангиогенез является явление, которое включает в себя различные процессы, такие как пролиферация эндотелиальных клеток, дифференциация и миграция, которые приводят к образованию новых кровеносных сосудов и включают в себя несколько путей трансдукции сигнала. Здесь мы показываем, что анализ формирования трубки является простым методом in vitro для оценки влияния натуральных продуктов на ангиогенез и для исследования молекулярных механизмов. В частности, в присутствии экстракта воды Рута graveolens (RGWE), эндотелиальные клетки больше не в состоянии сформировать сеть клеток и что RGWE воздействие на человека пупочной вены эндотелиальной клетки (HUVEC) образование трубки отменяется составной активации МЭК.

Чтобы оценить влияние RGWE на ангиогенез, мы провели анализ формирования трубки на гелеобразной матрице подвала. При культивировании на нем, HUVECs форме трубки, как структуры, которые происходят из клеток, которые появляются удлиненные и которые соединяют друг с другом, ч?...

Watch this Scientific Journal Video about HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis at JoVE.com

HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

HUVEC трубообразования Анализ для оценки воздействия натуральных продуктов на ангиогенез

Здесь мы оцениваем влияние экстракта воды Рута graveolens на формирование сети судов с помощью трубки формирования асссировки на гелеобразной матрицы подвала.

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

Анализ трубообразования является тестом in vitro для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе нескольких шагов, которые приводят к образованию новых кровеносных сосудов. Этот анализ позволяет определить соединения и сигнальные каскады, связанные с ангиогенезом. С помощью одного теста мы можем показать, что такое природное соединение, как RGWE, снижает способность эндотелиальных клеток формировать трубчатую структуру, не влияет на жизнеспособность клеток, и что этот эффект зависит от активации пути MEK/ERK. Важно выполнить тест с правильным количеством клеток. В самом деле, слишком мало или слишком много клеток не может позволить правильное образование труб. По этой причине рекомендуется провести предварительный тест, чтобы выяснить правильное количество клеток. Лука Ольга Пасторино, аспирантка моей лаборатории, покажет процедуры. Во-первых, собирать Ruta graveolens листья в течение весенних и летних месяцев. Положите 250 граммов измельченных листьев в коническую колбу и добавьте один литр дистиллированной воды, кипятите и фильтруйте, как описано в рукописи. На следующий день используйте лиофилизатор, чтобы лиофилизировать экстракт листьев. После получения порошка, взвесить его, и разделить его на aliquots. Культура HUVECs в эндотелиальной среде роста клеток, в соответствии с текстовым протоколом. Когда клетки достигают 80%-ного слияния, проходят клетки в соотношении одного к трем. Используйте ячейки, полученные между проходом два и проход пять. После прохождения HUVECs достичь 70%confluency, трансвектировать их с одним микрограммом вектора, содержащего ген interest.Combine один микрограмм ДНК с тремя микролитров разбавленного липофектамина 2000.Then, удалить среду из HUVECs, и заменить его на один миллилитр свежей полной среде. Добавьте раствор поперечного в клетки и инкубировать клетки при 37 градусах цельсия и пятипроцентный углекислый газ. Через три часа после трансвекции добавьте семь миллилитров свежей полной среды и инкубировать клетки еще на 24-48 часов. Непосредственно перед приготовлением подвала, положить предварительно охлажденный, 96-хорошо пластины на льду, и добавить 50-микролитров холодной матрицы к каждому хорошо. В то время как пластина инкубирует, мыть HUVECs с одним миллилитром раствора PBS/EDTA. Затем добавьте в клетки один миллилитр раствора трипсина-ЭДТА и инкубировать в течение пяти минут при 37 градусах по Цельсию.Соберите среду, содержащую подвесные клетки, и соберите клетки с помощью центрифугации. Затем, повторного перерасхода клеток в один миллилитр PBS. Передача 0,2-миллилитров клеточной подвески на 0,5 миллилитров PBS с трипаном синего раствора. После проведения подвески при комнатной температуре в течение пяти минут, подсчитайте клетки в B

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Альгинат инкапсуляции плюрипотентных стволовых клеток, используя коаксиальный Насадка

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Развитие<em&gt; In Vitro</em&gt; Анализ для оценки сократительной функции мезенхимальных клеток, перенесшей Эпителиальные-мезенхимальных переходной

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

Конкурентные трансплантатов для оценки гемопоэтических стволовых клеток Фитнес

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Острые и хронические модели гипергликемии у рыбок данио: метод оценки влияния гипергликемии на нейрогенез и биораспределение радиоактивно меченых молекул

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

Анализ 5-кратного точечного блоттинга Количественный анализ уровня метилирования ДНК дифференцировки хондроцитов<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Визуализация и количественный анализ эмбрионального ангиогенеза у<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Методы анализа последствий природного урана на в пробирке Osteoclastogenesis

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Сотовый агрегации анализов для оценки привязки дрозофилы паз с транс-лигандов и его ингибирование СНГ-лигандами

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Кинетический анализ Vasculogenesis дает количественную оценку динамики Vasculogenesis и ангиогенеза в пробирке

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

В Vitro анализов для оценки миграции, вторжения и распространения увековечен человека первого триместра трофобласта клеточных линий

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...