Name: huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis
Uploaded: 2019-06-24T13:00:00
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Este trabajo ha sido financiado por Fondi di Ateneo a los fondos del Programa Luca Colucci-D'Amato y VALERE a Maria Teresa Gentile y al fondo AIRC IG18999 a Maurizio Bifulco.

1. Preparación de RGWE
<ol><li>Recoger las hojas de R. graveolens de las plantas durante los meses de primavera/verano bajo la supervisión de un botánico. NOTA: En este caso, las hojas fueron recogidas en la Sección Experimental de Plantas Medicinales en el Jardín Botánico de Nápoles, Italia5. La planta es espontánea, perenne y está presente enlas regiones mediterráneas (Figura 1).</li>
	<li>Pesar 250 g de hojas y picarlas fina...

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li><li>Ferrara, N., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+as+a+therapeutic+target.">Angiogenesis as a therapeutic target.</a> Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).</li><li>Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids+as+prospective+compounds+for+anti-cancer+therapy.">Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).</li><li>Gentile, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruta+graveolens+water+extract+inhibits+cell-cell+network+formation+in+human+umbilical+endothelial+cells+via+MEK-ERK1/2+pathway.">Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway.</a> Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).</li><li>Butler, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+to+drugs:+natural+product-derived+compounds+in+clinical+trials.">Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials.</a> Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).</li><li>Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+product+inhibitors+of+ocular+angiogenesis.">Natural product inhibitors of ocular angiogenesis.</a> Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Trung, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+angiogenesis.">In vitro models for angiogenesis.</a> Journal of Science &amp; Development. 13 (4), 850-858 (2015).</li><li>Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Angiogenesis.">In vitro Models of Angiogenesis.</a> World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).</li><li>Simons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Heart+Association+Council+on+Basic+Cardiovascular+Sciences+and+Council+on+Cardiovascular+Surgery+and+Anaesthesia.+State-of-the-Art+Methods+for+Evaluation+of+Angiogenesis+and+Tissue+Vascularisation:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).</li><li>DeCicco-Skinner, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+tube+formation+assay+for+the+in+vitro+study+of+angiogenesis.">Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).</li></ol>

Los compuestos naturales se caracterizan por una alta diversidad química y especificidad bioquímica y representan una fuente de moléculas potencialmente terapéuticas. Aquí, mostramos cómo obtener extracto de agua de la planta R. graveolens y proponemos el ensayo de formación de tubos como un método fácil de realizar, confiable y cuantitativo útil para investigar los efectos de RGWE en la angiogénesis. Es importante hervir las hojas de R. graveolens durante 1 h para asegurarse de obtener el ex...

La angiogénesis es un proceso fisiológico que conduce a la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes y se produce durante la embriogénesis y el crecimiento de órganos. En la edad adulta, la angiogénesis se activa sólo en el ovario de ciclismo, en la placenta durante el embarazo y durante la cicatrización y reparación de heridas. La angiogénesis depende de la capacidad de las células endotelialespara proliferar, diferenciar y migrar para formar una red vascular intacta 1. Sin embargo, en varios trastornos, como enfermedades inflamatorias, metabólicas y reumáticas, los procesos angiogénicos se alteran y la angiogénesis se vuelve excesiva. Además, los procesos angiogénicos no controlados también estimulan la progresión tumoral y la metástasis1. Por estas razones, en la última década, los estudios de investigación se centran en el desarrollo de nuevasestrategias terapéuticas dirigidas a la inhibición de la angiogénesis excesiva en trastornos del cáncer, ocular, articular o cutáneo 2,3.
El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) representa elobjetivo principal de las terapias antiangiogénicas actuales 4, y se han desarrollado y sintetizado varios anticuerpos monoclonales anti-VEGF para prevenir la angiogénesis excesiva. Sin embargo, estas drogas sintéticas muestran efectos secundarios graves y tienen una relación costo-beneficio desfavorable5,6. Por lo tanto, es imperativo encontrar nuevas estrategias terapéuticas para limitar la angiogénesis excesiva con efectos secundarios mínimos para complementar y combinar con los fármacos utilizados actualmente. Estos nuevos fármacos se pueden encontrar entre los productos naturales que se caracterizan por una alta diversidad química y especificidad bioquímica.
En este artículo, proponemos un método sencillo para evaluar el impacto de la RGWE en la capacidad delos HUVEC para formar túbulos en una matriz de sótano gelificada in vitro 5. De hecho, RGWE es una mezcla de metabolitos secundarios como flavonoides y polifenoles entre los que la rutina es el componente principal5. Muchos de ellos ya han sido probados como agentes antiinflamatorios y vasoprotectores7,8,9,10,11. Además, recientemente hemos demostrado que RGWE, pero no la rutina, es capaz de inhibir la capacidad de HUVEC para formar túbulos en una matriz de sótano gelizada y que este fenómeno está mediado por la vía MEK-ERK, lo que indica RGWE como una herramienta terapéutica potencial capaz de evitar la formación excesiva de nuevos vasos sanguíneos5.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HUVEC cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>C2519A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>cc3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single quot kit- supplemets and growth factors</td>
			<td>clontech</td>
			<td>cc4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20-200 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70,760,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Fortuna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blu stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mill-ex 0.22 um filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>VirTis-SP Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>AirCos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>v79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine-2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rutin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5143-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 25 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmScope MD500 camera</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>D4818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab heater</td>
			<td>Falc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ParaFilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis

La angiogénesis es un fenómeno que incluye diferentes procesos, como la proliferación de células endoteliales, la diferenciación y la migración, que conducen a la formación de nuevos vasos sanguíneos e implican varias vías de transducción de señales. Aquí mostramos que el ensayo de formación de tubos es un método in vitro simple para evaluar el impacto de los productos naturales en la angiogénesis e investigar los mecanismos moleculares involucrados. En particular, en presencia del extracto de agua de Ruta graveolens (RGWE), las células endoteliales ya no son capaces de formar una red celular y que los efectos RGWE sobre la formación de tubos de células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC) son abolidos por la formación de tubos de células sociales humanas (HUVEC) activación constitutiva de MEK.

Para evaluar la influencia de RGWE en la angiogénesis, llevamos a cabo un ensayo de formación de tubos sobre una matriz de sótano gelificada. Cuando se cultivan en él, los HUVEC forman estructuras similares a tubos que se originan a partir de células que aparecen alargadas y que se conectan entre sí para formar una red de células celulares (Figura2). En la Figura3, mostramos que el número de sucursales en LOS HUVEC tratad...

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HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

HUVEC Ensayo de formación de tubos para evaluar el impacto de los productos naturales en la angiogénesis

Aquí, evaluamos los efectos del extracto de agua de Ruta graveolens en la formación de la red de recipientes mediante el uso de un ensayo de formación de tubos en una matriz de sótano gelizado.

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

El ensayo de formación de tubos es una prueba in vitro para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes a varios pasos que conducen a la formación de nuevos vasos sanguíneos. Este ensayo permite identificar compuestos y cascadas de señalización asociadas a la angiogénesis. Con una prueba, podemos demostrar que un compuesto natural como RGWE reduce la capacidad de las células endoteliales para formar una estructura similar a un tubo, no afectan la viabilidad celular, y que este efecto depende de la activación de la vía MEK/ERK. Es importante realizar la prueba con el número correcto de celdas. De hecho, muy pocas o demasiadas células no podían permitir la formación correcta de tubos. Por esta razón, es aconsejable realizar una prueba preliminar para averiguar el número correcto de las células. Luca Olga Pastorino, estudiante de doctorado en mi laboratorio, mostrará los procedimientos. Primero, recoge hojas de Ruta graveolens durante los meses de primavera y verano. Ponga 250 gramos de hojas picadas en un matraz cónico, y agregue un litro de agua destilada, hierva y filtro, como se describe en el manuscrito. Al día siguiente, utilizar un liofilizador para liofilizar el extracto de hoja. Después de obtener el polvo, pesarlo, y dividirlo en alícuotas. Cultivo de los HUVEC en medio de crecimiento celular endotelial, de acuerdo con el protocolo de texto. Cuando las células alcancen el 80% de confluencia, pasaje las celdas a una proporción de uno a tres. Utilice las células obtenidas entre el paso dos y el paso cinco. Una vez que los HUVEC con pasos alcanzan el 70%confluencia, transvect ellos con un microgramo del vector que contiene el gen de interés.Combinar un microgramo de ADN con tres microlitros de lipofectamina diluida 2000.Then, eliminar el medio de los HUVEC, y reemplazarlo por un mililitro de medio fresco completo. Agregue la solución de transvección a las células e incubar las células a 37 grados centígrados y al cinco por ciento de dióxido de carbono. Tres horas después de la transvección, añadir siete mililitros de medio fresco completo, e incubar las células durante 24 a 48 horas adicionales. Inmediatamente antes de la preparación del sótano, ponga una placa pre-enfriada de 96 pozos sobre hielo, y agregue 50 microlitros de matriz fría a cada pozo. Mientras la placa se incuba, lave los HUVEC con un mililitro de solución PBS/EDTA. Luego, agregue un mililitro de solución de Tripppsin-EDTA a las células, e incubar durante cinco minutos a 37 grados Celsius.Recoger el medio que contiene las células suspendidas, y cosechar las células a través de la centrifugación. Luego, resuspenda las células en un mililitro de PBS. Transfiera 0,2 mililitros de la suspensión celular a 0,5 mililitros de PBS con solución azul tripano. Después de mantener la suspensión a temperatura ambiente durante cinco minutos, cuente las células en una

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