Name: huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis
Uploaded: 2019-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av Fondi di Ateneo till Luca Colucci-d ' Amato och VALERE program medel till Maria Teresa Gentile och AIRC Fund IG18999 till Maurizio Bifulco.

1. RGWE förberedelse
<ol><li>Samla R. graveolens blad från växter under vår/sommarmånaderna under överinseende av en botaniker. Anmärkning: I detta fall var bladen samlades in på experimentell del av Medicinal växter i botaniska trädgården i Neapel, Italien5. Växten är spontan, perenn och förekommer i Medelhavsregionerna (figur 1).</li>
	<li>Väg 250 g blad och finhacka dem med sax.</li>
	<li>Lägg bladen i en konisk kolv o...

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li><li>Ferrara, N., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+as+a+therapeutic+target.">Angiogenesis as a therapeutic target.</a> Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).</li><li>Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids+as+prospective+compounds+for+anti-cancer+therapy.">Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).</li><li>Gentile, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruta+graveolens+water+extract+inhibits+cell-cell+network+formation+in+human+umbilical+endothelial+cells+via+MEK-ERK1/2+pathway.">Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway.</a> Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).</li><li>Butler, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+to+drugs:+natural+product-derived+compounds+in+clinical+trials.">Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials.</a> Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).</li><li>Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+product+inhibitors+of+ocular+angiogenesis.">Natural product inhibitors of ocular angiogenesis.</a> Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Trung, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+angiogenesis.">In vitro models for angiogenesis.</a> Journal of Science &amp; Development. 13 (4), 850-858 (2015).</li><li>Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Angiogenesis.">In vitro Models of Angiogenesis.</a> World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).</li><li>Simons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Heart+Association+Council+on+Basic+Cardiovascular+Sciences+and+Council+on+Cardiovascular+Surgery+and+Anaesthesia.+State-of-the-Art+Methods+for+Evaluation+of+Angiogenesis+and+Tissue+Vascularisation:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).</li><li>DeCicco-Skinner, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+tube+formation+assay+for+the+in+vitro+study+of+angiogenesis.">Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).</li></ol>

Naturliga föreningar kännetecknas av en hög kemisk mångfald och biokemiska specificitet och utgör en källa till potentiellt terapeutiska molekyler. Här visar vi hur man får vattenextrakt från växten R. graveolens och föreslå röret formation assay som en enkel att utföra, tillförlitlig och kvantitativ metod användbar för att undersöka rgwe effekter på angiogenes. Det är viktigt att koka R. graveolens bladen för 1 h för att vara säker på att få hela vatten extraktet. Kokande för ...

Angiogenes är en fysiologisk process som leder till bildandet av nya blodkärl från redan existerande och uppträder under embryogenes och orgel tillväxt. I vuxen ålder, angiogenes aktiveras endast i cykling äggstock, i moderkakan under graviditeten, och under sårläkning och reparation. Angiogenes beror på förmågan hos endotelceller att förgöra, differentiera, och migrera för att bilda en intakt vaskulär nätverk1. Emellertid, i flera sjukdomar, såsom inflammatoriska, metabola, och reumatiska sjukdomar, angiogena processer ändras och angiogenes blir överdriven. Dessutom, okontrollerad angiogena processer stimulerar också tumörprogression och metastaser1. Av dessa skäl, under det senaste decenniet, forskningsstudier är inriktade på utveckling av nya terapeutiska strategier som syftar till att hämma överdriven angiogenes i cancer, ögon, LED, eller hudsjukdomar2,3.
Vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) representerar det huvudsakliga målet för nuvarande antiangiogena terapier4, och flera anti-VEGF monoklonala antikroppar har utvecklats och syntetiserats för att förhindra överdriven angiogenes. Emellertid, dessa syntetiska droger visar allvarliga biverkningar och har en ofördelaktig kostnad till nytta förhållandet5,6. Därför, det är absolut nödvändigt att hitta nya terapeutiska strategier för att begränsa överdriven angiogenes med minimala biverkningar att komplettera och kombinera med närvarande används droger. Dessa nya läkemedel kan hittas bland naturliga produkter som kännetecknas av en hög kemisk mångfald och biokemiska specificitet.
I denna artikel, föreslår vi en enkel metod för att utvärdera effekterna av rgwe på förmågan hos huvecs att bilda tubuli på en geléartad källare matris in vitro-5. I själva verket, RGWE är en blandning av sekundära metaboliter såsom flavonoider och polyfenoler bland vilka rutin är den viktigaste komponenten5. Många av dem har redan testats som anti-inflammatoriska och vasoskyddande medel7,8,9,10,11. Dessutom har vi nyligen visat att rgwe, men inte rutin, kan hämma huvec förmåga att bilda tubuli på en geléartad källare matris och att detta fenomen förmedlas av MEK-erk väg, vilket indikerar rgwe som ett potentiellt terapeutiskt verktyg som kan förhindra överdriven ny blodkärlsbildning5.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HUVEC cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>C2519A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>cc3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single quot kit- supplemets and growth factors</td>
			<td>clontech</td>
			<td>cc4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20-200 pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70,760,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Fortuna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blu stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mill-ex 0.22 um filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>VirTis-SP Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>AirCos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>v79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine-2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rutin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5143-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 25 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmScope MD500 camera</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>D4818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab heater</td>
			<td>Falc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ParaFilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

huvec tube-formation assay to evaluate the impact of natural products on angiogenesis

Angiogenes är ett fenomen som omfattar olika processer, såsom endotelcellproliferation, differentiering, och migration, som leder till bildandet av nya blodkärl och involverar flera signaltransduktionvägar. Här visar vi att röret formation analysen är en enkel in vitro -Metod för att utvärdera effekterna av naturliga produkter på angiogenes och att undersöka de molekylära mekanismerna inblandade. I synnerhet, i närvaro av vatten extraktet av ruta graveolens (rgwe), endotelceller inte längre kan bilda ett cell-cell-nätverk och att rgwe effekter på mänskliga navel Strängs endotelceller cell (huvec) rör bildning avskaffas genom en konstitutiv aktivering av MEK.

För att utvärdera påverkan av rgwe på angiogenes, genomförde vi ett rör formation assay på en geléartad källare matris. När den odlas på den, bildar HUVECs rör-liknande strukturer som kommer från celler som verkar långsträckta och som ansluter varandra för att bilda ett cell-cell-nätverk (figur 2). I diagram 3visar vi att antalet filialer i HUVECs som behandlades med rgwe var signifikant lägre jämfört med kont...

Watch this Scientific Journal Video about HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis at JoVE.com

HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

HUVEC rör-bildande analys för att utvärdera effekterna av naturliga produkter på angiogenes

Här utvärderar vi effekterna av vattenextrakt av ruta graveolens på fartygs nätet bildas med hjälp av en slang formation assay på en geléartad källare matris.

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

Tube-formation Assay är ett in vitro-test för att studera de molekylära mekanismer som ligger bakom flera steg som leder till bildandet av nya blodkärl. Denna analys gör det möjligt att identifiera föreningar och signalering kaskader associerade till angiogenes. Med ett test kan vi visa att en naturlig förening som RGWE minskar endotelcellernas förmåga att bilda rörliknande struktur, inte påverkar cellernas livskraft och att denna effekt beror på aktiveringen av MEK/ERK-vägen. Det är viktigt att utföra testet med rätt antal celler. I själva verket kunde för få eller för många celler inte tillåta rätt bildande av rör. Av denna anledning är det lämpligt att utföra ett preliminärt test för att ta reda på rätt antal av cellerna. Luca Olga Pastorino, doktorand i mitt labb, kommer att visa ingreppen. Först, samla Ruta graveolens blad under våren och sommarmånaderna. Lägg 250 gram hackade blad i en konisk kolv, och tillsätt en liter destillerat vatten, koka och filtrera, som beskrivs i manuskriptet. Nästa dag, använd en lyofilizer för att lyophilize bladextraktet. Efter att ha erhållit pulvret, väg den, och dela det i alikvoter. Odla HUVECs i endotel celltillväxt medium, enligt textprotokollet. När cellerna når 80%konfluency, passage cellerna med ett förhållande av ett till tre. Använd de celler som erhålls mellan passage två och passage fem. När de passagende HUVECs nå 70%confluency, transvect dem med ett mikrogram av vektorn som innehåller genen av interest.Combine ett mikrogram DNA med tre mikroliter av utspädd Lipofectamine 2000.Därefter, ta bort mediet från HUVECs, och ersätta den med en milliliter färskt komplett medium. Tillsätt transvecting lösningen till cellerna, och inkubera cellerna i 37 grader Celsius, och fem procent koldioxid. Tre timmar efter transvection, tillsätt sju milliliter färskt komplett medium, och inkubera cellerna i ytterligare 24 till 48 timmar. Omedelbart före källaren förberedelse, sätta en prekyld, 96-väl tallrik på is, och tillsätt 50-mikroliter av kall matris till varje brunn. Medan plattan inkuberar, tvätta HUVECs med en milliliter PBS / EDTA lösning. Lägg sedan till en milliliter trypsin-EDTA-lösning till cellerna och inkubera i fem minuter vid 37 grader Celsius.Samla mediet som innehåller de upphängda cellerna och skörda cellerna via centrifugeringen. Sedan, återanvända cellerna i en milliliter av PBS. Överför 0,2-milliliter av cellupphängningen till 0,5-milliliter PBS med trypanblå lösning. Efter att ha hållit suspensionen i rumstemperatur i fem minuter, räkna cellerna i en B

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Alginat inkapsling av pluripotenta stamceller med hjälp av en Co-axial munstycke

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Utveckling av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Analys för att utvärdera kontraktila funktion av mesenkymala celler som genomgick Epithelial-Mesenkymala Övergångs

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

Konkurrenskraftiga Transplantat att utvärdera hematopoetisk stamcellstransplantation Fitness

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Akuta och kroniska modeller av hyperglykemi i sebrafisk: En metod för att bedöma effekterna av hyperglykemi på neurogenes och biodistribution av radiomärkta molekyler

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

En 5-mC primärblottanalys som kvantifierar DNA-metyleringsnivån av kondrocyt-skillnad<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering och kvantitativ analys av embryonisk angiogenes i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Metoder för att analysera effekterna av naturligt uran på In Vitro Osteoclastogenesis

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation analyser att utvärdera bindningen av Drosophila skåran med Trans-ligander och dess hämning av Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetic analys av Vasculogenesis kvantifierar dynamiken i Vasculogenesis och angiogenes In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Vitro analyser att utvärdera migreringen, Invasion och spridning av förevigade mänskliga första trimestern trofoblaster cellinjer

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...