Name: novel object recognition and object location behavioral testing in mice on a budget
Uploaded: 2018-11-20T15:00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Object Recognition and Object Location Behavioral Testing in Mice on a Budget at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato da R00 NS089938 da NIH e finanziamenti di avviamento da lesione cerebrale cronica e temi scoperta presso la Ohio State University per EDK.

Il seguente protocollo è stato approvato dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) presso la Ohio State University (OSU).
1. costruire le arene
<ol><li>Ordinare i materiali descritti nella tabella 1: cinque fogli di acrilico, cemento acrilico e un 16G IPO applicatore.</li>
	<li>Indossare un equipaggiamento di sicurezza appropriato secondo le istruzioni del produttore, che possono includere occhio, pelle e altri tipi di protezione.</li>
	<li>Rimuovere il rivestimento di carta protettiva dalle lastre acriliche.</li>
	<li>Secco in forma tutti i materiali per confermare che le dimensioni sono corrette (Figura 1A).</li>
	<li>Montare e caricare la siringa con cemento acrilico.</li>
	<li>Allineare il bordo lungo una parete esterna (parte B) con un bordo superiore della base (parte C) e garantire che essi siano perpendicolari tra loro utilizzando un quadrato di combinazione o macchinista.</li>
	<li>Usando la siringa, applicare una perlina piccola e costante di cemento direttamente l'angolo dei due pezzi da congiungere.</li>
	<li>Tenere i due pezzi (parti B e C) in luogo fino a quando sono inizialmente impostati (circa 5 min). Nota: In genere, essi saranno 80% indurito in 24h, ma Assemblea può continuare dopo 5 min.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 1,5 – 1,7 con altre parete esterna (parte B) alla stessa base.</li>
	<li>Fissare le due pareti (parte A), uno alla volta, alla base mediante passaggi 1,5 – 1,7.</li>
	<li>Inoltre, usare la siringa per applicare un piccolo e costante della perla di cemento direttamente all'angolo ora a formarsi da parete esterna (parte B) e all'interno della parete (parte A).</li>
	<li>Tenere questi pezzi in posizione per 5 min.</li>
	<li>Dopo 24-48 h, procedere alla configurazione dell'ambiente di test comportamento.</li>
</ol>2. impostare l'ambiente di test comportamentali e delle attrezzature
<ol><li>Posto stimoli ambientali (come descritto nella sezione discussione) di fronte l'altro e di fronte le arene nell'area di test (Figura 1B).</li>
	<li>Organizzare le quattro arene test in modo 2-da-2 a pavimento o tavolo stabile alle distanze adeguate dagli spunti e la fotocamera per massimizzare l'input visivo ai topi (Figura 1B).</li>
	<li>Verificare la linea di vista utilizzando un metro bastone appoggiato da ogni piano arena oltre il muro verso gli spunti per confermare che queste distanze tra le arene e gli indizi siano appropriate.</li>
	<li>Determinare la lunghezza del percorso ottico ottimale che permette di video-documentazione di tutte le quattro arene regolando l'altezza della fotocamera o l'altezza della tabella. (Figura 1B).</li>
	<li>Collegare la fotocamera a un cavo di prolunga USB.</li>
	<li>Utilizzando le canalizzazioni di cavi, far passare il cavo attraverso il soffitto e giù una parete per un computer che esegue video capture software.</li>
	<li>Nascondere il computer dietro una tenda che separerà i topi nell'area di test dal ricercatore (Figura 1).</li>
	<li>Montare 4 ciascuno di almeno 3 diversi oggetti che sono circa il 2 – 5 cm in lunghezza e larghezza e fino a 10 cm di altezza da utilizzare per il test (Figura 1).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58593/58593fig1.jpg"> Figura 1: preparazione test comportamentali. (A) Open-campo-prova assembly arena con parte A corrispondente della parete interna, la parte B come la parete esterna e la parte C come base. L'arena finito avrà due pareti esterne (Part B) che eseguono tutto il bordo della base e due pareti interne (parti A) che si adattano tra le pareti esterne sui bordi adiacenti della base (parte C). Tutte le pareti riposerà sopra alla base. (B) disposizione rappresentativo delle arene su un tavolo alto di 0,62 m, stimoli ambientali 60 x 90 cm, luci e una macchina fotografica per un'area di prova che permette la cattura di tutte le quattro arene contemporaneamente. (C), A tenda cela il sistema sperimentatore e computer da topi durante le prove. Le plafoniere sono ai fini dell'assunzione di questa fotografia, ma durante i test, solo le lampade da terra sono su. Inoltre, uno degli stimoli ambientali è stato rimosso per questa fotografia di area di test, ma durante il test, c'è un quarto cue davanti le arene, il cue tutto nero dietro il tavolo di fronte. Oggetto rappresentativo (D), A (e righello per scala) che è adatto per OLT o NORT test con i topi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58593/58593fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="9"><li>Convalida di questi oggetti.<ol>
<li>Ottenere un minimo di 8 topi wild-type nel sesso, deformazione ed età gruppo rappresentante dei topi sperimentali che verranno utilizzati (ad es., 6 a mouse week-old 9 maschili e femminili C57Bl/6).</li>
		<li>Gestire tutti i topi al giorno per 1 min nel corso di 3 – 5 giorni prima della prova.</li>
		<li>Topi si divide in gruppi di 4 e, se non si trovano già singolarmente, spostarli nella persona fisica titolare di gabbie pulite.</li>
		<li>Portarli in sala prove e consentire loro di acclimatare per almeno 30 min. Nota: Presenza dello sperimentatore in camera per questi 30 min si riduce lo stress sui topi durante l'attività, specialmente se lo sperimentatore è uomo20.</li>
		<li>Dopo acclimatazione è fatto e lo sperimentatore è pronto per iniziare, iniziare a registrare il video.</li>
		<li>Posizionare ogni mouse rivolto verso le pareti di un angolo dell'arena (chiamato l'angolo di rilascio) (Figura 2A).</li>
		<li>Consentire i topi esplorare le arene liberamente per 10 min.</li>
		<li>Interrompere la registrazione video.</li>
		<li>Tornare loro gabbie pulite della holding di topi per una durata di 20 min.</li>
		<li>Pulire tutte le arene con struttura animale consigliato metodi, come pulire con etanolo al 70% per ridurre al minimo i segnali olfattivi prima dell'uso successivo di pulizia.</li>
		<li>Utilizzando nastro biadesivo, apporre 2 diversi oggetti vicino a 2 angoli non rilascio tale che gli oggetti sono controbilanciati nell'arena e 6x6 cm2 da ogni parete di quell'angolo (Figura 2B).</li>
		<li>Avviare la registrazione video.</li>
		<li>Posizionare ogni mouse rivolto verso le pareti nell'angolo rilascio.</li>
		<li>Consentire topi per indagare l'arena e gli oggetti liberamente per 10 min.</li>
		<li>Interrompere la registrazione video.</li>
		<li>Posto topi indietro nelle loro gabbie che tiene pulito per una durata di 20 min.</li>
		<li>Pulire tutte le arene e gli oggetti con struttura animale consigliato metodi come pulire con etanolo al 70% per ridurre al minimo i segnali olfattivi di pulizia.</li>
		<li>Ripetere prove di formazione con 2 nuovi oggetti applicati nelle stesse posizioni, fino a quando tutti gli oggetti (almeno tre oggetti diversi se conducendo NORT sia OLT) sono stati testati con ogni mouse.</li>
		<li>Escludere gli oggetti che consentono di topi per sedersi sopra l'oggetto.</li>
		<li>Analizzare il tempo di ricerca di ogni mouse con ogni oggetto secondo passaggio 4.</li>
		<li>Escludere gli oggetti che hanno un valore intrinseco positivo o negativo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. condurre il Test comportamento
<ol><li>Una settimana prima della prova: familiarizzazione agli individui delle prove comportamentali<ol>
<li>Gestire adulto 6 alla 9 settimana maschili e femminili C57Bl/6 topi al giorno per 1 min nel corso di 3 – 5 giorni prima della prova.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 ° giorno: sessioni di assuefazione<ol>
<li>Topi si divide in gruppi di 4 e, se non si trovano già singolarmente, spostarli nella persona fisica titolare di gabbie pulite.</li>
		<li>Portarli per la sala di collaudo e consentire loro di ambientarsi alla sala di collaudo per almeno 30 min. Nota: presenza dello sperimentatore in camera per questi 30 min riduce lo stress sui topi durante l'attività, specialmente se lo sperimentatore è uomo20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo acclimatazione è fatto e lo sperimentatore è pronto per iniziare, iniziare a registrare il video.</li>
	<li>Posizionare ogni mouse nell'arena (un solo mouse per arena) rivolto verso le pareti dell'angolo di uscita (Figura 2A).</li>
	<li>Consentire i topi esplorare le arene liberamente per 6 min.</li>
	<li>Interrompere la registrazione video.</li>
	<li>Tornare topi loro gabbie che tiene pulito durante l'intervallo Inter-trial (ITI).</li>
	<li>Pulire tutte le arene con struttura animale consigliato metodi come pulire con etanolo al 70% per ridurre al minimo i segnali olfattivi di pulizia.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3.3 – 3,9 due volte per un totale di 3 sessioni di assuefazione per ogni mouse.</li>
	<li>Restituire tutti i topi a loro casa gabbie.</li>
	<li>Pulire tutte le arene con la funzione animale metodi come pulire con etanolo al 70% di pulizia consigliati per ridurre al minimo i segnali olfattivi prima dell'uso il giorno successivo.</li>
	<li>Giorni 2: prova formazione, OLT, NORT Nota: Il NORT è un test facoltativo.<ol>
<li>Dopo 24 h, portare lo stesso gruppo di topi in sala prove e consentire loro di ambientarsi alla sala di collaudo per almeno 30 min come fatto prima delle sessioni di assuefazione del giorno precedente.</li>
		<li>Eseguire una prova di formazione utilizzando 2 oggetti posizionati nell'arena (Figura 2B).<ol>
<li>Utilizzando nastro biadesivo, apporre oggetti 6x6 cm2 lontano 2 non rilascio angoli tale che essi sono controbilanciati nell'arena.</li>
			<li>Avviare la registrazione video.</li>
			<li>Posizionare ogni mouse rivolto verso le pareti dell'angolo rilascio come fatto durante le sessioni di assuefazione.</li>
			<li>Consentire topi per indagare l'arena e gli oggetti liberamente per 10 min.</li>
			<li>Interrompere la registrazione video.</li>
			<li>Posto topi indietro nelle loro gabbie pulite holding per un ITI di 20 min.</li>
			<li>Pulire tutte le arene e gli oggetti con struttura animale consigliato metodi come pulire con etanolo al 70% per ridurre al minimo i segnali olfattivi di pulizia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eseguire l'OLT.<ol>
<li>Spostare uno degli oggetti utilizzati nell'addestramento prova un nuovo angolo di non rilascio e apporre l'oggetto 6 cm da ogni parete di quell'angolo con nastro biadesivo (Figura 2). Nota: L'altro oggetto deve rimanere dove è stato durante l'allenamento, prova.</li>
			<li>Avviare la registrazione video.</li>
			<li>Posizionare ogni mouse rivolto verso le pareti nell'angolo rilascio.</li>
			<li>Consentire topi per indagare gli oggetti per 10 min.</li>
			<li>Interrompere la registrazione video.</li>
			<li>Posto topi indietro nelle loro gabbie pulite holding per un ITI di 20 min.</li>
			<li>Pulire tutte le arene e gli oggetti con struttura animale consigliato metodi come pulire con etanolo al 70% per ridurre al minimo i segnali olfattivi di pulizia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eseguire il NORT.<ol>
<li>Sostituire l'oggetto che non è stato spostato durante il OLT con un oggetto romanzo e apporre l'oggetto romanzo 6 cm da due pareti dell'angolo con nastro biadesivo (Figura 2D).</li>
			<li>Avviare la registrazione video.</li>
			<li>Posizionare ogni mouse rivolto verso le pareti nell'angolo rilascio.</li>
			<li>Consentire topi per indagare gli oggetti per 10 min.</li>
			<li>Interrompere la registrazione video.</li>
			<li>Posto topi indietro nelle loro gabbie di casa.</li>
			<li>Pulire tutte le arene e gli oggetti con struttura animale pulizia consigliata metodi come pulire con etanolo al 70% per ridurre al minimo i segnali olfattivi prima dell'uso successivo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58593/58593fig2.jpg"> Figura 2: configurazione di Arena per le prove. Campo aperto (A) test arena senza oggetti per sessione di assuefazione. La freccia nera indica un angolo di rilascio. Questo angolo dovrebbe essere la stessa posizione relativa in ogni arena e coerente per ogni mouse in fase di test e per ogni prova. (B) per il processo di formazione, due diversi oggetti sono fissati al campo aperto alle 6 x 6 centimetri lontano dalle loro rispettive pareti. (C) per OLT, un oggetto viene spostato in una nuova posizione, anche 6 x 6 cm di distanza da pareti e non l'angolo di rilascio. (D) per the NORT, l'oggetto che era fermo in OLT viene sostituito con un oggetto romanzo mentre l'oggetto spostato da OLT è un oggetto familiare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58593/58593fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
4. analisi dei dati di Test comportamentali
Nota: Analisi di video idealmente devono essere completata da almeno due sperimentatori indipendenti, accecati.
<ol><li>Aprire il file video.</li>
	<li>Applicare un cerchio trasparente che fornisce un bordo di 2 cm intorno a ogni oggetto sullo schermo per aiutare a determinare la ricerca attiva. Utilizzare un'immagine di file video con un righello collocato in un'arena per calibrare questa griglia.</li>
	<li>Osservare il comportamento del mouse e registrare i tempi che il mouse sta attivamente indagando l'oggetto, che consiste del suo naso puntato verso l'oggetto ad una distanza massima di 2 cm da quell'oggetto.<ol>
<li>Record il timestamp del mouse inizia a indagare su un oggetto e il timestamp quando smette di indagare quell'oggetto.</li>
		<li>Ripetere questa operazione per entrambi gli oggetti nell'arena per tutta la durata della prova.</li>
		<li>Calcolare il tempo cumulativo che il mouse studiato ogni oggetto sottraendo il tempo di avvio dal tempo di arresto per ogni istanza di indagine in oggetto, e aggiungendo tutti questi valori.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcolare la percentuale di tempo di ricerca totale o l'indice di discriminazione con le seguenti formule:<ol>
<li>Calcolare la percentuale di tempo di ricerca totale = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58593/58593eq1.jpg"> Nota: Un valore superiore al 50% indica una maggiore indagine della posizione romanzo o dell'oggetto.</li>
		<li>Calcolare l'indice di discriminazione = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58593/58593eq2.jpg"> Nota: Un valore positivo indica più tempo indagando l'oggetto romanzo. Un indice di discriminazione pari a zero indica uguale tempo trascorso con entrambi gli oggetti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rappresentare graficamente i risultati ed analisi statistiche complete utilizzando un t-test o ANOVA come appropriato per il numero di gruppi confrontati.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Krakauer, J. W., Ghazanfar, A. A., Gomez-Marin, A., Maclver, M. A., Poeppel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience+Needs+Behavior:+Correcting+a+Reductionist+Bias.">Neuroscience Needs Behavior: Correcting a Reductionist Bias.</a> Neuron. 93 (3), 480-490 (2017).</li><li>Lange, F., Seer, C., Kopp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+flexibility+in+neurological+disorders:+Cognitive+components+and+event-related+potentials.">Cognitive flexibility in neurological disorders: Cognitive components and event-related potentials.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 83, 496-507 (2017).</li><li>Barnett, J. H., Blackwell, A. D., Sahakian, B. J., Robbins, T. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Larger+Social+Network+Enhances+Novel+Object+Location+Memory+and+Reduces+Hippocampal+Microgliosis+in+Aged+Mice.">A Larger Social Network Enhances Novel Object Location Memory and Reduces Hippocampal Microgliosis in Aged Mice.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 10 (142), 1-16 (2018).</li><li>Chieffi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+Influence+on+Hippocampal+Function:+Possible+Involvement+of+Orexin-A.">Exercise Influence on Hippocampal Function: Possible Involvement of Orexin-A.</a> Frontiers in Physiology. 14 (8), 85 (2017).</li><li>Garth, A., Roeder, I., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+in+an+enriched+environment+learn+more+flexibly+because+of+adult+hippocampal+neurogenesis.">Mice in an enriched environment learn more flexibly because of adult hippocampal neurogenesis.</a> Hippocampus. 26 (2), 261-271 (2016).</li><li>Brown, R. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Object+Recognition+Test+for+the+Investigation+of+Learning+and+Memory+in+Mice.">Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e55718 (2017).</li><li>Wasserstein, R. L., Lazar, N. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Test cognitivi efficace isolare e valutare la funzione neurale di regioni specifiche del cervello esaminando il comportamento in un ambiente controllato1. In esseri umani, compiti specifici sono stati progettati per valutare le prestazioni delle regioni del cervello mirato, ad esempio la scheda Wisconsin ordinamento attività per funzione prefrontale o gli associati appaiati test del (Cambridge batteria neuropsicologica a Automated Test di apprendimento CANTAB) per funzione hippocampal2,3. Questi test sono progettati per studiare le funzioni delle regioni specifiche del cervello in esseri umani valutando comportamenti che derivano dall'attività neurale di quelle regioni. L'obiettivo finale della ricerca biomedica più è il miglioramento della salute umana; Tuttavia, molti studi di funzione del cervello in salute o malattia non possono essere eticamente eseguiti con i partecipanti umani. Per gli studi che non possono utilizzare i partecipanti umani, piccoli roditori come topi sono spesso il modello di scelta. Utilizzo di modelli murini consente il controllo diretto sulle manipolazioni sperimentali tra cui alterazione dell'espressione genica, induzione della lesione o anche modulazione dell'attività del circuito attraverso tecniche di optogenetica. Test del comportamento dei topi, simili alla prova umana, mira a valutare l'effetto delle variabili sperimentali sulla funzione cerebrale misurando i comportamenti che si basano su specifiche regioni.
L'ippocampo è una struttura essenziale per la formazione della memoria in esseri umani e roditori4. Più specificamente, l'ippocampo riveste un ruolo critico nella memoria dichiarativa che coinvolgono rappresentazioni relazionali, ma la memoria non procedurale, che si basa sui centri motori del cervello4. Funzione di memoria hippocampal è stato un fuoco di studio in molti campi delle neuroscienze perché è squisitamente sensibile alla perturbazione. Perturbazioni negativi che vanno dallo stress prolungato e di invecchiamento per i grippaggi ed il colpo sono associati con danno hippocampal5. Al contrario, interventi positivi, quali l'interazione sociale, arricchimento ambientale fisica o esercizio, migliorano la funzione hippocampal6,7,8. Gli studi del roditore con corretta sperimentazione di memoria hippocampal possono rivelare spaccato i mediatori cellulari e molecolari della memoria così come gli effetti dei diversi interventi ambientali sulla funzione hippocampal.
Nei roditori, sono stati sviluppati diversi test per studiare l'ippocampo-dipendente apprendimento e memoria9,10,11. Essi possono essere sostanzialmente suddivisi in attività che richiedono uno stimolo con valenza emotiva per suscitare un cambiamento nel comportamento e attività che attingono la preferenza del roditore di indagare nuovi stimoli11. Contestuale paura condizionata, ad esempio, coppie uno stimolo sgradevole (piede scossa) con un contesto ambientale e poi test di memoria per il contesto misurando indotta da paura congelamento comportamento9,11. Labirinto dell'acqua di Morris e la sua controparte asciutto, il labirinto di Barnes, utilizzare rinforzo esterno negativo per promuovere apprendimento spaziale4,11. In ogni caso, roditori cercano di fuggire da una situazione che ha avversione, essendo immersa in acqua fredda o esposti su una piattaforma ben illuminata, rispettivamente. Il labirinto a bracci radiali, al contrario, si basa sul rinforzo positivo come animali utilizzano il comportamento di foraggiamento naturale accoppiato con memoria spaziale per recuperare cibo piccole ricompense4,11. Queste attività sono ampiamente usate e hanno dato le conoscenze fondamentali sulla memoria hippocampal. Tuttavia, negativi e positivi rinforzi esterni o stimoli che inducono paura come scossa aggiungere un componente emotiva questi comportamentale prove che in alcuni casi può essere indesiderabile. Ad esempio, ippocampi dorsali e ventrali sono associati con funzioni distinte, memoria spaziale contro regolazione emozionale, rispettivamente12. Test che si basano su una risposta emotiva agli stimoli potrebbero non riflettere accuratamente la memoria spaziale alterata se funzioni di regolazione emozionale ippocampo ventrale sono anche colpite.
Il OLT è un test semplice ed efficace che fornisce una misura della memoria spaziale ippocampo-dipendente13. L'attività si basa sulla preferenza intrinseca di un animale per novità senza ulteriore rinforzo esterno e pertanto può in genere evitare le complicazioni connesse con le risposte emotive differenziale13. Il presente protocollo per OLT è presentato per i topi, ma è anche efficace in ratti se le dimensioni dell'apparecchiatura vengono ridimensionate in modo appropriato. Il protocollo è costituito da un mouse per un'arena aperta-campo-prova di ambientarsi e permettendogli quindi di indagare 2 oggetti in relazione a stimoli ambientali spaziale. Il mouse viene quindi rimosso dall'arena, e durante un ritardo (intervallo Inter-trial o ITI), uno degli oggetti viene spostato. Dopo l'ITI, il mouse è reintrodotto nell'Arena e ha permesso di esplorare liberamente. In generale, preferiscono topi novità, e se si ricorda la posizione degli oggetti da loro esposizione iniziale, che spenderanno più tempo indagando l'oggetto spostato. Animali con lesioni hippocampal hanno alterato apprendimento contestuale spaziale e di conseguenza non dimostrano alcuna preferenza per gli oggetti nel romanzo posizione14,15.
Il OLT può essere utilizzato indipendentemente o in combinazione con un ulteriore test di memoria che attinge l'attività neurale da regioni multiple del cervello, l'attività di riconoscimento di oggetto romanzo (NORT). Il NORT è identico a OLT fino alla fase di test, quando uno degli oggetti viene sostituito da un nuovo oggetto anziché essere spostati in una nuova posizione. Come è il caso con l'OLT, topi con buona memoria degli oggetti preferiranno spontaneamente indagando l'oggetto romanzo. In contrasto con memoria di posizione di oggetto, che si basa fortemente su substrati hippocampal, memoria di riconoscimento di oggetto sembra si basano su una varietà di regioni del cervello e il coinvolgimento dell'ippocampo è non fisso. Molti studi emerge che le lesioni hippocampal o inattivazione non pregiudicano romanzo oggetto preferenza10,13,16,17, mentre altri trovano l'opposto18,19. Tuttavia, è ancora un'attività comunemente utilizzata per valutare la funzione di memoria generale nei roditori.
Il protocollo presentato qui delinea i passaggi coinvolti nell'inizio e l'esecuzione l'OLT e NORT, che utilizzano un'arena aperta--test sul campo. Apparecchiatura di collaudo del comportamento commercialmente disponibile può essere dispendioso, particolarmente per i più piccoli laboratori. Questo protocollo comprende la progettazione e semplici passi per costruire arene in-House presso il costo minimo e senza strumenti specializzati. Inoltre, questo protocollo dettaglia l'ideale area di test comportamento, comprendendo la posizione di arene, indizi contestuali e sistema di registrazione video che pone le basi per l'attuazione dei protocolli OLT e NORT. Vengono presentati risultati rappresentativi per gli studi di successo così come viziati, sottolineando l'importanza di ottimizzare tutti i materiali e le procedure per ogni studio.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Descrizione</td>
			<td>Opzione</td>
			<td>Quantità</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parte a: strato acrilico - bianco opaco (0,635 cm x 40cm x 40.64 cm)</td>
			<td>Bordi indirizzati</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parte b: strato acrilico - bianco opaco (0,635 cm x 40cm x 41,91 cm)</td>
			<td>Bordi indirizzati</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parte c: strato acrilico - bianco opaco (0,635 cm x 41,91 x 41,91 cm)</td>
			<td>Bordi indirizzati</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acryllic cemento (1 pt.)</td>
			<td>NA</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Calibro 16 Hypo applicatore</td>
			<td>NA</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Piazza di combinazione</td>
			<td>NA</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Webcam HD</td>
			<td>NA</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Software di cattura video</td>
			<td>NA</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cavo prolunga USB 2.0</td>
			<td>NA</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Canalina per cavi</td>
			<td>NA</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Elenco dettagliato dei materiali e strumenti necessari per i test comportamentali.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sign White - 9% Translucent and Opaque Colored Cast Acrylic (Chemcast)</td>
			<td>TAP Plastics</td>
			<td>NA</td>
			<td>1/4&#34; x 15.75&#34; x 15.75&#34; with Routed Edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sign White - 9% Translucent and Opaque Colored Cast Acrylic (Chemcast)</td>
			<td>TAP Plastics</td>
			<td>NA</td>
			<td>1/4&#34; x 15.75&#34; x 16.5&#34; with Routed Edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sign White - 9% Translucent and Opaque Colored Cast Acrylic (Chemcast)</td>
			<td>TAP Plastics</td>
			<td>NA</td>
			<td>1/4&#34; x 16.5&#34; x 16.5&#34; with Routed Edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Acryllic Cement (1 pt.)</td>
			<td>TAP Plastics</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 Gauge Hypo Applicator</td>
			<td>TAP Plastics</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debut Video Capture Software Pro Edition</td>
			<td>NCH Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stanely SAE/Metric Comb Square</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>6R171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Logitech Pro Stream Webcam C922x</td>
			<td>CDW</td>
			<td>4429927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belkin 16&#39; USB 2.0 Active Extension Cable</td>
			<td>CDW</td>
			<td>570691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panduit Pan-Way LD Surface Raceway (8&#39;)</td>
			<td>CDW</td>
			<td>300902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatial/Environmental Cues</td>
			<td>Variable</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objects for testing</td>
			<td>Variable</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Variable</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Variable</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel object recognition and object location behavioral testing in mice on a budget

I test comportamentali etologico utili è un componente critico di qualsiasi studio che utilizza modelli murini per lo studio degli effetti cognitivi di vari cambiamenti fisiologici o patologici. L'attività di posizione oggetto (OLT) e l'attività di riconoscimento di oggetto romanzo (NORT) sono due attività comportamentale efficace comunemente usata per rivelare la funzione e la relativa salute di regioni specifiche del cervello coinvolte nella memoria. Mentre entrambi questi test sfruttare la preferenza inerente di topi per la novità di rivelare memoria per precedentemente incontrato oggetti, OLT valuta principalmente apprendimento spaziale, che si basa principalmente su attività hippocampal. NORT, al contrario, valuta l'apprendimento non-spaziale dell'identità dell'oggetto, che si basa su regioni multiple del cervello. Entrambe le attività richiedono un'arena aperta-campo-test, oggetti con valore intrinseco equivalente ai topi, appropriati stimoli ambientali e apparecchiature di registrazione video e il software. Sistemi disponibili in commercio, mentre conveniente, possono essere costosi. Questo manoscritto descrive in dettaglio un metodo semplice e conveniente per la costruzione le arene e creazione l'attrezzatura necessaria per eseguire l'OLT e NORT. Inoltre, il manoscritto descrive un efficiente protocollo di prova che incorpora sia OLT e NORT e fornisce metodi tipici per acquisizione dati e analisi, nonché i risultati rappresentativi. Completamento di questi test può fornire informazioni preziose nella funzione di memoria di vari sistemi di modello del mouse e valutare le regioni neurali sottostanti che supportano queste funzioni.

Nella figura 3 vengono forniti esempi di tipici risultati positivi e negativi ottenuti con topi C57Bl/6 adulti, maschi e femmine utilizzando questo protocollo6. L'interpretazione dei dati OLT e NORT sempre i dati aggregati di un gruppo (Vedi la discussione qui sotto). Tempo di ricerca per un singolo mouse non può essere interpretato come memoria o mancanza di memoria. Tuttavia, le prestazioni di un gruppo di topi (cioè., campioni multipli) può essere paragonato ad altri gruppi o i livelli di probabilità fissa utilizzando test statistici. Durante una prova tipica formazione, gruppi di topi non mostrano una significativa preferenza in media per uno degli oggetti come entrambi sono altrettanto romanzo e non hanno alcun valore intrinsecamente negativo o positivo per i topi (Figura 3A e 3B). Se i dati aggregati di un gruppo di topi mostrano significativa preferenza per un oggetto rispetto ad un altro durante l'allenamento, questi oggetti non dovrebbero essere utilizzati perché tale preferenza/avversione inerente verrà confondere i risultati nelle prove successive. Inoltre, il tempo di ricerca totale di tutti i topi dovrà soddisfare uno standard minimo (tradizionalmente fissato a 20 secondi21) e devono essere confrontati per assicurare che non c'è differenza basale nell'inchiesta che può influenzare le prove successive di memoria.
Durante il OLT, memoria per la posizione dell'oggetto viene riflesso da topi spendendo in media significativamente più del 50% del tempo di ricerca totale con l'oggetto spostato (Figura 3A). Se i tempi di indagine totale dei topi individuali variano notevolmente, i risultati sono meglio raffigurati come un indice di discriminazione per gli oggetti (Figura 3B). Il significativo incremento nell'indice medio discriminazione in Figura 3B indica che i topi trascorso più tempo con l'oggetto, dopo che era stato spostato. Se misurato dall'aumento della percentuale di tempo o indice di discriminazione, l'aumento nell'inchiesta dell'oggetto dopo che è stato spostato suggerisce che i topi ricordano dove l'oggetto è stato individuato durante l'allenamento.
L'ultima prova del presente protocollo valuta la memoria di riconoscimento di oggetto. Un esempio rappresentativo con un gruppo di topi dimostra una maggiore percentuale media di tempo di ricerca (Figura 3) così come indice di discriminazione positiva (Figura 3D) rispetto ai valori di controllo fisso del 50% e 0, rispettivamente. Come con i dati OLT, se c'è variabilità significativa nel tempo di ricerca totale fra i topi individuali, l'indice di discriminazione è probabilmente il metodo migliore per visualizzare questi dati. 3E figura Mostra un esempio di un confronto di 2 gruppi a NORT e alcune delle complicazioni statistiche che possono sorgere in questi test (vedi discussione). Mentre un esempio di uno t-test per il gruppo B Mostra indagine significativamente superiore al 50%, lo stesso test per gruppo A non. Questa constatazione non significa che A e B sono diversi gli uni dagli altri. Per determinare le differenze del gruppo, deve essere eseguito un separata test di Mann-Whitney due campioni non-parametrici confronto gruppi B ad A. Un test di Mann-Whitney non parametrica di due campioni di questi dati di gruppo rappresentativo presenta alcuna differenza significativa (p = 0,66) tra i due gruppi nella percentuale di tempo di ricerca di nuovi oggetti.
La OLT e NORT sono altamente sensibili al valore intrinseco degli oggetti sia una verifica approfondita dell'equivalenza di oggetto è necessaria garantire che non ci sono pregiudizi intrinseche che possono confondere i risultati. Figura 3F e 3G mostrano un esempio di selezione di oggetti inappropriati. In un progetto pilota con un campione di 4, i topi hanno mostrato una tendenza verso spendere meno del 50% del tempo di ricerca con un oggetto A quando accoppiato contro oggetto B (Figura 3F). Quando questi oggetti furono utilizzati in un NORT con un oggetto come l'oggetto romanzo ed un campione più grande di 16, topi trascorso significativamente inferiore al 50% del tempo di ricerca con un oggetto A (Figura 3). Questa avversione all'oggetto romanzo è facilmente riconoscibile qui come un difetto tecnico nell'esperimento ed esemplifica questo test pilota di oggetti per inerente preferenza/avversione è essenziale.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58593/58593fig3.jpg"> Figura 3: dati di test comportamentali con topi C57Bl/6 adulti wild type. (A) confronto del tempo di ricerca totale percentuale dell'oggetto spostato durante l'allenamento, prova contro l'aumento significativo di spettacoli OLT di indagine, dopo che l'oggetto spostato. p < 0,0001, t-test accoppiato. (B) risultati rappresentativi per indagine oggetto spostato durante l'allenamento e prove di OLT visualizzate come un indice di discriminazione allo stesso modo mostrano un aumento significativo nell'inchiesta dell'oggetto dopo che è stato spostato. p < 0,0001, t-test accoppiato. (C) tempo di indagine totale percentuale dell'oggetto romanzo a NORT Mostra significativa preferenza per indagare l'oggetto romanzo. * * p = 0,0024, uno-sample test t vs. 50%. (D) risultati rappresentativi per indagine oggetto romanzo a NORT visualizzata come un indice di discriminazione allo stesso modo mostrano preferenza per indagare l'oggetto romanzo. * * p = 0,0024, uno-sample test t vs 0. (E) risultati rappresentativi di un'analisi NORT che coinvolge due diversi gruppi di topi. Gruppo B differisce notevolmente dal 50% da uno-campione t-test (* * p = 0,0024), ma non lo fa gruppo A (p = 0.5837). In un'analisi separata, per confrontare i gruppi, un test di Mann-Whitney due campioni è usato a causa le dimensioni dei gruppi irregolari e nessuna differenza significativa nell'inchiesta è trovata (p = 0,66, ns). Il tempo per cento (F) con un oggetto durante gli studi di convalida in un campione di piccole dimensioni Mostra una tendenza verso avversione per l'oggetto. p = 0.2159, uno-campione t-test. (G) con una più grande dimensione del campione e l'oggetto da (F) utilizzato come oggetto di romanzo in un NORT, una significativa avversione per l'oggetto viene trovata, anche se è l'oggetto del romanzo. * p = 0.0270, uno-campione t-test. Questo è un esempio di un guasto tecnico nella selezione degli oggetti. I dati sono presentati come media ± SEM. dati da pannelli C-E sono adattati da una precedente pubblicazione6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58593/58593fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Novel Object Recognition and Object Location Behavioral Testing in Mice on a Budget

Qui forniamo un protocollo che include le istruzioni complete per l'istituzione economica della posizione oggetto murino e romanzo oggetto riconoscimento test comportamentali, tra cui progettazione, costo e costruzione di attrezzature necessarie, nonché esecuzione di test comportamentali, raccolta dati e analisi.

Riconoscimento di oggetti nuovi e oggetto posizione comportamentali test in topi con un budget limitato

Ethologically relevant behavioral testing is a critical component of any study that uses mouse models to study the cognitive effects of various ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla regolazione della memoria. Ad esempio, determiniamo il ruolo di proteine specifiche in memoria testando topi knockout transgenici in questi compiti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un modo rapido ed economico per condurre test di memoria in qualsiasi laboratorio.La dimostrazione della costruzione dell'arena è fondamentale, perché la saldatura a solvente produrrà risultati forti solo se eseguita con cura. Inizia acquisendo cinque fogli di acrilico, cemento acrilico e un applicatore ipo calibro 16. Rimuovere il rivestimento protettivo della carta dai fogli acrilici.Quindi asciugare tutti i materiali per confermare che le dimensioni sono corrette. Quindi, assemblare e caricare la siringa con cemento acrilico. Allineare il bordo lungo di una parete esterna con il bordo superiore della base e assicurarsi che siano perpendicolari l'uno all'altro utilizzando una combinazione o un quadrato macchinista.Quindi utilizzare la siringa per applicare una piccola e costante perla di cemento direttamente all'angolo dei due pezzi uniti. Tenere i due pezzi in posizione per cinque minuti fino a quando non sono inizialmente impostati. Ripetere gli stessi passaggi per attaccare l'altra parete esterna alla base.Quindi, attaccare due pareti interne, una alla volta, la base con cemento acrilico. Infine, utilizzare la siringa per applicare una piccola e costante perla di cemento direttamente all'angolo ora formato dalla parete esterna e dalla parete interna. Inizia la sessione di assualazione dividendo i topi in gruppi di quattro e ospitali in singole gabbie di detenzione pulite.Successivamente, portare un gruppo di topi nella sala prove e consentire loro di acclimatarsi per almeno 30 minuti. Dopo l'acclimatazione, inizia a registrare il video. Posiziona ogni topo nell'arena di fronte alle pareti dell'angolo di rilascio e consenti ai topi di esplorare liberamente le arene per sei minuti.Quindi, smetti di registrare il video e torna i topi nelle loro gabbie di detenzione pulite durante l'intervallo inter-trial. Pulire tutte le arene con i metodi di pulizia consigliati per la struttura animale, come pulire con 70%etanolo per ridurre al minimo gli spunti olfattivi. Infine, dopo aver completato un totale di tre sessioni di assuazione, riportare tutti i topi nelle loro gabbie di casa.Dopo 24 ore, portare lo stesso gruppo di topi nella sala prove e consentire loro di acclimatarsi nella sala prove per almeno 30 minuti, come fatto prima delle sessioni di assuazione il giorno precedente. Conduci la prova di allenamento usando due oggetti posizionati nell'arena. Affissi oggetti con nastro a doppia parte a sei per sei centimetri di distanza da due angoli non di rilascio, in modo che siano controbilanciati nell'arena.Consenti ai topi di indagare liberamente sull'arena e sugli oggetti per 10 minuti. Quindi interrompere la registrazione video. Riposizionare i topi nelle gabbie di detenzione pulite per 20 minuti e pulire le aree con etanolo.Successivamente, per eseguire l'attività di posizione dell'oggetto OLT, spostare uno degli oggetti utilizzati nella versione di valutazione del training in un nuovo angolo non di rilascio e apporre l'oggetto a sei centimetri da ogni parete di quell'angolo con nastro a doppia parte. Ripetere la stessa registrazione video dei topi nell'area per 10 minuti, come descritto in precedenza. Infine, per eseguire la nuova attività di riconoscimento degli oggetti NORT, sostituire l'oggetto che non è stato spostato durante l'OLT con un oggetto nuovo e apporre il nuovo oggetto a sei centimetri dalle due pareti dell'angolo con nastro a doppia parte.Ripetere la stessa registrazione video dei topi nell'area per 10 minuti, come descritto in precedenza. Durante l'OLT, la memoria per la posizione dell'oggetto si riflette in un gruppo di mouse che trascorrono, in media, molto più tempo con un oggetto dopo che si è spostato. Ciò può anche essere rappresentato come un aumento dell'indice di discriminazione.Nel NORT, la memoria per la posizione degli oggetti si riflette in un gruppo di topi che trascorrono, in media, significativamente più del 50% del tempo di indagine con il nuovo oggetto o mostrando un indice di discriminazione significativamente maggiore di zero. Scegliere oggetti per i quali i topi non hanno preferenze intrinseche è fondamentale. Ad esempio, in un test pilota con una dimensione del campione di quattro, i topi hanno mostrato una tendenza a trascorrere meno del 50% del tempo di indagine con l'oggetto A se abbinati all'oggetto B.Quando l'oggetto A è stato quindi utilizzato come nuovo oggetto in un NORT, con una dimensione del campione maggiore di 16, i topi hanno trascorso significativamente meno del 50% del tempo di indagine con l'oggetto A.Questi dati suggeriscono un'avversione intrinseca all'oggetto A.Durante questa procedura , è importante ricordare di pulire accuratamente tutti gli oggetti e le arene tra un uso e l'altro.In questo metodo, l'indagine sugli oggetti può essere segnata manualmente dai ricercatori o utilizzando software commerciale. Il software ha costi iniziali più elevati ma, una volta calibrato, può far risparmiare tempo e risorse finanziarie a lungo termine.

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