Name: novel object recognition and object location behavioral testing in mice on a budget
Uploaded: 2018-11-20T15:00:00
Duration: 5 min 57 s
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Este trabajo fue financiado por R00 NS089938 de NIH y financiación de lesión cerebral crónica y descubrimiento de temas en la Universidad Estatal de Ohio a EDK.

El siguiente protocolo ha sido aprobado por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) en la Universidad Estatal de Ohio (OSU).
1. edificio las Arenas
<ol><li>Los materiales descritos en la tabla 1de la orden: cinco hojas de acrílico, cemento acrílico y 16 G hypo del aplicador.</li>
	<li>Use equipo de seguridad apropiado según las instrucciones del fabricante, que pueden incluir ojos, piel y otros tipos de protección.</li>
	<li>Retire el recubrimiento del papel protector de las hojas de acrílico.</li>
	<li>Dry fit todos los materiales para confirmar que los tamaños son correctos (figura 1A).</li>
	<li>Montar y cargar la jeringa con cemento acrílico.</li>
	<li>Alinee el borde largo de una pared exterior (parte B) con un borde superior de la base (parte C) y asegurarse de que son perpendiculares entre sí utilizando un cuadrado de combinación o maquinista.</li>
	<li>Usando la jeringa, aplique una gota pequeña y constante de cemento directamente a la esquina de las dos piezas se.</li>
	<li>Mantener las dos piezas (partes B y C) en lugar hasta que se fijaron inicialmente (aproximadamente 5 min). Nota: Por lo general, serán 80% templado en 24 h, pero Asamblea puede continuar después de 5 minutos.</li>
	<li>Repita los pasos 1.5 – 1.7 con la otra pared exterior (parte B) en la misma base.</li>
	<li>Coloque las dos paredes internas (parte A), uno a la vez, en la base de pasos 1.5 – 1.7.</li>
	<li>Además, utilice la jeringa para aplicar un pequeño y constante grano de cemento directamente a la esquina ahora está formada por la pared exterior (parte B) y el interior de la pared (parte A).</li>
	<li>Mantener estas piezas en su lugar por 5 minutos.</li>
	<li>Después de 24 – 48 horas, proceda a configurar el entorno de análisis conductual.</li>
</ol>2. configurar el entorno de pruebas de comportamiento y equipo
<ol><li>Coloque señales ambientales (como se describe en la sección discusión) frente a la unos a otros y frente a las arenas en el área de pruebas (figura 1B).</li>
	<li>Organizar las cuatro arenas prueba en forma de 2 por 2 en el piso o mesa resistente a distancias adecuadas de las señales y la cámara para maximizar la entrada visual a los ratones (figura 1B).</li>
	<li>Verifique la línea de visión con un palito de metro apoyado de cada piso de la arena sobre la pared hacia las señales para confirmar que estas distancias entre las arenas y las señales son adecuadas.</li>
	<li>Determinar la longitud del camino óptico óptimo que permite la documentación de todos cuatro arenas ajustando la altura de la cámara o la altura de la mesa. (Figura 1B).</li>
	<li>Conecte la cámara a un Cable de extensión USB.</li>
	<li>Con canales de cable, pase el cable en el techo y hacia abajo de una pared a un equipo que ejecuta video software de captura.</li>
	<li>Ocultar el ordenador detrás de una cortina que se separa los ratones en el área de pruebas del investigador (figura 1).</li>
	<li>Montar 4 de al menos 3 objetos diferentes que son aproximadamente de 2 a 5 cm en longitud y anchura y de hasta 10 cm de altura a utilizar para la prueba (figura 1).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58593/58593fig1.jpg"> Figura 1: comportamiento preparación prueba. (A) abrir-campo-pruebas de montaje de arena con la parte A correspondiente a la pared interna, B como la pared exterior y C como la base. El acabado arena tendrá dos paredes exteriores (piezas B) que se ejecutan todo el filo de la base y dos muros interiores (partes A) que entre las paredes exteriores en los bordes adyacentes de la base (parte C). Todas las paredes descansará sobre la base. (B) arreglo representante de arenas en una mesa alta de 0,62 m, señales ambientales 60 x 90 cm, luces y una cámara para un área de pruebas que permite la captura de los cuatro arenas simultáneamente. (C) A la cortina oculta del experimentador y del sistema de los ratones durante los ensayos. Las luces de arriba están en los fines de tomar esta fotografía, pero durante la prueba, solamente las lámparas de pie son en. Además, una de las señales ambientales se ha eliminado esta fotografía de la zona de pruebas, pero durante la prueba, hay una pista cuarto delante de las arenas, frente a la señal todos negra detrás de la mesa. Objeto representante (D) A (y la regla de escala) es apropiado para OLT o NORT pruebas con ratones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58593/58593fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="9"><li>Validar estos objetos.<ol>
<li>Obtener un mínimo de 8 ratones de tipo salvaje en el sexo, cepa y edad Grupo representante de los ratones experimentales que se utilizarán (e.g., 6 a 9 semanas de edad hembra y macho C57Bl/6 ratones).</li>
		<li>Manejar todos los ratones diariamente durante 1 min en el transcurso de 3 – 5 días antes de la prueba.</li>
		<li>Ratones se dividen en grupos de 4 y, si no están ya solos alojados, muévalos a persona limpia con jaulas.</li>
		<li>Poner en el cuarto de prueba y que puedan aclimatarse al menos 30 minutos. Nota: Presencia del experimentador en la sala durante estos 30 minutos reduce el estrés sobre los ratones durante la tarea, particularmente si el experimentador es hombre20.</li>
		<li>Después se realiza la aclimatación y el experimentador está listo para comenzar, comenzar a grabar el video.</li>
		<li>Coloque cada ratón frente a las paredes de una esquina de la arena (llamada la esquina del lanzamiento) (figura 2A).</li>
		<li>Permitir que los ratones explorar las arenas libremente durante 10 minutos.</li>
		<li>Detener la grabación del video.</li>
		<li>Volver ratones a sus jaulas de tenencia limpio para una duración de 20 minutos.</li>
		<li>Limpia todas las arenas con Animalario de limpieza recomiendan métodos, tales como limpiar con etanol al 70% para reducir señales olfativas antes del próximo uso.</li>
		<li>Usando cinta de doble cara, Coloque 2 objetos diferentes cerca de 2 esquinas de no liberación tal que los objetos se contrabalancean en la arena y 6 x 6 cm2 de cada pared de la esquina (figura 2B).</li>
		<li>Empezar a grabar el video.</li>
		<li>Coloque cada ratón frente a los muros en el ángulo de lanzamiento.</li>
		<li>Permiten ratones investigar la arena y objetos libremente durante 10 minutos.</li>
		<li>Detener la grabación del video.</li>
		<li>Ratones del lugar de nuevo en sus jaulas de tenencia limpio para una duración de 20 minutos.</li>
		<li>Limpia todas las arenas y objetos con Animalario de limpieza recomiendan métodos tales como limpiar con etanol al 70% para reducir señales olfativas.</li>
		<li>Repetir los ensayos de entrenamiento con 2 nuevos objetos fijados en los mismos lugares hasta que todos los objetos (al menos tres objetos diferentes si realización de OLT y norte) han sido probados con cada ratón.</li>
		<li>Excluir los objetos que permiten ratones a sentarse en la parte superior del objeto.</li>
		<li>Analizar el tiempo de investigación de cada ratón con cada objeto según el paso 4.</li>
		<li>Excluir los objetos que tienen un valor intrínseco negativo o positivo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. realización de la prueba de comportamiento
<ol><li>Una semana antes de la prueba: familiarización a personas que realizan las pruebas de comportamiento<ol>
<li>Manejar adultos 6 a 9 semanas de edad hembras y machos C57Bl/6 ratones diariamente durante 1 min en el transcurso de 3 – 5 días antes de la prueba.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Día 1: sesiones de habituación<ol>
<li>Ratones se dividen en grupos de 4 y, si no están ya solos alojados, muévalos a persona limpia con jaulas.</li>
		<li>Traerlos a la sala de pruebas y que puedan aclimatarse a la sala de pruebas durante al menos 30 minutos. Nota: presencia del experimentador en la sala durante estos 30 minutos reduce el estrés sobre los ratones durante la tarea, particularmente si el experimentador es hombre20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después se realiza la aclimatación y el experimentador está listo para comenzar, comenzar a grabar el video.</li>
	<li>Coloque cada ratón en la arena (un ratón por arena) frente a las paredes de la esquina de la liberación (figura 2A).</li>
	<li>Permitir que los ratones explorar las arenas libremente durante 6 minutos.</li>
	<li>Detener la grabación del video.</li>
	<li>Volver ratones a sus jaulas limpias de explotación durante el intervalo entre ensayo (ITI).</li>
	<li>Limpia todas las arenas con Animalario de limpieza recomiendan métodos tales como limpiar con etanol al 70% para reducir señales olfativas.</li>
	<li>Repita los pasos 3.3-3.9 dos veces más para un total de 3 sesiones de habituación para cada ratón.</li>
	<li>Devolver todos los ratones a sus jaulas hogar.</li>
	<li>Limpia todas las arenas con Animalario de limpieza recomiendan métodos tales como limpiar con etanol al 70% para reducir señales olfativas antes de usarlo al día siguiente.</li>
	<li>: 2 entrenamiento dias, OLT, NORT Nota: El norte es una prueba opcional.<ol>
<li>Después de 24 h, hacer el mismo grupo de ratones en el cuarto de prueba y que puedan aclimatarse a la sala de pruebas durante al menos 30 minutos como hizo antes de las sesiones de habituación el día anterior.</li>
		<li>Realizar un ensayo de formación de 2 objetos colocados en la arena (figura 2B).<ol>
<li>Usando cinta de doble cara, fijar objetos 6 x 6 cm2 de 2 esquinas de no liberación tal que se contrabalancean en la arena.</li>
			<li>Empezar a grabar el video.</li>
			<li>Coloque cada ratón frente a las paredes de la esquina de liberación como hecho durante las sesiones de habituación.</li>
			<li>Permiten ratones investigar la arena y objetos libremente durante 10 minutos.</li>
			<li>Detener la grabación del video.</li>
			<li>Ratones de lugar volver en sus jaulas de tenencia limpio un ITI de 20 minutos.</li>
			<li>Limpia todas las arenas y objetos con Animalario de limpieza recomiendan métodos tales como limpiar con etanol al 70% para reducir señales olfativas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Realizar la OLT.<ol>
<li>Mueve uno de los objetos utilizados en la formación de la prueba a un nuevo rincón de no liberación y fije el objeto de 6 cm de cada pared de la esquina con cinta de doble cara (figura 2). Nota: El objeto debe permanecer donde estaba durante el entrenamiento de la prueba.</li>
			<li>Empezar a grabar el video.</li>
			<li>Coloque cada ratón frente a los muros en el ángulo de lanzamiento.</li>
			<li>Permiten ratones investigar los objetos durante 10 minutos.</li>
			<li>Detener la grabación del video.</li>
			<li>Ratones de lugar volver en sus jaulas de tenencia limpio un ITI de 20 minutos.</li>
			<li>Limpia todas las arenas y objetos con Animalario de limpieza recomiendan métodos tales como limpiar con etanol al 70% para reducir señales olfativas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Realizar el NORT.<ol>
<li>Vuelva a colocar el objeto que no se ha movido durante la OLT con un objeto novedoso y fijar el nuevo objeto 6 cm de las dos paredes de la esquina con cinta de doble cara (Figura 2D).</li>
			<li>Empezar a grabar el video.</li>
			<li>Coloque cada ratón frente a los muros en el ángulo de lanzamiento.</li>
			<li>Permiten ratones investigar los objetos durante 10 minutos.</li>
			<li>Detener la grabación del video.</li>
			<li>Volver a colocar ratones en sus jaulas hogar.</li>
			<li>Limpia todas las arenas y objetos con Animalario de limpieza recomiendan métodos tales como limpiar con etanol al 70% para reducir señales olfativas antes de usarlo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58593/58593fig2.jpg"> Figura 2: configuración de Arena ensayos. Campo abierto (A) pruebas de arena sin objetos para sesiones de habituación. La flecha negra indica un lanzamiento de esquina. Este rincón debe ser la misma posición relativa en cada arena y ser constante para cada ratón sometido a prueba y para cada prueba. (B) para el ensayo de formación, dos objetos distintos están asegurados a campo abierto en 6 x 6 cm de los muros respectivos. (C) de la OLT, un objeto se mueve a una nueva ubicación, también de 6 x 6 cm de las paredes y no la liberación. (D) para el norte, el objeto que se fija en la OLT se sustituye por un objeto nuevo, mientras el objeto movido desde la OLT es ahora el objeto familiar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58593/58593fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
4. Análisis de los datos de prueba de comportamiento
Nota: Análisis de vídeo idealmente deben ser completada por al menos dos experimentadores independientes.
<ol><li>Abra el archivo de vídeo.</li>
	<li>Aplique un círculo transparente que proporciona un borde de 2 cm alrededor de cada objeto sobre la pantalla para ayudar a determinar la investigación activa. Utilizar una imagen de archivo de vídeo con una regla colocada en una arena para calibrar esta rejilla.</li>
	<li>Observar comportamiento del ratón y registrar los tiempos en que el ratón está investigando activamente el objeto, que consiste en su nariz apuntada hacia el objeto a una distancia máxima de 2 cm de ese objeto.<ol>
<li>Registro de la marca de tiempo del ratón comienza a investigar un objeto y la marca de tiempo cuando deje de investigar ese objeto.</li>
		<li>Repetir este proceso para ambos objetos en la arena para la duración de la prueba.</li>
		<li>Calcular el tiempo acumulado que el ratón investiga cada objeto restando la hora de salida desde el tiempo de parada para cada instancia de investigación del objeto, y añadiendo todos esos valores.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcular el por ciento del tiempo total de la investigación o el índice de discriminación con las siguientes fórmulas:<ol>
<li>Calcular el por ciento del tiempo total de la investigación = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58593/58593eq1.jpg"> Nota: Un valor superior al 50% indica una mayor investigación de la nueva ubicación u objeto.</li>
		<li>Calcular el índice de discriminación = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58593/58593eq2.jpg"> Nota: Un valor positivo indica más tiempo investigando el nuevo objeto. Un índice de discriminación de cero indica el tiempo igual con ambos objetos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Representar gráficamente los resultados y análisis estadísticos completos utilizando una prueba t o ANOVA como apropiado para el número de grupos que se comparan.</li>
</ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ASA's+Statement+on+p-Values:+Context,+Process,+and+Purpose.">The ASA's Statement on p-Values: Context, Process, and Purpose.</a> The American Statistician. 70 (2), 129-133 (2016).</li><li>Ranstam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+the+P-value+culture+is+bad+and+confidence+intervals+a+better+alternative.">Why the P-value culture is bad and confidence intervals a better alternative.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 20 (8), 805-808 (2012).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las pruebas cognitivas eficaces aislar y evaluación la función neuronal de las regiones específicas del cerebro mediante el examen de comportamiento en un ambiente controlado1. En los seres humanos, tareas específicas han sido diseñadas para evaluar el rendimiento de regiones específicas del cerebro, como la tarjeta Wisconsin que clasifica tarea para la función prefrontal o los pares asociados aprendizaje prueba de la Cambridge Test automatizado batería neuropsicológica ( CANTAB) para función hippocampal2,3. Estas pruebas están diseñadas para el estudio de las funciones de las regiones específicas del cerebro en los seres humanos mediante la evaluación de conductas que resultan de la actividad neuronal de las regiones. El objetivo final de la investigación biomédica más es la mejora de la salud humana; sin embargo, muchos estudios de la función cerebral en salud o enfermedad no pueden realizarse éticamente con participantes humanos. Para estudios que no pueden utilizar a los participantes humanos, pequeños roedores como ratones son a menudo el modelo de elección. Usando modelos de ratón permite el control directo sobre las manipulaciones experimentales incluyendo alteración de la expresión génica, inducción de lesiones o incluso modulación de la actividad del circuito a través de técnicas de optogenetic. Pruebas de comportamiento de los ratones, similares a pruebas humanas, tiene como objetivo evaluar el efecto de variables experimentales sobre la función cerebral mediante la medición de comportamientos que dependen de regiones específicas.
El hipocampo es una estructura esencial para la formación de la memoria en humanos y roedores4. Más específicamente, el hipocampo desempeña un papel crítico en la memoria declarativa, que implica las representaciones relacionales, pero memoria no procedimental, que se basa en los centros motores del cerebro4. Función de memoria hipocampal ha sido un foco de estudio a través de muchos campos de la neurociencia porque es exquisitamente sensible a la perturbación. Perturbaciones negativas que van desde el estrés prolongado y el envejecimiento a las convulsiones y los accidentes cerebrovasculares se asocian con daño hippocampal5. En cambio, intervenciones positivas, tales como interacción social, enriquecimiento ambiental física o ejercicio, mejoran la función hippocampal6,7,8. Estudios de roedores con la prueba de la memoria de hippocampal pueden revelar la visión de los mediadores celulares y moleculares de la memoria, así como los efectos de diferentes intervenciones ambientales en la función hippocampal.
En roedores, se han desarrollado varias pruebas para estudiar el aprendizaje dependiente del hipocampo y la memoria9,10,11. Puede ser ampliamente subdivididas en tareas que requieren un estímulo con Valencia emocional para provocar un cambio en el comportamiento y las tareas que se basan en la preferencia de roedor para investigar nuevos estímulos11. Condicionamiento de miedo contextual, por ejemplo, pares de un estímulo desagradable (choque de pie) con un contexto ambiental y, más tarde pruebas de memoria para el contexto mediante la medición de miedo inducido congelación comportamiento9,11. El laberinto acuático de Morris y su contraparte seco, el laberinto de Barnes, utilizan Refuerzos externos negativos para promover aprendizaje espacial4,11. En cada caso, roedores buscan escapar de una situación aversiva, se sumerge en agua fría o expuestos sobre una plataforma luminosa, respectivamente. El laberinto radial del brazo, en cambio, se basa en refuerzo positivo como animales utilizan el comportamiento natural de alimentación juntado con la memoria espacial para recuperar pequeñas recompensas4,11. Estas tareas son ampliamente utilizadas y han aportado conocimientos fundamentales acerca de la memoria de hippocampal. Sin embargo, negativos y positivos de refuerzos externos o estímulos inductores de miedo como descarga añadir un componente emocional a estos comportamiento prueba que en algunos casos pueden ser indeseables. Por ejemplo, el hipocampo dorsal y ventral está asociado con distintas funciones, memoria espacial y regulación emocional, respectivamente12. Pruebas que dependen de una respuesta emocional a los estímulos no pueden reflejar exactamente deteriorada memoria espacial si las funciones de regulación emocional hipocampo ventral también se ven afectadas.
La OLT es un examen simple y eficaz que proporciona una medida de memoria espacial dependiente del hipocampo13. La tarea se basa en preferencia intrínseca de un animal por la novedad sin refuerzo externo adicional y por lo tanto, normalmente puede evitar las complicaciones asociadas con respuestas emocionales diferencial13. El presente Protocolo para OLT se presenta para los ratones, pero también es eficaz en las ratas si las dimensiones del equipo son escaladas apropiadamente. El protocolo consiste en aclimate un ratón a un escenario de pruebas de campo abierto y luego lo que le permite investigar 2 objetos en lo referente a señales ambientales espaciales. El ratón se retira luego de la arena, y durante un retraso (intervalo entre ensayo o ITI), uno de los objetos se mueve. Después del ITI, el ratón es había reintroducido a la arena y permitió explorar libremente. En general, ratones prefieren la novedad, y si recuerda la ubicación de los objetos de su exposición inicial, van a pasar más tiempo investigando el objeto movido. Animales con lesiones hipocampales han deteriorado aprendizaje contextual espacial y por lo tanto no demuestran ninguna preferencia por objetos en la nueva ubicación14,15.
El OLT puede utilizarse independientemente o en combinación con una prueba adicional de la memoria que se basa en la actividad de los nervios de varias regiones del cerebro, la tarea de reconocimiento de objeto nuevo (norte). El norte es idéntica a la OLT hasta la fase de prueba, cuando uno de los objetos es reemplazado por un objeto novedoso en lugar de moverlo a una nueva ubicación. Como es el caso de la OLT, ratones con buena memoria de los objetos espontáneamente prefieren investigar el objeto nuevo. En contraste con memoria de ubicación de objeto, que depende en gran medida sustratos hipocampales, memoria de reconocimiento de objetos parece depender de una variedad de regiones del cerebro y la implicación del hipocampo es sin resolver. Muchos estudios reportan que las lesiones hipocampales o inactivación no afecta novela objeto preferencia10,13,16,17, mientras que otros encuentran el opuesto de18,19. Sin embargo, sigue siendo una tarea comúnmente utilizada para evaluar la función de memoria general en roedores.
El protocolo presentado aquí delinea los pasos necesarios para iniciar y ejecutar la OLT y NORT, que utilizan un escenario de pruebas de campo abierto. Equipo de prueba de comportamiento disponible comercialmente puede ser prohibitiva, especialmente para los laboratorios más pequeños. Este protocolo incluye el diseño y pasos sencillos para construir arenas internos con un costo mínimo y sin necesidad de herramientas especializadas. Además, este protocolo detalla el área de pruebas de comportamiento ideal, incluyendo colocación de arenas, claves contextuales y grabación de vídeo que fija la etapa para la implementación de los protocolos OLT y NORT. Se presentan resultados representativos para estudios acertados como erróneos, haciendo hincapié en la importancia de la optimización de todos los materiales y procedimientos de cada estudio.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Descripción</td>
			<td>Opción</td>
			<td>Cantidad</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parte A: la hoja de acrílico - blanco opaco (0,635 cm x 40 cm x 40.64 cm)</td>
			<td>Bordes de enrutado</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parte B: hoja de acrílico - blanco opaco (0,635 cm x 40 cm x 41.91 cm)</td>
			<td>Bordes de enrutado</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parte C: hoja de acrílico - blanco opaco (0,635 x 41,91 cm x 41.91 cm)</td>
			<td>Bordes de enrutado</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cemento acrílico (1 pt.)</td>
			<td>NA</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aplicador de Hypo calibre 16</td>
			<td>NA</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Escuadra de combinación</td>
			<td>NA</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Webcam HD</td>
			<td>NA</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Software de captura de vídeo</td>
			<td>NA</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>USB 2.0 Cable de extensión</td>
			<td>NA</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Conducto del cable</td>
			<td>NA</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Lista detallada de materiales y equipos necesarios para las pruebas de comportamiento.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sign White - 9% Translucent and Opaque Colored Cast Acrylic (Chemcast)</td>
			<td>TAP Plastics</td>
			<td>NA</td>
			<td>1/4&#34; x 15.75&#34; x 15.75&#34; with Routed Edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sign White - 9% Translucent and Opaque Colored Cast Acrylic (Chemcast)</td>
			<td>TAP Plastics</td>
			<td>NA</td>
			<td>1/4&#34; x 15.75&#34; x 16.5&#34; with Routed Edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sign White - 9% Translucent and Opaque Colored Cast Acrylic (Chemcast)</td>
			<td>TAP Plastics</td>
			<td>NA</td>
			<td>1/4&#34; x 16.5&#34; x 16.5&#34; with Routed Edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Acryllic Cement (1 pt.)</td>
			<td>TAP Plastics</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 Gauge Hypo Applicator</td>
			<td>TAP Plastics</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debut Video Capture Software Pro Edition</td>
			<td>NCH Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stanely SAE/Metric Comb Square</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>6R171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Logitech Pro Stream Webcam C922x</td>
			<td>CDW</td>
			<td>4429927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belkin 16&#39; USB 2.0 Active Extension Cable</td>
			<td>CDW</td>
			<td>570691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panduit Pan-Way LD Surface Raceway (8&#39;)</td>
			<td>CDW</td>
			<td>300902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatial/Environmental Cues</td>
			<td>Variable</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objects for testing</td>
			<td>Variable</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Variable</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Variable</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel object recognition and object location behavioral testing in mice on a budget

Pruebas de comportamiento etológico relevante son un componente crítico de cualquier estudio que utiliza modelos de ratón para el estudio de los efectos cognitivos de diversos cambios fisiológicos o patológicos. La tarea de ubicación de objeto (OLT) y la tarea de reconocimiento de objeto nuevo (norte) son dos tareas conductuales eficaces utilizadas para revelar la función y la salud relativa de regiones específicas del cerebro implicadas en la memoria. Mientras que ambas de estas pruebas explotan la preferencia inherente de ratones por la novedad revelar previamente memoria para encontraron objetos, el OLT principalmente evalúa aprendizaje espacial, que depende en gran medida actividad hipocampal. El norte, en cambio, evalúa aprendizaje no espacial de identidad de objeto, que se basa en múltiples regiones del cerebro. Ambas tareas requieren de un escenario de pruebas de campo abierto, objetos de valor intrínseco equivalente a ratones, señales ambientales adecuados y equipos de grabación de vídeo y el software. Sistemas disponibles comercialmente, aunque conveniente, pueden ser costoso. Este manuscrito detalla un método simple y rentable para la creación de las arenas y configurar el equipo necesario para realizar la OLT y NORT. Además, el manuscrito describe un protocolo de pruebas eficiente que incorpora OLT y NORT y proporciona métodos típicos para adquisición de datos y análisis, así como resultados representativos. Superación de estas pruebas puede proporcionar información valiosa sobre la función de memoria de varios sistemas del modelo de ratón y valora las regiones neuronales subyacentes que apoyan estas funciones.

La figura 3 muestra ejemplos de resultados positivos y negativos típicos obtenidos con machos y hembras adultos ratones C57Bl/6 usando este protocolo6. Interpretación de datos OLT y NORT siempre se aplica a los datos agregados de un grupo (ver discusión más abajo). Tiempo de investigación para un ratón no puede interpretarse como la memoria o falta de memoria. Sin embargo, el rendimiento de un grupo de ratones (i.e., las muestras múltiples) puede ser comparado a otros grupos o a los niveles de oportunidad fija mediante pruebas estadísticas. Durante un ensayo de entrenamiento típico, grupos de ratones no muestran una preferencia significativa en promedio para cualquiera de los objetos ya que son ambos igualmente novedosos y no tienen ningún valor intrínsecamente positiva o negativa a los ratones (Figura 3A y 3B). Si los datos agregados de un grupo de ratones muestran gran preferencia por un objeto sobre otro durante el entrenamiento, estos objetos no puede usarse porque esa preferencia/aversión inherente a confundir resultados en los ensayos posteriores. Además, el tiempo total de la investigación de todos los ratones debe cumplir con un estándar mínimo (tradicionalmente establecido en 20 segundos21) y deben ser comparados para asegurar que no hay diferencias de base en investigación que puede afectar a posteriores pruebas de memoria.
Durante la OLT, memoria para la ubicación del objeto se refleja en ratones gastando en promedio significativamente más del 50% del tiempo total de la investigación con el objeto movido (Figura 3A). Si los tiempos de investigación total de los ratones individuales varían mucho, los resultados son mejor representados como un índice de discriminación de los objetos (figura 3B). El aumento significativo en el índice de discriminación promedio en la figura 3B indica que los ratones pasaron más tiempo con el objeto después de que se había movido. Tanto si se mide por el aumento en el tiempo porcentaje o índice de discriminación, el aumento en la investigación del objeto después de se sugiere que los ratones recuerdan donde estaba situado el objeto durante el entrenamiento.
El último juicio de este protocolo evalúa memoria de reconocimiento de objeto. Un ejemplo representativo con un grupo de ratones muestra un mayor porcentaje promedio de tiempo de investigación (figura 3) así como el índice de discriminación positiva (figura 3D) en comparación con los valores de control fijo de 50% y 0, respectivamente. Como con los datos de la OLT, si existe importante variabilidad en el tiempo de investigación total entre ratones individuales, el índice de discriminación es probablemente el mejor método para visualizar estos datos. Figura 3E muestra un ejemplo de una comparación de 2 grupos en el norte y algunas de las estadísticas complicaciones que pueden surgir en estas pruebas (ver discusión). Mientras que un one-sample t-test para el grupo B muestra investigación significativamente por encima del 50%, la misma prueba para el grupo A no. Este hallazgo no significa que A y B son diferentes unos de otros. Para determinar las diferencias de grupo, debe realizarse una separado dos muestras prueba no paramétrica Mann-Whitney comparar grupos B a la A. Una prueba no paramétrica de Mann-Whitney de dos muestras de datos de este grupo representativo no muestra ninguna diferencia significativa (p = 0,66) entre los dos grupos en porcentaje de tiempo de investigación del nuevo objeto.
Tanto el OLT y el norte son muy sensibles al valor intrínseco de los objetos y realizar pruebas minuciosas de la equivalencia del objeto son necesario para asegurar que no hay ningún sesgo intrínseco que puede confundir los resultados. Figura 3F y 3 G muestran un ejemplo de selección de objeto inadecuado. En una prueba piloto con una muestra de tamaño de 4, los ratones mostraron una tendencia a gastar menos del 50% del tiempo de investigación con objeto de A cuando emparejado contra el objeto B (figura 3F). Cuando estos objetos fueron utilizados luego en NORT con objeto A como el objeto novedoso y un tamaño de muestra más grande de 16, ratones pasaron significativamente menos del 50% del tiempo de investigación con el objeto A (figura 3). Esta aversión hacia el objeto nuevo es fácilmente reconocible como un defecto técnico en el experimento y ejemplifica por qué pruebas piloto de los objetos de preferencia/aversión inherente son esencial.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58593/58593fig3.jpg"> Figura 3: comportamiento datos de prueba con ratones C57Bl/6 adultos de tipo salvaje. (A) comparación de tiempo de investigación total porcentaje del objeto movido durante el entrenamiento de prueba versus el OLT demuestra aumento significativo de investigación, después de que el objeto se movió. p < 0.0001, prueba de t pareada. (B) resultados representativos para la investigación del objeto movido durante el entrenamiento y ensayos de OLT aparece como un índice de discriminación del mismo modo muestran un aumento significativo en la investigación del objeto después de que se mueva. p < 0.0001, prueba de t pareada. (C) tiempo de investigación total porcentaje del nuevo objeto en el norte muestra preferencia significativa para investigar el objeto nuevo. ** p = 0.0024, one-sample t-test vs. el 50%. (D) resultados representativos para la investigación de objeto nuevo en el norte aparece como un índice de discriminación del mismo modo muestran preferencia por investigar el objeto novedoso. ** p = 0.0024, one-sample t-test vs 0. (E) resultados representativos de un análisis de norte con dos grupos diferentes de ratones. Grupo B difiere significativamente del 50% por one-sample t-test (** p = 0.0024), pero no grupo A (p = 0.5837). En un análisis separado, para comparar grupos, se utiliza un test de dos muestras de Mann-Whitney debido a los tamaños de grupo irregular y no encontraron diferencias significativas en investigación es (p = 0,66, ns). (F) porcentaje tiempo con un objeto durante los ensayos de validación en una muestra de tamaño pequeño muestra una tendencia a la aversión hacia el objeto. p = 0.2159, one-sample t-test. (G) con un tamaño de muestra más grande y el objeto de (F) usado como un objeto nuevo en un norte, se encuentra una importante aversión al objeto, a pesar de que es el objeto de la novela. * p = 0.0270, one-sample t-test. Este es un ejemplo de un fallo técnico en la selección de objetos. Los datos se presentan como promedio ± SEM. datos de paneles C E se adaptan de una anterior publicación6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58593/58593fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Novel Object Recognition and Object Location Behavioral Testing in Mice on a Budget

Aquí proporcionamos un protocolo que incluye instrucciones completa para el establecimiento económico de murino objeto ubicación y objeto novedoso reconocimiento pruebas de comportamiento, incluyendo el diseño, costo y construcción de equipo necesario así como ejecución de pruebas de comportamiento, recolección de datos y análisis.

Reconocimiento de objetos nuevos y ubicación del objeto conductual en ratones en un presupuesto

Ethologically relevant behavioral testing is a critical component of any study that uses mouse models to study the cognitive effects of various ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la regulación de la memoria. Por ejemplo, determinamos el papel de proteínas específicas en la memoria probando ratones noqueadores transgénicos en estas tareas. La principal ventaja de esta técnica es que es una forma rápida y rentable de realizar pruebas de memoria en cualquier laboratorio.La demostración de la construcción de la arena es crítica, ya que la soldadura con disolvente sólo producirá resultados fuertes si se realiza con cuidado. Comience por adquirir cinco láminas de acrílico, cemento acrílico y un aplicador hipoativo calibre 16. Retire el recubrimiento protector del papel de las láminas de acrílico.A continuación, se ajuste en seco a todos los materiales para confirmar que los tamaños son correctos. A continuación, ensamble y cargue la jeringa con cemento acrílico. Alinee el borde largo de un muro exterior con el borde superior de la base y asegúrese de que son perpendiculares entre sí utilizando una combinación o un cuadrado maquinista.A continuación, utilice la jeringa para aplicar un cordón pequeño y constante de cemento directamente en la esquina de las dos piezas que se unen. Mantenga las dos piezas en su lugar durante cinco minutos hasta que se establezcan inicialmente. Repita los mismos pasos para fijar la otra pared exterior a la base.A continuación, unir dos paredes interiores, una a la vez, la base con cemento acrílico. Por último, utilice la jeringa para aplicar un cordón pequeño y constante de cemento directamente a la esquina que ahora está formado por la pared exterior y la pared interior. Comience la sesión de habituación dividiendo los ratones en grupos de cuatro, y albergándolos en jaulas individuales de retención limpia.A continuación, lleve un grupo de ratones a la sala de pruebas y déle que se aclimaten durante al menos 30 minutos. Después de la aclimatación, comience a grabar el video. Coloca cada ratón en la arena frente a las paredes de la esquina de liberación, y deja que los ratones exploren las arenas libremente durante seis minutos.A continuación, deje de grabar el vídeo y devuelva los ratones a sus jaulas de sujeción limpias durante el intervalo entre pruebas. Limpie todas las arenas con métodos de limpieza recomendados por las instalaciones de animales, como limpiar con 70% de etanol para minimizar las señales olfativas. Finalmente, después de completar un total de tres sesiones de habituación, devolver todos los ratones a sus jaulas de origen.Después de 24 horas, lleve el mismo grupo de ratones a la sala de pruebas y déles que se aclimaten a la sala de pruebas durante al menos 30 minutos, como se hizo antes de las sesiones de habituación del día anterior. Lleva a cabo la prueba de entrenamiento utilizando dos objetos colocados en la arena. Fije objetos con cinta adhesiva de doble cara de seis por seis centímetros de distancia de dos esquinas que no sean de liberación, de modo que se contrarresten en la arena.Permita que los ratones investiguen la arena y los objetos libremente durante 10 minutos. A continuación, detenga la grabación de vídeo. Coloque los ratones de nuevo en sus jaulas limpias durante 20 minutos y limpie las áreas con etanol.A continuación, para realizar la tarea de ubicación de objetos OLT, mueva uno de los objetos utilizados en la versión de prueba de entrenamiento a una nueva esquina sin liberación y coloque el objeto a seis centímetros de cada muro de esa esquina con cinta adhesiva de doble cara. Repita la misma grabación de vídeo de los ratones en el área durante 10 minutos, como se describió anteriormente. Por último, para realizar la novedosa tarea de reconocimiento de objetos NORT, reemplace el objeto que no se movió durante el OLT por un objeto novedoso y coloque el objeto novedoso a seis centímetros de las dos paredes de la esquina con cinta adhesiva de doble cara.Repita la misma grabación de vídeo de los ratones en el área durante 10 minutos, como se describió anteriormente. Durante el OLT, la memoria para la ubicación del objeto se refleja en un grupo de ratones que pasan, en promedio, significativamente más tiempo con un objeto después de que se ha movido. Esto también se puede representar como un aumento en el índice de discriminación.En el NORT, la memoria para la ubicación del objeto se refleja en un grupo de ratones que pasan, en promedio, significativamente más del 50% del tiempo de investigación con el objeto novedoso o muestran un índice de discriminación significativamente mayor que cero. La selección de objetos para los que los ratones no tienen preferencia inherente es clave. Por ejemplo, en una prueba piloto con un tamaño de muestra de cuatro, los ratones mostraron una tendencia hacia el gasto de menos del 50% del tiempo de investigación con el objeto A cuando se emparenó con el objeto B.Cuando el objeto A se utilizó entonces como el objeto novedoso en un NORT, con un tamaño de muestra mayor de 16, los ratones pasaron significativamente menos del 50% del tiempo de investigación con el objeto A.Estos datos sugieren aversión inherente al objeto A.Durante este procedimiento, Durante este procedimiento, , es importante recordar limpiar a fondo todos los objetos y arenas entre el uso.En este método, la investigación de objetos puede ser puntuada manualmente por los investigadores o utilizando software comercial. El software tiene costos iniciales más altos, pero, una vez calibrado, puede ahorrar tiempo y recursos financieros a largo plazo.

Research

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