Name: structure solution of the fluorescent protein cerulean using meshandcollect
Uploaded: 2019-03-19T13:00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect at JoVE.com

Vi takker ESRF for at levere beam tid gennem sin in-house forskningsprogram.

1. proteinekspression og -oprensning af Cerulean
Bemærk: Dette er baseret på protokollen udgivet af Lelimousin et al. 21
<ol><li>Udtrykke hans markeret Cerulean i Escherichia coli BL21 celler dyrkes ved 37 ° C i 4 L i auto inducerbar medium23 indtil OD600= 1 og derefter inkuberes natten over ved 27 ° C.</li>
	<li>Høste bakterieceller på 5.000 x g og lyse celler via ultralydbehandling (40%, 5 min, 10 s puls, 10 s pause) i 200 mL buffer består af 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl og 1 x EDTA-fri proteasehæmmere.</li>
	<li>Indlæse supernatanten på en hans-trap Ni-NTA kolonne og elueres Cerulean med 100 mM imidazol i samme buffer betingelser.</li>
	<li>Samle de lyse gule farvede fraktioner. Proteinet er uløseligt farvet, deraf de Cerulean-holdige fraktioner er let kan skelnes.</li>
	<li>Rense protein (4 mL) på en S75 kolonne i 20 mM Tris pH 8,0.</li>
	<li>Samle de lyse gule fraktioner og koncentrere protein løsningen til 15 mg/mL.</li>
</ol>2. krystallisering
<ol><li>Bruge hængende drop dampe diffusion teknik24 ved 20 ° C i Linbro plader. Fylde brøndene med 1 mL af en fældningsmiddel løsning bestående af 100 mM HEPES ved pH 6,75, 12% PEG8000 og 100 mM MgCl2. Hængende dråber koncentreret blanding 1 µL af protein til 15 mg/mL med 1 µL af fældningsmiddel løsning. Krystaller skulle vises i 24 timer.</li>
	<li>Høste krystaller opnået og overføre dem til 100 µL af en seeding buffer bestående af 0,1 M HEPES pH 6,75, 22% PLØK 8000.</li>
	<li>Slibe krystaller med en 0,1 mL væv grinder og fortyndes i såning buffer (forholdet 1: 100).</li>
	<li>Fordøje en alikvot af protein-stamopløsningen (15 mg/mL) med trypsin (0,5 mg/mL i de samme buffer) for 1 h (1:10 (v/v)).</li>
	<li>Bland fordøjet protein løsning med 10% af frø-holdige buffer (v/v).</li>
	<li>Vokse krystaller (10 * 10 * 20 µm3) i 0,1 M HEPES pH 7, 14% PLØK 8000, 0,1 MgCl2 i 1-1,5 μL hængende dråber ved hjælp af metoden vapor diffusion.</li>
</ol>3. krystal montering
<ol><li>Brug en passende loop, fx en mesh loop 700 firkantede huller på 25 µm hver monteret på en RYGSØJLEN standardprøve indehaveren25. Overføre krystaller fra krystallisering drop (trin 2.6) til 1 µL af kryoprotektant løsning (godt fældningsmiddel løsningen blandet med glycerol (20% v/v endelige)).</li>
	<li>Montere protein krystal gylle på en mesh løkke ved at flytte løkke under krystaller og løfte dem ud af henlægge. Ideelt bør krystaller i størrelsesområde i 5 µm-30 µm i maksimal dimension med ingen overlapning mellem krystaller monteret i løkken.</li>
	<li>Væge off overskydende væske ved at røre ved mount hurtigt med filtrerpapir. Sediment krystallerne således at de sidder i flyet af løkken omgivet af så lidt bulk væske som muligt.</li>
	<li>Styrte mount i en unipuck fuld af flydende kvælstof. Opbevar pucken på 100 K i en egnet opbevaringsbeholder, indtil beam tid er tilgængelig.</li>
</ol>4. offline forberedelse af synkrotron eksperiment
Bemærk: Anmode om synkrotron beam tid så tidligt som muligt og følge online retningslinjerne for tilgængelige adgangstyper og på hvordan du indsender en ansøgning om en given synkrotron. ESRF retningslinjer kan findes på http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying. Hvis et medlem af en ESRF blok tildeling gruppe (pose), der kræves ikke et program for hvert specifikt projekt. I dette tilfælde bør eksperimentatorer henvende sig til deres taske ansvarlig vedrørende planlægningen af beam tid.
<ol><li>Efter forslaget er accepteret og modtager en invitation til eksperimentet, har alle deltagere komplet sikkerhedsuddannelse. Udfyld "en-formularen" (via ESRF user portal, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) med de nødvendige sikkerhedsoplysninger på prøverne. Kontakt den lokale kontaktperson for at diskutere eksperimentet. Når din en-formular er indsendt og godkendt vil det give dig eksperiment nummer og adgangskode.</li>
	<li>Oprette forbindelse til udvidede ISPyB26 (http://www.esrf.fr/) og vælger MX.</li>
	<li>Log på med eksperiment nummeret og adgangskode fra en-formular.</li>
	<li>Vælg forsendelsen | Tilføj ny og udfylde de ønskede oplysninger.</li>
	<li>Vælg Tilføj Parcel og udfyld de relevante data. Vælg Tilføj Container, vælge en unipuck og udfylde de oplysninger, der kræves, herunder positioner af prøven indehavere i pucken.</li>
</ol>5. læsning af eksemplet på en Beamline
<ol><li>I den eksperimentelle hutch, indlæse pucken i stikprøven changer (SC) dewar og opmærksom på sin holdning.</li>
	<li>Interlock eksperimentelle kabinen og Indtast kontrol hutch.</li>
	<li>Log ind på ISPyB (https://esrf.fr/). Vælg Forberede eksperiment, finde leverancen, Vælg næste og angive beamline og pucken holdning i SC.</li>
	<li>Log ind i beamline kontrol softwaren her MXCuBE227,28 med eksperimentelle nummer og adgangskode på en-formular.<ol>
<li>Tryk på Sync til at synkronisere beamline kontrol software med ISPyB-databasen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bruge beamline control software, for at montere prøveholderen på goniometer. I MXCuBE2, lige falde i hak en position i changer eksempelområde og Mountstikprøve.</li>
	<li>Drage fordel af MK3 mini kappa goniometer29 installeret på de fleste af ESRF MX beamlines, bruge MXCuBE2's "visuelle Genjustering" workflow30 til at justere i flyet af prøveholderen med rotationsaksen af goniometer.<ol>
<li>Vælg knappen centrum , derefter 3-Klik center på midten af kanten af spidsen af løkken. Gem den centrerede position ved at vælge Gem.</li>
		<li>Klik igen på knappen centrum , derefter 3-Klik center midt i starten af stilken af løkken. Gem den anden position samt ved at klikke på Gem.</li>
		<li>Vælg en af de gemte centreret positioner ved at klikke på den.</li>
		<li>Under Avanceretskal du tilføje arbejdsproces visuelle omlægning til MxCuBE2 data samling kø.</li>
		<li>Start arbejdsprocessen ved at klikke på indsamle kø.</li>
		<li>Efter arbejdsprocessen justerer prøveholderen fly med rotationsaksen af vinkelmåleren, center prøveholderen igen, denne gang et eller andet sted i midten af trådnet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Orientere prøveholderen, således at trådnet ansigt er vinkelret på X-ray stråle retning ved at dreje den omega akse ved hjælp af MXCuBE2.</li>
	<li>MXCuBE2, Vælg bjælken størrelse kræves til scanning af prøveholderen (kun for beamlines med variabel beam størrelse).<ol>
<li>Klik på blænde drop down menu i beamline control-software og vælge en værdi, f.eks. 10 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definere en maske for trådnet scanningen.<ol>
<li>Klik på trådnet værktøjsikonet i MXCuBE2. Trådnet værktøj rude vises.</li>
		<li>Tegn trådnet ved venstre at klikke og trække musen hen over det område, der indeholder krystaller på prøveholderen i visningen prøve af MXCuBE2.</li>
		<li>Gemme trådnet Klik på Plus -knappen i vinduet mesh værktøj (mesh bliver grøn).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. forberede og udføre MeshAndCollect arbejdsproces
<ol><li>Angiv beslutningen (dmin) på hvilke diffraktion billeder bør indsamles, fx her 1.8 Å i feltet opløsning af MXCuBE2.</li>
	<li>Vælg MeshAndCollect under fanen Avanceret data indsamling, tilføje det til køen og klik på indsamle den kø.</li>
	<li>Brug beamline afhængige standardparametre i vinduet parameter, som vises. I eksperimentet beskrevet her standard parametre er 0.037 s eksponeringstid pr. maskepunkt scanning, 100% transmission (førende i dette tilfælde til 4 x 1011 ph/s), 1 ° svingning pr. mesh scan line.</li>
	<li>Klik på Continue. Trådnet scan kører og diffraktion billeder indsamlet på hvert gitter punkt er analyseret og rangordnet efter diffraktion styrke med software DOZOR1. Denne proces kører i baggrunden.</li>
	<li>Efter DOZOR analyse en zonekort genereres og rækkefølge for efterfølgende delvis dataindsamlinger tildeles automatisk på grundlag af diffraktion styrke (Se figur 1). Bemærk: Resultaterne af dette trin kan også kontrolleres i ISPyB. For indsamling af delvis datasæt en ny fane med indstillinger dukker op i beamline kontrol softwaren, skal du vælge passende værdier for rotation vifte (dvs. 0,1 °), antallet af billeder (dvs. 100), eksponeringstid, opløsning, transmission, inverse beam etc. ideelt dosis for hver kile indsamles bør under Garman grænse (30 MGy). Den omtrentlige eksponeringstid pr billede er 0.037 s til 0,1 s i de beskrevne forsøgsbetingelser.</li>
	<li>Klik på Fortsæt for at starte de delvise dataindsamlinger.</li>
</ol>7. databehandling
Bemærk: De delvise datasæt er integreret med et egnet program (XDS10). Dette vil blive brugt et Python-script, der genkender hver enkelt datasæt, integrerer det og sørger for at indeksere mellem de forskellige delvise datasæt er konsekvent.
<ol><li>Åbn mappen med billederne: /data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean.</li>
	<li>Gøre en sikkerheds kopi af undermappen proces, der kan findes i den mappe, hvor de delvise datasæt er indsamlet.<ol>
<li>På Linux terminal, bruge kommandoen cp-r proces process_backup.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Naviger til mappen, processen og starte scriptet behandling.<ol>
<li>Skriv kommandoen cd proces på Linux terminal, og slå postere.</li>
		<li>Type procMultiCrystalData og tryk enter. Bemærk: Scriptet vil bede om en plads gruppe og celle parametre (disse oplysninger er valgfri), Indtast dem efter anvisningerne. Efter en sidste Brugerbekræftelse køres scriptet automatisk.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. sammenlægning af datasæt
Bemærk: Efter alle delvis datasæt er integreret flettes den bedste kombination af dem til at producere det endelige datasæt til brug i struktur beslutsomhed og raffinement. Forskellige mål for denne fusionerende proces kan være at opnå fuld fuldstændighed (stærkt anbefales), høj mangfoldighed eller den bedste data statistik (høj < I/σ(I) >, lav R-faktorer, osv.). Sidstnævnte kan undertiden være på bekostning af fuldstændighed og/eller mangfoldigheden så denne mulighed bør vælges med omhu.
<ol><li>Flette de delvise datasæt ved hjælp af programmet ccCluster14. Det bruger hierarkisk Cluster analyse (HCA) til at bestemme mulige kombinationer af isomorphous delvis datasæt ().<ol>
<li>Skriv ccCluster i Unix terminal til at åbne dens anskuelighed brugergrænseflade (GUI). Bemærk: I ccCluster GUI en dendrogram er trukket. Dette giver et forslag, som delvis datasæt bedst kan flettes baseret på isomorfi mellem dem.</li>
		<li>Klik på en node, der svarer til en værdi af omkring 0,4 på den lodrette akse. Generelt, højere værdier vil omfatte flere delvise data sæt men føre til værre fletning statistikker, som delvis datasæt vil være mindre isomorphous.</li>
		<li>Klik på Flet DATA. Den valgte klynge vil blive behandlet i baggrunden og den anslåede fusionerende statistik vises i en ny fane i GUI. Dette trin kan gentages for forskellige kombinationer af datasæt. For en god kombination af delvis datasæt fuldstændighed bør være tæt på 100%, < I/σ(I) > værdier højt (10 eller højere i den laveste opløsning shell) og R-meas31 værdier lav (omkring 5% i lav opløsning shell).</li>
	</ol>
</li>
	<li>For hver kombination, der er valgt brug den genererede input script for at fusionere delvis datasættene valgt i en enkelt mtz fil (dvs., meningsløst32).</li>
	<li>Endeligt skala og flette intensitet data i denne fil ved hjælp af en skalering program (dvs., planløse32) og som med en fil med oprindelse fra en enkelt krystal dataindsamling, bruge output for efterfølgende afvikling og struktur løsning33 .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeshAndCollect:+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines.">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328-2343 (2015).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-Protection+of+Protein+Crystals+against+Radiation+Damage+in+Electron+and+X-Ray+Diffraction.">Cryo-Protection of Protein Crystals against Radiation Damage in Electron and X-Ray Diffraction.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 241 (1300), 6-8 (1990).</li><li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography.">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).</li><li>Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography:+the+first+five+years.">Serial femtosecond crystallography: the first five years.</a> IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).</li><li>Stellato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+macromolecular+serial+crystallography+using+synchrotron+radiation.">Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (4), 204-212 (2014).</li><li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation.">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).</li><li>Coquelle, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raster-scanning+serial+protein+crystallography+using+micro-+and+nano-focused+synchrotron+beams.">Raster-scanning serial protein crystallography using micro- and nano-focused synchrotron beams.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (5), 1184-1196 (2015).</li><li>Diederichs, K., Wang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+Synchrotron+X-Ray+Crystallography+(SSX).">Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX).</a> Protein Crystallography. 1607, 239-272 (2017).</li><li>Borshchevskiy, V. I., Round, E. S., Popov, A. N., B&#252;ldt, G., Gordeliy, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-Radiation-Induced+Changes+in+Bacteriorhodopsin+Structure.">X-ray-Radiation-Induced Changes in Bacteriorhodopsin Structure.</a> Journal of Molecular Biology. 409 (5), 813-825 (2011).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS+implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xia2:+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction.">xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li><li>Monaco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+processing+of+macromolecular+crystallography+X-ray+diffraction+data+at+the+ESRF.">Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF.</a> Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).</li><li>Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+clustering+for+multiple-crystal+macromolecular+crystallography+experiments:+the+ccCluster+program.">Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844-1851 (2017).</li><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+of+synchrotron+serial+crystallographic+data+by+a+genetic+algorithm.">Merging of synchrotron serial crystallographic data by a genetic algorithm.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (9), 1026-1035 (2016).</li><li>Foadi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+procedures+for+the+optimal+selection+of+data+sets+from+multiple+crystals+in+macromolecular+crystallography.">Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (8), 1617-1632 (2013).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength+mutations+and+posttranslational+autoxidation+of+green+fluorescent+protein.">Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12501-12504 (1994).</li><li>Cubitt, A. B., Woollenweber, L. A., Heim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2:+Understanding+Structure-Function+Relationships+in+the+Aequorea+victoria+Green+Fluorescent+Protein.">Chapter 2: Understanding Structure-Function Relationships in the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein.</a> Methods in Cell Biology. 58, 19-30 (1998).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).</li><li>Lelimousin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Dynamics+in+ECFP+and+Cerulean+Control+Fluorescence+Quantum+Yield.">Intrinsic Dynamics in ECFP and Cerulean Control Fluorescence Quantum Yield.</a> Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).</li><li>Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromophore+Isomer+Stabilization+Is+Critical+to+the+Efficient+Fluorescence+of+Cyan+Fluorescent+Proteins.">Chromophore Isomer Stabilization Is Critical to the Efficient Fluorescence of Cyan Fluorescent Proteins.</a> Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).</li><li>Rhodes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Crystallography made crystal clear: a guide for users of macromolecular models. , (2006).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography.">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li><li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB:+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography.">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li><li>Gabadinho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MxCuBE+a+synchrotron+beamline+control+environment+customized+for+macromolecular+crystallography+experiments.">MxCuBE a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707 (2010).</li><li>De Santis, D., Leonard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notiziario+Neutroni+e+Luce+di+Sincrotrone.">Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone.</a> Consiglio Nazionale delle Ricerche. , (2014).</li><li>Brockhauser, S., Ravelli, R. B. G., McCarthy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+mini-&#954;+goniometer+head+in+macromolecular+crystallography+diffraction+experiments.">The use of a mini-&#954; goniometer head in macromolecular crystallography diffraction experiments.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1241-1251 (2013).</li><li>Brockhauser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+workflows+in+the+design+and+implementation+of+complex+experiments+in+macromolecular+crystallography.">The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).</li><li>Diederichs, K., Karplus, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+R-factors+for+diffraction+data+analysis+in+macromolecular+crystallography.">Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography.</a> Nature Structural Biology. 4, 269 (1997).</li><li>Evans, P. R., Murshudov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+are+my+data+and+what+is+the+resolution?.">How good are my data and what is the resolution?.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).</li><li>Taylor, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+phasing.">Introduction to phasing.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Crystallographic+Model+and+Data+Quality.">Linking Crystallographic Model and Data Quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESRF+upgrade+programme+phase+II+(2015+-+2022).">ESRF upgrade programme phase II (2015 - 2022).</a> The orange book. , (2015).</li></ol>

Forfatterne har intet at videregive

Normalt afhænger succes af en MX eksperiment eksistensen af relativt stort, godt diffracting krystaller. For projekter hvor optimering fra lille krystal brusere til større krystaller mislykkes, giver MeshAndCollect en muligheden for at få en komplet diffraktion datasæt for struktur løsning via kombinationen af isomorphous delvis datasæt indsamlet fra en serie af små krystaller. Metoden er forenelig med synkrotron beamlines for MX, ideelt med en høj photon flux og en lille lysbundtets diameter, udstyret med en topmoderne diffractometer enheden og en hurtig-udlæsning detektor. På sådan en endestation, vil data collection del af sådan et eksperiment tage omkring 20 minutter, afhængig af antallet af delvise datasæt skal indsamles og antallet af krystal-holdige prøve indehavere skal analyseres.
Den vigtigste forudsætning for succes i en MeshAndCollect eksperiment er eksistensen af et tilstrækkeligt antal (mindst 50, 100 ideelt) af diffracting positioner på prøveholderen. Fra erfaring bør minimumsstørrelsen af krystaller skal analyseres omkring 5 µm i den mindste dimension. Metoden er forenelig med enhver form for standard cryo-køling kompatible prøve indehavere med de bedste resultater er opnået ved hjælp af mesh mounts, der er stive og lige.
På ESRF, er MeshAndCollect implementeret på en brugervenlig måde i en Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en) arbejdsproces30 tilgængelige fra MXCuBE2 beamline control software. En stor fordel ved MeshAndCollect i forhold til andre SX metoder er at de indsamlede data kan behandles af standard programmer og automatiseret rørledninger anvendes til enkelt krystal MX.
Som eksemplet viser, MeshAndCollect er meget let at anvende og fører til en række delvis diffraktion datasæt, normalt indsamlet fra små krystaller, som kan flettes til at producere en komplet datasæt til brug i struktur løsning. Desuden har MeshAndCollect potentiale til at åbne prøveudtagning rum for Proteinkrystallografi da det giver en måde at indsamle brugbare data fra krystallisering forsøg hvor det sidste optimering skridt, produktion af store krystaller, er mislykket.
I lyset af de aktuelle udvikling i retning af lysere X-ray kilder (f.eks. meget genial kilde (EBS) projekt/ESRF35) er det overskuelig, på grund af øget strålingsskader, typen af multi krystal dataindsamling lettet af MeshAndCollect vil blive standardmetode til indsamling af data, snarere end en undtagelse-som det er tilfældet - på synkrotron-baserede MX beamlines.

Makromolekylære røntgenkrystallografi (MX) er langt den mest anvendte metode til at opnå atomare opløsning indsigt i de tre-dimensionelle strukturer af biologiske makromolekyler. En stor flaskehalse er imidlertid kravet om relativt stort, godt diffracting krystaller.
Ofte, og især når crystallizing Membranproteiner, kun meget små krystaller af nogle få mikrometer i den største dimension kan opnås. Strålingsskader virkninger grænse for løsningen af en komplet diffraktion data angivet der kan indsamles fra en enkelt micro krystal2, og meget ofte, det er nødvendigt at forbedre signal-støj-forholdet og dermed datasæt beslutning, ved at flette flere delvis diffraktion datasæt fra forskellige, men isomorfe krystaller. Stigninger i fluxtæthed af X-ray bjælker på synkrotron kilder og andre steder (f.eks. røntgen fri-elektron lasere (X-FELs)), har betydet, at nyttige delvis diffraktion datasæt kan indsamles fra selv meget små krystaller af biologiske makromolekyler. Dette, til gengæld har ført til udviklingen af nye teknikker til indsamling og sammenlægning af delvis diffraktion datasæt indsamlet fra mange forskellige krystaller for at producere et komplet datasæt for struktur løsning. Disse teknikker er almindeligvis omtales som seriel krystallografi (SX)3,4,5,6,7,8. En prototypiske eksempel på SX er brugen af injektor enheder til at indføre en smal strøm af en krystal gylle i X-ray stråle3,4,5. Et diffraktionsmønster registreres, hver gang en krystal er udsat for røntgenstråler fører til samlingen, fra mange tusinder af enkelte krystaller af 'stadig' diffraktion billeder, information, som derefter flettes til at producere en komplet datasæt. En stor ulempe ved denne type af seriel dataindsamling er imidlertid, at behandling af still-billeder kan være problematisk. Datakvaliteten er betydeligt forbedret, hvis krystaller kan roteres og/eller flere diffraktion billeder er indsamlet fra den samme krystal under seriel krystallografi eksperimenter6.
MeshAndCollect1 blev udviklet med formålet at kombinere SX med 'standard' MX rotation dataindsamling og giver mulighed for i en automatisk måde, eksperimentatorer at indsamle delvis diffraktion datasæt fra talrige krystaller af samme makromolekylære målet monteret på de samme eller forskellige prøve indehavere. En komplet diffraktion datasæt er derefter fremstillet ved en sammenlægning af de mest isomorphous af de delvise datasæt indsamlet. MeshAndCollect er kompatibel med enhver state-of-the-art synkrotron X-ray beamline for MX (ideelt en indsættelse enhed facilitet med en relativt lille (20 µm eller mindre) stråle størrelse på prøve position). Ud over udarbejdelse af komplette datasæt fra en serie af små, godt diffracting krystaller er metoden også meget velegnet til den indledende eksperimentelle vurdering af diffraktion kvalitet af mikro-krystaller og for behandling af uigennemsigtige prøver, f.eks. i meso vokset microcrystals membran proteiner9.
I starten af en MeshAndCollect eksperiment fastlægges holdninger i to dimensioner, hver af de mange crystal indeholdt i en enkelt prøveholderen ved hjælp af en lav dosis X-ray scanning. De diffraktion billeder indsamlet under denne scanning analyseres automatisk af programmet DOZOR1, der sorterer holdninger af krystaller på prøveholderen efter deres respektive diffraktion styrke. Holdninger til indsamling af delvis datasæt tildeles automatisk på grundlag af en diffraktion styrke cut-off, og i det sidste trin, små kiler af diffraktion data, typisk ±5 ° rotation, er indsamlet fra hver valgte position. Erfaringen har vist, at denne rotation rækkevidde giver en tilstrækkelig mængde af refleksioner pr. krystal for delvis datasæt skalering formål, mens på samme tid reducere mulige krystal centrering spørgsmål og chancen for at afsløre flere krystaller i en især overfyldt støtte1. Enkelte diffraktion data kiler (delvis datasæt) er derefter behandlet enten manuelt eller ved hjælp af edb rørledninger10,11,12,13. For downstream struktur bestemmelse er det så nødvendigt at finde den bedste kombination af delvis datasæt til at være flettede14,15,16 , hvorefter den resulterende komplet datasæt kan behandles på samme måde med en oprindelse fra en enkelt krystal eksperiment.
Som et eksempel på MeshAndCollect i praksis præsenterer vi her løsningen af krystalstruktur af Cerulean Cyan fluorescerende proteiner (FFP) ved hjælp af en diffraktion datasæt konstrueret ud fra kombinationen af delvis datasæt indsamlet fra en række microcrystals monteret på den samme prøve støtte. Cerulean har været manipuleret fra grøn fluorescerende proteiner (NGL) fra vandmænd Aequorea victoria17, hvis fluorescerende farvelegeme dannes autocatalytically fra cyclisation af tre på hinanden følgende aminosyrerester. Cerulean er fremstillet af normal god landbrugspraksis muterer de første og anden rester af farvelegeme, en Serin og en tyrosin, threonin (S65T) og tryptophan (Y66W) henholdsvis og tilpasse farvelegeme miljø med yderligere mutationer (Y145A, N146I, H148D, M153T og V163A) til at producere en betydelig, men suboptimal fluorescens niveau af QY = 0,4918,19,20. Cerulean suboptimal fluorescerende egenskaber er blevet foreslået til at være forbundet med komplekse protein dynamics involverer den ufuldkomne stabilisering af en af de elleve β-tråde af protein21 og overnatning for to forskellige farvelegeme isomerer afhængigt af pH og bestråling betingelser22. Vi valgte at arbejde med Cerulean som en model protein illustrerer brugen af MeshAndCollect-protokollen grund til den forholdsvis lette tuning krystal størrelse afhængig af krystalliseringen. Cerulean struktur er meget lig at dens overordnede protein normal god landbrugspraksis, som det består af en β-tønde dannet af elleve β-tråde omkring en α-helix, som bærer farvelegeme.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline</td>
			<td>ESRF ID 23-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization plates XDXm with sealant</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA- free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4,693,159,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Life Technologies Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals Prolabo</td>
			<td>14388.29T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>10-110-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-trap HP</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13452-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroMeshes 700/25</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU:&#160;M3-L18SP-25L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5413-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator vibra cell 75/15</td>
			<td>SONICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 10/300 -GL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5174-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9201-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unipuck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Solange Delageni&#232;re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&#233;phanie Veyrier, Jos&#233; Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Se&#225;n M. McSweeney, St&#233;phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186&#8211;3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aimless</td>
			<td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td>
			<td>Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204&#8211;1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ccCluster</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844&#8211;1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOZOR</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Bourenkov and Popov, unpublished</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeshAndCollect workflow</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328&#8211;2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXCuBE2</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700&#8211;707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24&#8211;226 (2014).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>Max-Planck-Institut f&#252;r Medizinische Forschung</td>
			<td>Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125&#8211;132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structure solution of the fluorescent protein cerulean using meshandcollect

Røntgenkrystallografi er stor teknik, der anvendes til at opnå høj opløsning oplysninger om de 3-dimensionelle strukturer af biologiske makromolekyler. Indtil for nylig, har et væsentligt krav været tilgængeligheden af relativt stort, godt diffracting krystaller, der er ofte en udfordring at opnå. Dog, fremkomsten af serielle krystallografi og en renæssance i multi krystal dataindsamlingsmetoder har betydet, at tilgængeligheden af store krystaller behøver ikke længere være en begrænsende faktor. Her, illustrere vi anvendelsen af den automatiserede MeshAndCollect protokol, som først identificerer placeringen af mange små krystaller monteret på samme prøveholderen og derefter dirigerer samling fra krystaller af en serie af delvis diffraktion datasæt for efterfølgende fletning og brug i struktur bestemmelse. MeshAndCollect kan anvendes til enhver form for mikro-krystaller, selv om svagt diffracting. Som et eksempel præsenterer vi her teknik til at løse krystalstruktur af Cyan fluorescerende proteiner (FFP) Cerulean.

MeshAndCollect, som gennemføres i MXCuBE2 (Se figur 1A), blev brugt til indsamling af delvis diffraktion datasæt fra små krystaller af Cerulean ligger på samme prøveholderen hvor visuelle identifikation af krystaller var svært. Gennemgå prøveholderen, vi trak et gitter over midten af meshloop (Se figur 1B) og baseret på DOZOR score varme kort (Se tal 1 c, 1 D) 85 delvis diffraktion datasæt blev automatisk indsamlet. Disse var individuelt integreret derefter fusionerede (se ovenfor) for at producere et datasæt med 99,8% fuldstændighed dmin = 1.7Å (Se tabel 1). Halv-sæt korrelation (CC1/2)34 i den højeste opløsning shell var 60% (= 4,7). Som forventet, kunne krystalstruktur af Cerulean løses ligefrem af molekylære udskiftning33 ved hjælp af de data, der genereres. Efter raffinement opnåede vi en Rarbejde på 22,8% og en Rgratis 25,4%. Superpositionsprincippet med den tidligere beregnede struktur (FBF post 2WSO21) viser en global rmsd på Cα positioner af 0,1 Å. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Statistik over de flettede data, der</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Klyngedannelse tærskel</td>
			<td>0,35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antal delvise datasæt</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plads gruppe</td>
			<td>P212121</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enhed celle (a, b, c)</td>
			<td>50.98, 62.76, 69,50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Opløsning vifte</td>
			<td>46.58-1.70 (1.73-1.70)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmerge (alle jeg + og -)</td>
			<td>0.133 (0.743)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas (alle jeg + & jeg-)</td>
			<td>0.142 (0.813)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim (alle jeg + & jeg-)</td>
			<td>0.047 (0.318)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Observationer i alt/unikke</td>
			<td>220693/25129</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mean((I)/SD(I))</td>
			<td>13.8 (4.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MN(I) halv-sæt korrelation CC(1/2)</td>
			<td>0.994 (0.602)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fuldstændighed</td>
			<td>99,8 (99,5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mangfoldighed</td>
			<td>8.8 (6.5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Endelige Rkrystal
</td>
			<td>22,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Endelige Rgratis
</td>
			<td>25,4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Statistik af de flettede data, der angiver den høje kvalitet af dataene, der indsamles.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58594/58594fig1.jpg"> Figur 1: ved hjælp af MeshAndCollect for at indsamle en række delvis datasæt fra en serie af små krystaller indeholdt i samme prøveholderen. A) brugergrænsefladen i MXCuBE2. Den grønne ovale over feltet på aksen viewer viser værktøjet gitter. B) med det trukket et gitter på billedet af prøveholderen i feltet liv billede. C) varme kort over DOZOR scores. D) eksempel på en diffraktion billede. E) Dendrogram efter hierarkisk cluster analyse. Datasæt i rød blev brugt til fletning. F) overordnede struktur af Cerulean. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58594/58594fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect at JoVE.com

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Vi præsenterer MeshAndCollect-protokollen til at opnå en komplet diffraktion datasæt, til brug i efterfølgende struktur bestemmelse, der består af delvis diffraktion datasæt indsamlet fra mange små krystaller af fluorescerende proteiner Cerulean.

Struktur løsning af fluorescerende proteiner Cerulean ved hjælp af MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Den automatiserede MeshAndCollect-protokol blev udviklet til at kombinere seriel krystallografi med standardrotationsdataindsamling for at måle små krystaller fra puckprøver. Metoden identificerer først placeringen af krystaller monteret på den samme prøveholder for derefter at dirigere indsamlingen af deldatasæt, som efterfølgende vil blive flettet sammen og anvendt til opløsningen af konstruktionen. MeshAndCollect er overbevisende, da det giver dig mulighed for at gøre eksperimenter hurtigt og med samme opsætning, struktur løsning, ligand screening, og alt det med bittesmå krystaller.Metoden er kompatibel med synchrotron beamlines VMX ideelt udstyret med høj foton flex, en lille strålediameter og en hurtig genladningsdetektor. Først skal du oprette forbindelse til det udvidede informationssystem for proteinkrystallografi beamline database og vælg MX.Log ind med eksperimentnummer og adgangskode fra A form. Vælg derefter Leverance Tilføj ny, og udfyld de ønskede oplysninger.Vælg Tilføj delvis, og udfyld de relevante data. Vælg Tilføj container, vælg en SC3 puck, og udfyld de nødvendige oplysninger, herunder placeringen af prøveholderne i pucken. I den eksperimentelle hutch, indlæse pucken i prøven skifteren doer og bemærk dens position.Log derefter ind på informationssystemet for proteinkrystalleringsstrålelinjens database. Vælg Forbered eksperiment, find forsendelsen, vælg Næste, og angiv strålelinjens og puckpositionen i eksempelskifteren. Log ind på beamline kontrol software med eksperimentelle nummer og adgangskode på A-formularen.Tryk på Synkroniser for at synkronisere beamline-kontrolsoftwaren med informationssystemet til proteinkrystalleringsstrålelines database. Brug beamline-styresoftwaren til at montere prøveholderen på goniometeret. Højreklik derefter på en placering i eksempelskifterområdet, og vælg Monter eksempel.Vælg midterknappen, og klik derefter tre klik midt på midten af kanten af spidsen af løkken. Gem den centreret position ved at vælge Gem. Føj arbejdsprocesvisoreorieringen til dataindsamlingskøen under Avanceret.Start derefter arbejdsprocessen ved at klikke på Indsaml kø. Vælg derefter en af de gemte centerpositioner ved at klikke på den. Klik igen på midterknappen, og derefter en tre-klik center på midten af starten af stilken af løkken.Gem den anden position ved at klikke på Gem. Og klik derefter på Fortsæt. Når arbejdsprocessen justerer prøveholderens plan med goniometerets rotationsakse, skal prøveholderen centreres igen et sted midt i masken.Prøveholderen orienteres således, at maskens ansigt er vinkelret på røntgenstråleretningen ved at dreje omega-aksen ved hjælp af strålestyringssoftwaren. I beamline kontrol software, skal du klikke på Aperture rullemenuen og vælge en værdi. Klik derefter på maskeværktøjsikonet for at få maskeværktøjsvinduet frem.I eksempelvisningen af beamline-styresoftwaren skal du trække masken ved at klikke i venstre side og trække musen hen over det område, der indeholder krystaller på prøveholderen. For at gemme masken skal du klikke på plusknappen i maskeværktøjsvinduet. I opløsningsområdet i beamline-styringssoftwaren skal du indtaste den opløsning, som diffraktionsbilleder skal indsamles med.Hvis der ikke er nogen forudgående oplysninger om krystallernes diffraktionskvalitet, anbefales en værdi mellem to og 2,5. Vælg MeshAndCollect under fanen Avanceret dataindsamling. Føj den til køen, og klik på Indsaml køen.Brug de strålelinjeafhængige standardparametre i parametervinduet. I det eksperiment, der er beskrevet her, er standardparametre 0,037 sekunders eksponeringstid pr. meshscanningspunkt, 100 %transmission og en grads svingning pr. maskescanningslinje. Klik på Fortsæt.Masken scanning kører og diffraktion billeder indsamlet på hvert gitter punkt analyseres og rangeret i henhold til diffraktion styrke med softwaren Dozer. Efter Dozer-analysen genereres der et varmekort, og rækkefølgen for efterfølgende delvise dataindsamlinger tildeles automatisk baseret på diffraktionsstyrke. Klik til sidst på Fortsæt for at starte de delvise dataindsamlinger.MeshAndCollect som implementeret i MXCuBE blev brugt til indsamling af delvise diffraktionsdatasæt fra små krystaller af Cerulean placeret på den samme prøveholder, hvor visuel identifikation af krystaller var vanskelig. For at screene prøveholderen blev der trukket et gitter over midten af meshløkken, og baseret på Dozer-scorevarmekortet blev der automatisk indsamlet 85 delvise diffraktionsdatasæt. Disse blev individuelt integreret derefter fusioneret til at producere et datasæt med 99,8% fuldstændighed ved en opløsning på 1,7 angstroms.Som forventet kunne Ceruleans krystalstruktur løses ved molekylær erstatning ved hjælp af det genererede datasæt. Efter raffinement, en R arbejde på 22,8% og en R fri for 25,4% blev opnået. Super position af den tidligere bestemte struktur viser en global RMSD på c-alpha positioner på 0,1 angstroms.For projekter, hvor optimeringen af krystalvækstfasen, giver MeshAndCollect mulighed for at opnå et komplet datasæt baseret på kombinationen af disse amorfe delvise datasæt fra mindre krystaller. Denne teknik banede vejen for strukturelle biologer til at løse en struktur fra dele prøve, hvor kun et par tiendedele af mikrokrystaller ikke kunne produceres.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Undersøgelse Proteinsekvens-struktur-dynamik Forhold med Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitet rensning af grønkorn Translocon Protein komplekser ved hjælp af tryk på Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturelle undersøgelser af makromolekyler i løsning ved hjælp af små vinkel X-Ray spredning

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondering struktur og dynamik af Nucleosomes ved hjælp af Atomic Force mikroskopi Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposom målinger for studiet af Proton-pumpe membran enzymer ved hjælp af elektrokemi og fluorescerende mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering af SUMO-modificerede proteiner ved hjælp af fluorescerende Sumo-diffuse Rings proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Vurdering af cellulær oxidation ved hjælp af et subcellulært rum-specifikt redox-følsomt grønt fluorescerende protein

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...