Name: structure solution of the fluorescent protein cerulean using meshandcollect
Uploaded: 2019-03-19T13:00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect at JoVE.com

Nous remercions l’ESRF pour fournir des temps de faisceau par le biais de son programme de recherche interne.

1. expression et Purification de Cerulean
Remarque : Ceci est basé sur le protocole publié par Lelimousin et al. 21
<ol><li>Exprimer son étiquette Cerulean chez Escherichia coli BL21 cellules cultivées à 37 ° C dans 4 L d’auto inductible moyen23 jusqu'à OD600= 1 et puis incuber pendant la nuit à 27 ° C.</li>
	<li>Récolter les cellules bactériennes à 5 000 x g et lyser la cellules par sonication (40 %, 5 min, 10 s pulse®, 10 pause s) dans 200 mL de tampon composé de 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl et 1 x sans EDTA des inhibiteurs de protéase.</li>
	<li>Charger le surnageant sur une colonne de son siphon-Ni-NTA et éluer Cerulean avec imidazole de 100 mM dans les mêmes conditions de tampon.</li>
	<li>Mettre en commun les fractions de couleurs jaunes vives. La protéine est intrinsèquement colorée, donc les fractions contenant Cerulean sont faciles à distinguer.</li>
	<li>Purifier la protéine (4 mL) sur une colonne S75 dans 20 mM Tris pH 8.0.</li>
	<li>Mettre en commun les fractions jaunes vives et concentrer la solution de protéines à 15 mg/mL.</li>
</ol>2. la cristallisation
<ol><li>Utilisez la liste déroulante pendaison diffusion technique24 à 20 ° C en plaques de Linbro de vapeur. Remplir les puits avec 1 mL d’une solution precipitant composée de 100 mM HEPES à pH 6,75, 12 % PEG8000 et 100 mM MgCl2. Pour les gouttes suspendues, mélanger 1 µL de protéines concentrées à 15 mg/mL avec 1 µL de solution precipitant. Cristaux doit apparaître dans les 24h.</li>
	<li>Récolte les cristaux obtenus et transfert à 100 µL d’un tampon de semis composés de 0,1 M pH HEPES 6,75, 22 % PEG 8000.</li>
	<li>Moudre les cristaux avec un broyeur de tissu de 0,1 mL et diluer en semis tampon (ratio 1/100).</li>
	<li>Digérer une partie aliquote de la solution étalon de protéines (15 mg/mL) avec de la trypsine (0,5 mg/mL dans le tampon de même) pendant 1 h (01:10 (v/v)).</li>
	<li>Mélanger la solution de protéines digérées avec 10 % de semences contenant tampon (v/v).</li>
	<li>Croissance de cristaux (10 * 10 * 20 µm3) dans 0,1 M à pH 7 HEPES, 14 % PEG 8000, 0,1 MgCl2 dans pendaison de 1 à 1,5 μL gouttes à l’aide de la méthode de diffusion de vapeur.</li>
</ol>3. cristal montage
<ol><li>Utilisez une boucle appropriée, par exemple, une maille boucle 700 des trous carrés de 25 µm de chaque montée sur une colonne vertébrale échantillon standard titulaire25. Transférer des cristaux dans la liste déroulante de cristallisation (étape 2.6) dans 1 µL de solution cryoprotecteur (la solution bien precipitant mélangée avec du glycérol (20 % v/v final)).</li>
	<li>Monter le lisier de cristal de protéine sur une boucle de maille en déplaçant la boucle sous les cristaux et leur levée hors de la goutte. Idéalement, les cristaux devraient être dans la gamme de taille de 5 µm à 30 µm de plus grande dimension sans chevauchement entre les cristaux, monté dans la boucle.</li>
	<li>Mèche au large de l’excès de liquide en touchant la monture rapidement avec du papier filtre. Sédiments les cristaux pour qu’ils siègent dans le plan de la boucle entourée des liquides en vrac aussi peu que possible.</li>
	<li>Plonger la monture dans un unipuck plein d’azote liquide. Conserver le palet à 100 K dans un récipient de stockage approprié jusqu'à temps de faisceau est disponible.</li>
</ol>4. hors ligne préparation de l’expérience de rayonnement synchrotron
Remarque : Demander des temps de faisceau de rayonnement synchrotron dès que possible et suivre les instructions en ligne pour les types d’accès disponibles et sur la façon de présenter une demande pour un synchrotron donnée. Les directives de l’ESRF peuvent être trouvés à http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying. Si un membre de groupe de répartition pour un bloc ESRF (sac), une demande pour chaque projet spécifique n’est pas nécessaire. Dans ce cas les expérimentateurs devraient aborder leur sac de fond concernant la planification des temps de faisceau.
<ol><li>Une fois la proposition est acceptée et reçoit une invitation pour l’expérience, ont tous les participants toutes les formation à la sécurité. Renseignez le « A-form » (via le portail utilisateur de ESRF, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) avec les informations de sécurité requis sur les échantillons. Communiquer avec la personne-ressource locale afin de discuter de l’expérience. Une fois votre A-form est présenté et validé il vous donnera le numéro de l’expérience et le mot de passe.</li>
	<li>Connectez-vous à longue ISPyB26 (http://www.esrf.fr/) et choisissez MX.</li>
	<li>Connectez-vous avec le numéro de l’expérience et le mot de passe de l’A-form.</li>
	<li>Sélectionner "envoi" | Ajouter nouveau et remplir les informations demandées.</li>
	<li>Sélectionnez Ajouter parcelle et remplir les données pertinentes. Sélectionnez Ajouter conteneur, choisir une unipuck et renseignez les informations requises, y compris les positions des titulaires de l’échantillon dans la rondelle.</li>
</ol>5. chargement de l’échantillon sur une source de rayonnement
<ol><li>Dans la huche expérimentale, chargez la rondelle dans le changeur d’échantillon (SC) dewar et notez sa position.</li>
	<li>Verrouillage de la cabine expérimentale et entrer dans la huche de contrôle.</li>
	<li>Ouvrez une session le ISPyB (https://esrf.fr/). Sélectionnez Préparer Experiment, trouver l’envoi, sélectionnez suivant et indiquer la source de rayonnement et de la position de la rondelle dans le MS.</li>
	<li>Connectez-vous dans le logiciel de contrôle de source de rayonnement, ici MXCuBE227,28 le nombre expérimental et le mot de passe fourni sur l’A-form.<ol>
<li>Appuyez sur Sync pour synchroniser le logiciel de contrôle de source de rayonnement avec la base de données ISPyB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilisez le logiciel de contrôle de source de rayonnement, pour monter le porte-échantillon sur le goniomètre. Dans MXCuBE2, faites un clic droit sur un emplacement dans le quartier de changeur d’échantillon et sélectionnez Mont échantillon.</li>
	<li>Profitant de la MK3 mini-kappa goniomètre29 installé dans la plupart de l’ESRF MX faisceaux, utiliser « visual réalignement » workflow30 de MXCuBE2 pour aligner le plan du porte-échantillon et avec l’axe de rotation du goniomètre.<ol>
<li>Sélectionnez le bouton central , puis cliquez sur-3 centre sur le milieu du bord de l’extrémité de la boucle. Enregistrer la position centrée, sélectionnez enregistrer.</li>
		<li>Cliquez de nouveau sur le bouton central , puis cliquez sur-3 centre au milieu du début de la tige de la boucle. Enregistrer la deuxième position aussi bien en cliquant sur enregistrer.</li>
		<li>Sélectionnez une des positions enregistrées centrées en cliquant dessus.</li>
		<li>Sous options avancées, ajouter le flux de travail Visual réorientation à la file d’attente de collecte de données MxCuBE2.</li>
		<li>Lancement du flux de travail en cliquant sur recueillir file d’attente.</li>
		<li>Après que le flux de travail s’aligne le plan du porte-échantillon et avec l’axe de rotation du goniomètre, centre le porte-échantillon à nouveau, cette fois quelque part au milieu de la maille.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Orienter le porte-échantillon afin que le visage de la maille est perpendiculaire à la direction de faisceau de rayons x en tournant l’axe oméga à l’aide de MXCuBE2.</li>
	<li>Dans MXCuBE2, sélectionnez la taille de faisceau requise pour la numérisation du porte-échantillon (uniquement pour les faisceaux de lumière avec la taille de faisceau variable).<ol>
<li>Cliquez sur le menu dans le logiciel de contrôle de source de rayonnement déroulant ouverture et sélectionnez une valeur, par exemple, 10 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Définir un maillage pour le scan de la maille.<ol>
<li>Cliquez sur l’icône d’outil de maille en MXCuBE2. La fenêtre d’outil de maillage apparaîtra.</li>
		<li>Dans l’exemple de vue de MXCuBE2, tirer la maille par clic gauche et glisser la souris sur la zone contenant des cristaux sur le porte-échantillon.</li>
		<li>Pour enregistrer le maillage cliquez sur le bouton Plus dans la fenêtre outil de maillage (mesh devient vert).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. préparer et exécuter le flux de travail MeshAndCollect
<ol><li>Dans le domaine de la résolution de MXCuBE2, saisissez la résolution (dmin) à laquelle diffraction images devraient être collectées, par exemple, ici 1,8 Å.</li>
	<li>Sélectionnez MeshAndCollect dans l’onglet options avancées de collecte données, ajouter à la file d’attente et cliquez sur le recueillir la file d’attente.</li>
	<li>Dans la fenêtre de paramètre qui s’affiche, utilisez les paramètres de charge par défaut beamline. Dans l’expérience décrite ici par défaut les paramètres sont temps d’exposition 0.037 s par point de scan de maille, 100 % de transmission (qui dans ce cas de 4 x 1011 ph/s), oscillation de 1 ° par la ligne de balayage de maille.</li>
	<li>Cliquez sur CDEBOUCHES. L’analyse de la maille s’exécute et les images de diffraction recueillis à chaque point de grille sont analysés et classés d’après la force de diffraction avec le logiciel DOZOR1. Ce processus s’exécute en arrière-plan.</li>
	<li>Après l’analyse DOZOR une carte de chaleur est générée et l’ordre pour les collections de données partielles ultérieures est assigné automatiquement en fonction à l’effectif de diffraction (voir Figure 1). Remarque : Les résultats de cette étape peuvent également être inspectés dans ISPyB. Pour la collection d’ensembles de données partiels, qu'un nouvel onglet avec les paramètres apparaît dans le logiciel de contrôle de source de rayonnement, sélectionnez les valeurs appropriées pour le nombre d’images (i.e., 100), temps d’exposition, résolution, gamme de rotation (c'est-à-dire 0,1 °), transmission, faisceau inverse etc. idéalement la dose pour chaque cale à prélever doit être inférieure à la limite de Garman (30 MGy). Le temps d’exposition approximative par image est 0,037 s à 0,1 s dans les conditions expérimentales décrites.</li>
	<li>Cliquez sur continuer pour lancer des collections de données partielles.</li>
</ol>7. traitement des données
Remarque : Les ensembles de données partiels sont intégrés avec un logiciel adapté (XDS10). Pour cela un script Python sera utilisé qui reconnaît chaque ensemble de données individuel, intègre et s’assure que l’indexation entre les différents ensembles de données partielles est conforme.
<ol><li>Ouvrez le dossier contenant les images : /data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean.</li>
	<li>Faites une copie de sécurité du sous-dossier processus que l'on retrouve dans le dossier où les ensembles de données partiels sont collectées.<ol>
<li>Sur le terminal Linux, utilisez la commande cp-r processus process_backup.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Naviguez dans le dossier de processus et de lancer le script de traitement.<ol>
<li>Sur le terminal Linux, tapez la commande cd processus et appuyez sur entrée.</li>
		<li>Type procMultiCrystalData et appuyez sur entrée. Remarque : Le script vous demandera un groupe d’espace et paramètres de la maille (cette information est facultative), entrez ceux selon les instructions. Après une dernière confirmation à l’utilisateur, le script sera exécuté automatiquement.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. fusion d’ensembles de données
Remarque : Après l’intégration de tous les ensembles de données partiels sont la meilleure combinaison d’eux sont fusionnés pour produire l’ensemble final de données devant servir à déterminer la structure et le raffinement. Différents objectifs de ce processus de fusion peuvent être d’obtenir la pleine intégralité (fortement recommandé), multiplicité élevée ou les meilleures données statistiques (haut < valeur >, facteurs R faibles, etc.). Ce dernier peut parfois être au détriment de la multiplicité d’exhaustivité et/ou donc cette option doit être choisie avec soin.
<ol><li>Fusionner les ensembles de données partielles à l’aide du programme ccCluster14. Il utilise l’analyse hiérarchique de Cluster (HCA) pour déterminer les combinaisons possibles des ensembles de données partiels isomorphes ().<ol>
<li>Tapez ccCluster dans le terminal Unix pour ouvrir son interface utilisateur graphique (GUI). Note : Dans l’interface graphique de ccCluster un dendrogramme est attiré. Cela donne une suggestion quant aux ensembles de données partiels pourraient mieux fusionner issue d’isomorphisme entre eux.</li>
		<li>Cliquez sur un nœud qui correspond à une valeur d’environ 0,4 sur l’axe vertical. En général, des valeurs plus élevées comprendra des données plus partielles ensembles mais conduisent en pis fusion statistique, comme des ensembles de données partiels sera moins isomorphes.</li>
		<li>Cliquez sur fusionner les données. Les modules choisis seront traitées dans le fond et les statistiques qui fusionnent estimés seront affiche dans un nouvel onglet dans l’interface GUI. Cette étape peut être répétée pour différentes combinaisons d’ensembles de données. Pour une bonne combinaison d’ensembles de données partiels l’intégralité doit être proche de 100 %, la valeur < > valeurs élevées (10 ou plus dans la coquille de résolution plus faible) et les valeurs de31 R-ame faible (environ 5 % dans la couche basse résolution).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour chaque combinaison sélectionnée, utilisez le script d’entrée généré pour fusionner les ensembles de données partiels choisis dans un fichier unique mtz (c.-à-d., inutile de32).</li>
	<li>Définitivement à l’échelle et fusionner les données d’intensité dans ce fichier à l’aide d’un programme de mise à l’échelle (c.-à-d. sans but32) et, comme avec un fichier provenant d’une collection de données d’un cristal unique, utilisez la sortie pour élimination ultérieure et solution structure33 .</li>
</ol>

<ol>
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B. G., McCarthy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+mini-&#954;+goniometer+head+in+macromolecular+crystallography+diffraction+experiments.">The use of a mini-&#954; goniometer head in macromolecular crystallography diffraction experiments.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1241-1251 (2013).</li><li>Brockhauser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+workflows+in+the+design+and+implementation+of+complex+experiments+in+macromolecular+crystallography.">The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).</li><li>Diederichs, K., Karplus, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+R-factors+for+diffraction+data+analysis+in+macromolecular+crystallography.">Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography.</a> Nature Structural Biology. 4, 269 (1997).</li><li>Evans, P. R., Murshudov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+are+my+data+and+what+is+the+resolution?.">How good are my data and what is the resolution?.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).</li><li>Taylor, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+phasing.">Introduction to phasing.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Crystallographic+Model+and+Data+Quality.">Linking Crystallographic Model and Data Quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESRF+upgrade+programme+phase+II+(2015+-+2022).">ESRF upgrade programme phase II (2015 - 2022).</a> The orange book. , (2015).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Le succès d’une expérience de MX dépend habituellement de l’existence de relativement grandes, bien diffractant cristaux. Pour les projets où l’optimisation de douches petit cristal à cristaux plus grands échoue, MeshAndCollect fournit une possibilité d’obtenir un ensemble de données complet de diffraction pour structure solution via la combinaison isomorphes partielles des ensembles de données collectées d’une série de petits cristaux. La méthode est compatible avec des faisceaux de rayonnement synchrotron pour MX, idéalement avec un flux de photons de haute et d’un petit faisceau de diamètre, équipé d’un dispositif de diffractomètre de pointe et d’un détecteur de lecture rapide. Une telle station de fin, la partie de collection de données d’une telle expérience prendra environ 20 minutes, selon le nombre d’ensembles de données partiels à prélever et le nombre de détenteurs d’échantillon cristallifères à analyser.
La plus importante condition pour le succès d’une expérience de MeshAndCollect est l’existence d’un nombre suffisant (au moins 50, 100 idéalement) des grilles des positions sur le porte-échantillon. De l’expérience, la taille minimale des cristaux à analyser doit être environ 5 µm de la plus petite dimension. La méthode est compatible avec n’importe quel standard compatible cryo-refroidissement détenteurs de l’échantillon avec les meilleurs résultats atteints à l’aide de treillis montures qui sont rigides et droites.
À l’ESRF, MeshAndCollect est implémenté de manière conviviale dans un flux de travail à la Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en)30 disponible à partir du logiciel de contrôle de source de rayonnement MXCuBE2. Un avantage majeur de MeshAndCollect par rapport aux autres méthodes SX que les données recueillies peuvent être traitées par des programmes standards et automatisée des pipelines utilisés pour MX monocristal.
Comme le montre notre exemple, MeshAndCollect est très facile à appliquer et conduit à une série d’ensembles de données de diffraction partielle, provenant généralement de petits cristaux, qui peut être fusionnés pour produire un ensemble complet de données devant servir à la solution de la structure. Par ailleurs, MeshAndCollect a le potentiel d’ouvrir l’espace de l’échantillonnage de cristallographie des protéines car il fournit un moyen de recueillir des données utiles provenant d’essais de cristallisation où la dernière étape de l’optimisation, la production de gros cristaux, est infructueuse.
À la lumière de l’évolution actuelle vers les sources de rayons x plus lumineux (p. ex., Source extrêmement brillante (EBS) projet/ESRF35), il est prévisible que, en raison des dommages de rayonnement accru, le type de collecte de données multi-cristal facilitée par MeshAndCollect deviendra la méthode standard de collecte de données, plutôt qu’une exception – comme c’est actuellement le cas - à faisceaux de MX axés sur le rayonnement synchrotron.

Cristallographie de rayon x macromoléculaires (MX) est, de loin, la méthode la plus utilisée pour gagner la perspicacité de résolution atomique dans la structure tridimensionnelle de macromolécules biologiques. Toutefois, un grands goulets d’étranglement est la condition pour les cristaux assez grandes, bien diffractants.
Souvent, en particulier lorsque la cristallisation des protéines membranaires, seulement très petits cristaux de quelques microns dans la plus grande dimension peut être obtenu. Radiolésions effets limite la résolution d’une données de diffraction complets qui peut être collecté d’un monocristal micro2et très souvent, il est nécessaire d’améliorer le rapport signal sur bruit et donc données Réglez la résolution, par la fusion de plusieurs ensembles de données de diffraction partielle de cristaux différents, mais isomorphe. L’augmentation de densité de flux de faisceaux de rayons x à des sources de rayonnement synchrotron et ailleurs (p. ex. électron libre aux rayons x (X-FELs) des lasers), signifié que les ensembles de données de diffraction partielle utile peuvent être recueillis de même de très petits cristaux biologiques macromolécules. Cela, à son tour, a conduit au développement de nouvelles techniques pour la collecte et la fusion d’ensembles de données de diffraction partielle provenant de nombreux différents cristaux afin de produire un ensemble de données complet pour la solution de la structure. Ces techniques sont couramment dénommés série cristallographie (SX)3,4,5,6,7,8. Un exemple prototypique de SX est l’utilisation de dispositifs d’injecteur pour introduire un jet étroit d’une boue de cristal dans les rayons x faisceau3,4,5. Un schéma de diffraction est enregistré chaque fois qu’un cristal est exposé aux rayons x, menant à la collection de plusieurs milliers de cristaux individuels, de « still » images de diffraction, information qui est ensuite fusionnée pour produire un ensemble complet de données. Cependant, un inconvénient considérable de ce type de collecte de données en série est que le traitement d’images fixes peut être problématique. La qualité des données est considérablement améliorée si les cristaux peut être tournées ou plusieurs images de diffraction sont prélevés dans le même cristal en cristallographie série expériences6.
MeshAndCollect1 a été développé dans le but de combiner SX avec « standard » collecte de données de rotation MX et permet, de façon automatique, les expérimentateurs pour collecter des ensembles de données de diffraction partielle de nombreux cristaux de la même cible macromoléculaire monté sur les détenteurs des échantillons identiques ou différents. Un ensemble de données complet de diffraction est ensuite obtenu en fusionnant la plupart isomorphes des ensembles de données partielles recueillies. MeshAndCollect est compatible avec n’importe quel état-of-the-art synchrotron radiographie beamline pour MX (idéalement une installation de dispositif d’insertion avec un relativement petit (20 µm ou moins) faisceau de taille à la position de l’échantillon). Outre la compilation des ensembles de données complets d’une série de petits cristaux bien diffractants, la méthode est aussi très appropriée pour l’évaluation initiale expérimentale de la qualité de la diffraction de micro-cristaux et pour le traitement des échantillons opaques, par exemple, en Méso cultivé des microcristaux de membrane protéines9.
Au début d’une expérience de MeshAndCollect, les positions, en deux dimensions, de chacun des nombreux cristal contenu dans un porte-échantillon unique sont déterminées à l’aide d’une analyse aux rayons x de faible dose. Les images de diffraction, recueillies au cours de cette analyse sont analysées automatiquement par le programme DOZOR1, qui trie les positions des cristaux sur le porte-échantillon selon leur force respective de diffraction. Positions pour la collection d’ensembles de données partiels sont attribuées automatiquement en fonction sur un seuil de résistance de diffraction et, dans la dernière étape, petits coins des données de diffraction, typiquement ±5 ° de rotation, sont prélevés à chaque position choisie. L’expérience a montré que cette gamme de rotation fournit une quantité suffisante de réflexions par cristal pour l’ensemble de données partiel mise à l’échelle de fins, tandis que dans le même temps, réduire les problèmes de centrage cristal possible et la chance d’exposer les multiples cristaux dans un 1de soutien particulièrement encombré. Les cales de données de diffraction individuels (ensembles de données partiels) sont ensuite traitées soit manuellement ou à l’aide de traitement de données automatisé de canalisations10,11,12,13. Pour déterminer la structure en aval, il est alors nécessaire de trouver la meilleure combinaison d’ensembles de données partiels d’être fusionnée14,15,16 , après quoi le jeu de données complet qui en résulte peut être traité de la même manière comme un provenant d’une expérience de monocristal.
Comme un exemple de MeshAndCollect dans la pratique, nous vous présentons la solution de la structure cristalline de la protéine fluorescente Cyan (PCP) Cerulean, à l’aide d’un ensemble de données de diffraction construit à partir de la combinaison d’ensembles de données partiels recueillis à partir d’une série de microcristaux montés sur le même support de l’échantillon. Cerulean a été conçu de la protéine fluorescente verte (GFP) de la méduse Aequorea victoria17, dont chromophore fluorescent est autocatalytique formée par la cyclisation des trois résidus d’acides aminés consécutifs. Cerulean est obtenu à partir de GFP en mutation respectivement les résidus premiers et deuxième du chromophore, une sérine et une tyrosine, thréonine (S65T) et le tryptophane (Y66W) et en adaptant l’environnement chromophore avec davantage de mutations (Y145A, N146I, H148D, M153T et V163A) pour produire un niveau de fluorescence significative, mais sous-optimale de QY = 0.4918,19,20. Les propriétés fluorescentes sous-optimale de Cerulean ont été proposées pour être lié à la dynamique des protéines complexes impliquant la stabilisation de l’imparfait de l’un des onze brins-β de la protéine21 et à l’hébergement de deux différents chromophore isomères selon les conditions de pH et l’irradiation22. Nous avons choisi de travailler avec Cerulean comme protéine modèle illustrant l’utilisation du protocole MeshAndCollect raison de la relativement facilité de réglage de taille selon la cristallisation des cristaux. La structure de Cerulean est très similaire à ce que de sa protéine parent GFP, telle qu’elle est constituée d’un β-baril formé d’onze brins β entourant une hélice α, qui porte le chromophore.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline</td>
			<td>ESRF ID 23-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization plates XDXm with sealant</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA- free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4,693,159,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Life Technologies Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals Prolabo</td>
			<td>14388.29T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>10-110-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-trap HP</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13452-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroMeshes 700/25</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU:&#160;M3-L18SP-25L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5413-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator vibra cell 75/15</td>
			<td>SONICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 10/300 -GL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5174-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9201-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unipuck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Solange Delageni&#232;re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&#233;phanie Veyrier, Jos&#233; Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Se&#225;n M. McSweeney, St&#233;phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186&#8211;3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aimless</td>
			<td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td>
			<td>Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204&#8211;1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ccCluster</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844&#8211;1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOZOR</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Bourenkov and Popov, unpublished</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeshAndCollect workflow</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328&#8211;2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXCuBE2</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700&#8211;707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24&#8211;226 (2014).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>Max-Planck-Institut f&#252;r Medizinische Forschung</td>
			<td>Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125&#8211;132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structure solution of the fluorescent protein cerulean using meshandcollect

Cristallographie aux rayons x est la technique majeure utilisée pour obtenir des informations de haute résolution concernant les structures 3D des macromolécules biologiques. Jusqu'à tout récemment, un impératif majeur a été la disponibilité de relativement grandes, bien diffractant cristaux, qui sont souvent difficiles à obtenir. Cependant, l’avènement de la cristallographie de série et une renaissance dans les méthodes de collecte de données multi-cristal a signifié que la disponibilité de gros cristaux ne doivent plus être un facteur limitant. Ici, Nous illustrons l’utilisation du protocole MeshAndCollect automatisé, qui identifie tout d’abord les positions de nombreux petits cristaux, monté sur le porte-échantillon même et puis dirige la collection des cristaux d’une série d’ensembles de données de diffraction partielle pour la fusion ultérieure et servir à la détermination de la structure. MeshAndCollect peut être appliqué à n’importe quel type de micro-cristaux, même si faiblement diffractant. À titre d’exemple, nous présentons ici l’utilisation de la technique pour résoudre la structure cristalline de la Cerulean protéine fluorescente Cyan (PCP).

MeshAndCollect, tel qu’implémenté dans MXCuBE2 (voir Figure 1 a), a été utilisé pour la collection d’ensembles de données de diffraction partielle de petits cristaux de Cerulean situé sur le même porte-échantillon dans lequel l’identification visuelle des cristaux était difficile. Pour le porte-échantillon de l’écran, nous avons tiré une grille sur le centre de la meshloop (voir Figure 1 b) et basé sur le DOZOR score chaleur carte (voir Figures 1, 1D) 85 diffraction partielle des ensembles de données ont été recueillies automatiquement. Ceux-ci ont été intégrés individuellement ensuitent fusionnée (voir ci-dessus) pour produire une série de données avec exhaustivité 99,8 % à dmin = 1.7Å (cf. tableau 1). Demi-set corrélation (CC1/2)34 dans la coquille de résolution plus élevée était de 60 % (= 4,7). Comme prévu, la structure cristalline du Cerulean pourrait être carrément résolue en remplacement moléculaire de33 à l’aide de l’ensemble des données générée. Après le raffinement, nous avons obtenu un Rtravailler de 22,8 % et un Rgratuit de 25,4 %. Superposition avec la structure préalablement déterminée (APB entrée 2WSO21) montre un rmsd global sur les positionsα C de 0.1 Å. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Statistiques de l’ensemble des données fusionnée</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Seuil de clustering</td>
			<td>0,35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nombre d’ensembles de données partielle</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Groupe d’espace</td>
			<td>P212121</td>
		</tr>
<tr>
<td>Maille (a, b, c)</td>
			<td>50,98, 62,76, 69.50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gamme de résolution</td>
			<td>46,58-1,70 (1,73-1,70)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmerge (tous les je + et I-)</td>
			<td>0,133 (0,743)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas (tous les je + & j’ai-)</td>
			<td>0,142 (0,813)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim (tous je + & j’ai-)</td>
			<td>0,047 (0,318)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Observations au total/unique</td>
			<td>220693/25129</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mean((I)/SD(I))</td>
			<td>13.8 (4,7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mn(I) demi-set corrélation CC(1/2)</td>
			<td>0,994 (0,602)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exhaustivité</td>
			<td>99,8 (99,5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Multiplicité</td>
			<td>8.8 (6,5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>R finalesans cristaux
</td>
			<td>22,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Finale Rgratuit
</td>
			<td>25.4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Statistiques de l’ensemble de données fusionnée, indiquant la qualité des données collectées.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58594/58594fig1.jpg"> Figure 1 : à l’aide de MeshAndCollect de recueillir une série d’ensembles de données partiels d’une série de petits cristaux contenus dans le porte-échantillon même. A) interface utilisateur de MXCuBE2. L’ovale vert sur le corps du spectateur sur l’axe indique l’outil grille. B) avec elle, une grille est dessinée sur l’image du porte-échantillon dans le champ image de la vie. Carte de C) thermique des scores DOZOR. D) exemple d’une image de diffraction. E) dendrogramme après analyse de groupement hiérarchique. Les ensembles de données en rouge ont été utilisées pour la fusion. F) structure globale de Cerulean. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58594/58594fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Nous présentons l’utilisation du protocole MeshAndCollect pour obtenir un jeu de données complet de diffraction, devant servir à la détermination de la structure ultérieure, composée de diffraction partielle des ensembles de données provenant de nombreux petits cristaux de la protéine fluorescente Cerulean.

Solution de la structure de la protéine fluorescente Cerulean à l’aide de MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Le protocole automatisé MeshAndCollect a été développé pour combiner la cristallographie en série avec la collecte standard de données de rotation pour mesurer les petits cristaux à partir d’échantillons de rondelle. La méthode identifie d’abord la position des cristaux montés sur le même support d’échantillon pour ensuite diriger la collecte d’ensembles de données partiels qui seront ensuite fusionnés et utilisés pour la solution de la structure. MeshAndCollect est convaincant car il vous permet de faire des expériences rapidement et avec la même configuration, solution de structure, criblage ligand, et tout cela avec de minuscules cristaux.La méthode est compatible avec le VMX de synchrotron beamline idéalement équipé d’un flex photon élevé, d’un petit diamètre de faisceau et d’un détecteur de recharge rapide. Tout d’abord, connectez-vous au système d’information étendu pour la base de données de beamline de cristallographie protéique et choisissez MX.Connectez-vous avec le numéro d’expérience et le mot de passe du formulaire A. Ensuite, sélectionnez Envoi Ajouter neuf et remplir les informations demandées.Sélectionnez Ajouter partiellement et remplissez les données pertinentes. Sélectionnez Ajouter le conteneur, choisissez une rondelle SC3 et remplissez l’information requise, y compris les positions des porte-échantillons dans la rondelle. Dans le clapier expérimental, chargez la rondelle dans le faiseur de changeur d’échantillon et notez sa position.Ensuite, connectez-vous au système d’information pour la base de données de beamline de cristallographie protéique. Sélectionnez Préparer l’expérience, trouvez l’envoi, sélectionnez Suivant et indiquez la position de la ligne de faisceau et de la rondelle dans le changeur d’échantillon. Connectez-vous au logiciel de contrôle de la ligne de faisceau avec le numéro expérimental et le mot de passe fournis sur le formulaire A.Appuyez sur Synchronisez pour synchroniser le logiciel de contrôle de la ligne de faisceau avec le système d’information pour la base de données de beamline de cristallographie protéique. Utilisez le logiciel de commande de faisceau pour monter le support de l’échantillon sur le goniomètre. Cliquez ensuite à droite sur une position dans la zone de changeur d’échantillon et sélectionnez l’échantillon de montage.Sélectionnez le bouton central, puis trois clics au centre au milieu du bord de la pointe de la boucle. Enregistrez la position centrée en sélectionnant Enregistrer. Sous Advanced, ajoutez la réorientation visuelle du flux de travail à la file d’attente de collecte de données.Lancez ensuite le flux de travail en cliquant sur Collect Queue. Ensuite, sélectionnez l’une des positions maîtresses enregistrées en cliquant dessus. Cliquez à nouveau sur le bouton central, puis un centre de trois clics au milieu du début de la tige de la boucle.Enregistrez la deuxième position en cliquant sur Enregistrer. Et puis cliquez sur Continuer. Une fois que le flux de travail aligne le plan du support de l’échantillon avec l’axe de rotation du goniomètre, centrez à nouveau le support de l’échantillon quelque part au milieu du maillage.Orientez le support de l’échantillon de sorte que la face du maillage soit perpendiculaire à la direction du faisceau de rayons X en tournant l’axe omega à l’aide du logiciel de commande de la ligne de faisceau. Dans le logiciel de contrôle de la ligne de faisceau, cliquez sur le menu de dropdown Aperture et sélectionnez une valeur. Cliquez ensuite sur l’icône de l’outil maillage pour faire monter la fenêtre de l’outil en maille.Dans la vue d’échantillon du logiciel de commande de faisceau, dessinez le maillage en cliquant à gauche et en faisant glisser la souris au-dessus de la zone contenant des cristaux sur le support de l’échantillon. Pour enregistrer le maillage, cliquez sur le bouton plus dans la fenêtre de l’outil en maille. Dans le champ de résolution du logiciel de contrôle de la ligne de faisceau, entrez la résolution à laquelle les images de diffraction doivent être collectées.Si aucune information préalable n’est connue sur la qualité de diffraction des cristaux, une valeur comprise entre deux et 2,5 est recommandée. Sélectionnez MeshAndCollect dans l’onglet Collecte de données avancée. Ajoutez-le à la file d’attente et cliquez sur Recueillir la file d’attente.Dans la fenêtre de paramètre, utilisez les paramètres par défaut dépendants de la ligne de faisceau. Dans l’expérience décrite ici, les paramètres par défaut sont 0,037 seconde temps d’exposition par point de balayage en maille, transmission à 100%, et une oscillation degré par ligne de balayage maille. Cliquez sur Continuer.L’analyse de maille s’exécute et les images de diffraction recueillies à chaque point de grille sont analysées et classées en fonction de la force de diffraction avec le logiciel Dozer. Après l’analyse Dozer, une carte thermique est générée et l’ordre des collectes partielles ultérieures de données est attribué automatiquement en fonction de la force de diffraction. Enfin, cliquez sur Continuer à lancer les collectes partielles de données.MeshAndCollect tel qu’il a été mis en œuvre dans MXCuBE a été utilisé pour la collecte d’ensembles de données de diffraction partielle à partir de petits cristaux de Cerulean situés sur le même porte-échantillon dans lequel l’identification visuelle des cristaux était difficile. Pour filtrer le support de l’échantillon, une grille a été dessinée au-dessus du centre de la boucle de maille et, sur la base de la carte de chaleur du score Dozer, 85 ensembles partiels de données de diffraction ont été automatiquement collectés. Ceux-ci ont été intégrés individuellement puis fusionnés pour produire un ensemble de données avec 99,8% d’exhaustivité à une résolution de 1,7 angstroms.Comme prévu, la structure cristalline de Cerulean pourrait être résolue par remplacement moléculaire à l’aide de l’ensemble de données générées. Après raffinement, un travail de R de 22,8% et un R libre de 25,4% ont été obtenus. La super position de la structure précédemment déterminée montre un RMSD global sur des positions c-alpha de 0,1 angstroms.Pour les projets où l’optimisation de la phase de croissance du cristal, MeshAndCollect offre la possibilité d’obtenir un ensemble de données complet basé sur la combinaison de ces ensembles de données partielles amorphes obtenus à partir de cristaux plus petits. Cette technique a ouvert la voie aux biologistes structurels pour résoudre une structure à partir d’échantillons de pièces où seuls quelques dixièmes de micro cristaux ne pouvaient pas être produits.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Recherche

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